Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...
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Methoden<br />
Protein L kleine Mengen eingesetzt wurden, wurde für diesen Versuch die Superdex 200 PC<br />
3.2/30 verwendet. Als Laufpuffer diente PBS pH 7,4.<br />
3.9.1.2 Komplexbildung zwischen monomerem IgE und HEK-IPSE in Lösung<br />
Für die <strong>Untersuchung</strong> <strong>der</strong> Komplexbildung von monomerem IgE und HEK-IPSE wurde<br />
zuerst nicht-aggregiertes IgE von aggregiertem IgE abgetrennt. Dafür wurden große Mengen<br />
IgE über die Tricorn-Säule Superdex 200 10/300 GL aufgetrennt und die monomeres (nicht<br />
aggregiertes) IgE enthaltenen Fraktionen gesammelt und mittels Vivaspin 500 (Firma<br />
Vivascience) eingeengt und die Proteinkonzentration (s. 3.1) bestimmt. Das monomere IgE<br />
wurde dann im 1:1- und 1:4-Verhältnis mit HEK-IPSE in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß (Firma<br />
Eppendorf) vermischt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, wobei das Reaktionsgefäß<br />
zwischendurch geschwenkt wurde. Danach wurden die Proben mit PBS pH 7,4 auf 30 µl<br />
aufgefüllt und über die Tricorn-Säule Superdex 200 PC 3.2/30 mit einer Laufgeschwindigkeit<br />
von 0,04 ml/min gegeben. Als Laufpuffer diente PBS pH 7,4. Der Durchlauf wurde in 0,1 ml<br />
Fraktionen gesammelt.<br />
3.9.2 Affinitätschromatographien<br />
Das Prinzip <strong>der</strong> Affinitätschromatographie beruht auf <strong>der</strong> spezifischen und reversiblen<br />
Bindung <strong>eines</strong> Moleküls an einen matrixgebundenen Bindungspartner. Dieses Prinzip wurde<br />
in dieser Arbeit zur <strong>Untersuchung</strong> <strong>der</strong> Bindung von Immunglobulin (IgG, IgE) an IPSE und<br />
umgekehrt eingesetzt.<br />
3.9.2.1 Bindung von IgG an HEK-IPSE mittels einer HEK-IPSE-Säule<br />
Für die Bindungsuntersuchung von IgG an HEK-IPSE wurde 1,5 mg HEK-IPSE zuerst an<br />
eine 1 ml NHS-aktivierte HiTrap Sepharose-Säule (Firma Amersham Bioscience) nach<br />
Herstellerprotokoll kovalent gekoppelt. Dafür wurde HEK-IPSE zuerst gegen den<br />
Kopplungspuffer dialysiert. Die Kopplungseffizienz betrug 98,8 %. Die anschließende<br />
Bindung von 6 mg IgG an das gekoppelte HEK-IPSE erfolgte mittels <strong>eines</strong> ÄktaPurifiers<br />
(Firma Amersham Bioscience). Es wurden 100 µl IgG mit einer Laufgeschwindigkeit von 0,2<br />
ml/min über die Säule laufen gelassen. Als Laufpuffer wurde dabei PBS pH 7,4 verwendet.<br />
Das Proteinprofil wurde während des gesamten Laufes über einen UV-Monitor bei 280 nm<br />
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