Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

Methoden
Waschfraktionen ebenfalls gesammelt. Die Elution der gebundenen Proteine erfolgte mit dem
Elutionspuffer in 6-10 Fraktionen à 1 ml. Die gesammelten Fraktionen wurden nachträglich in
der SDS-PAGE (s. 3.3) mit anschließender Silberfärbung (s. 3.4) untersucht.
Zusätzlich wurde auch die Bindung von HEK-IPSE und IgG mittels Vorinkubation der
Moleküle in Lösung untersucht. Dafür wurden HEK-IPSE und IgG im 2:1-Verhältnis
gemischt und 25 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Äquilibrierung der Ni-NTA-
Agarose (s. oben) wurde das Gemisch auf die Agarose gegeben und das Reaktionsgefäß auf 1
ml mit 1x Inkubationspuffer aufgefüllt. Es erfolgte eine Inkubation von 90 min bei
Raumtemperatur auf dem Rollenmischer. Danach wurde genauso weiterbehandelt wie oben
beschrieben.
4x Inkubationspuffer
1x Inkubationspuffer
200 mM NaH 2 PO 4 Hierfür wurde der 4x Inkubationspuffer mit
1,2 M NaCl aqua dest 1:4 verdünnt
50 mM Imidazol
pH-Einstellung auf 8,0 mit 10 M NaOH
Elutionspuffer
50 mM NaH 2 PO 4
300 mM NaCl
250 mM Imidazol
pH- Einstellung auf 8,0 mit 1M NaOH
3.9.2.3 Bindung von HEK-IPSE an IgG mittels einer Protein G-Säule
Um die Bindung von HEK-IPSE an IgG zu untersuchen wurde IgG an das Protein G einer
HiTrap Protein G Sepharose-Säule (Firma Amersham Bioscience) reversibel gebunden. Die
Bindung von IgG an das Protein G der Sepharose-Säule erfolgte an einer ÄktaPurifier-Anlage
(Firma Amersham Bioscience). Mit einer Laufgeschwindigkeit von 0,5 ml/min wurde 1 mg
IgG über die Säule gegeben und der Durchlauf in 1 ml Fraktionen gesammelt. Anschließend
wurden dann 0,22 mg HEK-IPSE mit einer Laufgeschwindigkeit von 0,5 ml/min über die
Säule gegeben und der Durchlauf ebenfalls in 1 ml Fraktionen gesammelt. Als Laufpuffer
diente jeweils PBS pH 7,4. Die Elution beider Moleküle erfolgte mit 0,1 M Glycin-HCl, pH
40