Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

Inhaltsverzeichnis
3.5 Dot-Blot ............................................................................................................................... 34
3.6 Nachweis membrangebundener Proteine............................................................................. 34
3.7 Biotinylierung von Proteinen............................................................................................... 35
3.8 Chemische Quervernetzung von Proteinen.......................................................................... 36
3.9 Chromatographische Methoden ........................................................................................... 37
3.9.1 Größenausschlusschromatographie ................................................................................. 37
3.9.1.1 Komplexbildung zwischen Immunglobulin (IgG, IgE) und HEK-IPSE
in Lösung ................................................................................................................ 37
3.9.1.2 Komplexbildung zwischen monomerem IgE und HEK-IPSE in Lösung............... 38
3.9.2 Affinitätschromatographien............................................................................................. 38
3.9.2.1 Bindung von IgG an HEK-IPSE mittels einer HEK-IPSE-Säule ........................... 38
3.9.2.2 Bindung von IgG/IgE an IPSE mittels IMAC ........................................................ 39
3.9.2.3 Bindung von HEK-IPSE an IgG mittels einer Protein G-Säule.............................. 40
3.10 Dynamische Lichtstreumessungen (DLS) mit HEK-IPSE .................................................. 41
3.11 Aufreinigung humaner basophiler Granulozyten................................................................. 42
3.11.1 Ficoll / Percoll Dichtegradienten-Zentrifugation ........................................................ 42
3.11.2 Gegenstrom-Elutriation............................................................................................... 42
3.11.3 Bestimmung der Zellzahl und Basophilenreinhheit .................................................... 43
3.11.4 Negative Selektion mit immunomagnetischen Beads................................................. 43
3.12 Stimulation der Basophilen zur IL-4-Freisetzung................................................................ 44
3.13 IL-4 ELISA .......................................................................................................................... 45
4 Ergebnisse ....................................................................................................................... 46
4.1 Untersuchung der Bindungsstärke von E. coli-IPSE an IgG, IgG-Fab und IgG-Fc im
Dot Blot .................................................................................................................................... 46
4.2 Quervernetzung von IgG durch IPSE im Sandwich-Blot .................................................... 47
4.2.1 Quervernetzung von E. coli-IPSE durch IgG .................................................................. 47
4.2.2 Quervernetzung von HEK-IPSE durch IgG .................................................................... 49
4.3 Quervernetzung von IgG-Fab durch E. coli-IPSE im Sandwich-Blot ................................. 50
4.4 Chemische Quervernetzung................................................................................................. 51
4.4.1 Bindungsuntersuchung von IgG und E. coli-IPSE .......................................................... 51
4.4.2 Chemische Quervernetzung von HEK-IPSE ................................................................... 54
2