Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

Methoden
3.9 Chromatographische Methoden
3.9.1 Größenausschlusschromatographie
Die Größenausschlusschromatographie trennt gelöste Moleküle nach ihrer Größe und basiert
auf der unterschiedlichen Permeation der Moleküle in ein poröses Trägermaterial mit
kontrollierter Porengröße. Ab einer bestimmten Größe können die Moleküle nicht mehr in die
Zwischenräume oder in die Poren des Säulenmaterials eindringen und eluieren im
Ausschlussvolumen (V 0 ). Moleküle mit kleinerer Größe durchwandern entweder die
Partikelzwischenräume oder dringen in die Poren ein. Dadurch wird ihre Elution verzögert.
Größere Moleküle werden daher eher von der Säule eluiert als kleinere Moleküle.
In dieser Arbeit wurde das Prinzip der Größenausschlusschromatographie für die
Untersuchung der Komplexbildung von Immunglobulin und HEK-IPSE in Lösung genutzt.
Für die Auftrennung der Moleküle wurden sowohl die Tricorn-Säule Superdex 200 10/300
GL als auch die Superdex 200 PC 3.2/30 (Firma Amersham Bioscience) eingesetzt. Sie
unterscheiden sich in ihrer Größe und in der Probenauftragsmenge Die Superdex 200 PC
3.2/30 wird für kleine Volumen
aus quervernetzter Agarose mit Dextran. Die Superdex 200-Säulen trennen globuläre Proteine
im Größenbereich von 10000 – 600000 Da auf. Die Säulenläufe erfolgten an einer
ÄktaPurifier-Anlage (Firma Amersham Bioscience). Das Proteinprofil wurde während der
gesamten Läufe über einen UV-Monitor bei 280 nm aufgezeichnet.
3.9.1.1 Komplexbildung zwischen Immunglobulin (IgG, IgE) und HEK-IPSE in
Lösung
Für die Untersuchung der Komplexbildung von Immunglobulin und HEK-IPSE in Lösung
wurden entweder IgG und HEK-IPSE im 1:1-Verhältnis oder IgE und HEK-IPSE im 1:1-,
1:4- oder 2:1-Verhältnis in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß (Firma Eppendorf)
zusammengemischt und für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, wobei das Reaktionsgefäß
zwischendurch geschwenkt wurde. Danach wurden die Proben mit PBS pH 7,4 auf 250 µl
aufgefüllt und mit einer Laufgeschwindigkeit von 0,4 ml/min über die Tricorn-Säule
Superdex 200 10/300 GL gegeben. Als Laufpuffer diente PBS pH 7,4. Der Durchlauf wurde
in 0,5 ml Fraktionen gesammelt und die erhaltenen Peaks in der SDS-PAGE (s 3.3) mit
nachfolgender Silberfärbung (s. 3.4) untersucht.
Als Kontrolle wurden sowohl IgG und Protein L (Firma Pierce) als auch IgE und Protein L im
1:1-Verhältnis vermischt, inkubiert und über die Superdex 200 gegeben. Da für IgE und
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