Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

Methoden
aufgezeichnet. Nichtgebundenes IgG (Durchlauf) wurde während des Laufes in 500 µl
Fraktionen gesammelt und die Konzentration im BCA-Test gemessen (s. 3.1.1). Das an HEK-
IPSE gebundene IgG wurde durch den Einsatz eines Elutionspuffers mit niedrigem pH-Wert
(0,1 M Glycin-HCl, pH 2,7) wieder gelöst (Laufgeschwindigkeit 0,5 ml/min) und ebenfalls in
500 µl Fraktionen gesammelt. Der pH-Wert wurde durch sofortige Zugabe von 1 M Tris-HCl
pH 9,0 (25 µl auf 500 µl) hochgestellt. Die Fraktionen konnten nicht im BCA-Test
ausgewertet werden, da der Neutralisationspuffer störend auf die Messung wirkte. Die
erhaltenen Fraktionen vom Durchlauf und Elution wurden nachträglich in einer SDS-PAGE
(s. 3.3) untersucht.
Kopplungspuffer (pH 8,3)
200 mM NaHCO 3
500 mM NaCl
3.9.2.2 Bindung von IgG/IgE an IPSE mittels IMAC
Bei der immobilisierten Metallaffinitätschromatographie (IMAC) werden zweiwertige Ionen
wie z. B. Ni 2+
durch, an Agarose gebundene N-Nitrilo-tri-essigsäure (NTA) über vier
Bindungsstellen chelatiert. Diese zweiwertigen Ionen haben eine hohe Affinität zu Histidin,
welches als His 6 -Tag an den rekombinant exprimierten IPSE-Molekülen vorliegt.
Für diesen Versuch wurde zuerst entweder E. coli-IPSE oder HEK-IPSE an die Ni-NTA-
Agarose gebunden. Dafür wurde 1 ml Ni-NTA-Agarose in einem 1,5 ml Reaktionsgefäßes
(Firma Eppendorf) erst mit aqua dest gewaschen und dann mit 4x Inkubationspuffer
äquilibriert, wobei die Agarose jedes Mal abzentrifugiert wurde (1000 rpm, 10 min). Der
Überstand wurde jeweils mit einer Pasteurpipette abgesogen. Die Bindung von IPSE erfolgte
dann in 1x Inkubationspuffer, wobei zuerst die Menge an IPSE auf die Ni-NTA-Agarose
gegeben wurde und anschließend mit 1x Inkubationspuffer auf 1 ml aufgefüllt wurde. Für die
Bindung wurde auf einem Rollenmischer für 90 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der
Inkubation erfolgte die Bindung von IgG oder IgE an das Festphasen-gebundene IPSE. Dafür
wurden die Immunglobuline im gleichen Verhältnis zu IPSE hinzugegeben und es wurde für
weitere 30 min inkubiert, wobei hierbei das Reaktionsgefäß nur ab und zu geschwenkt wurde.
Danach wurde die Mischung in eine Chromatographiesäule gefüllt und der Durchlauf
gesammelt. Es wurde zwei bis drei Mal mit 1x Inkubationspuffer gewaschen und die
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