Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...
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Methoden<br />
3.8 Chemische Quervernetzung von Proteinen<br />
Für die chemische Quervernetzung von Proteinen wurden in dieser Arbeit die Reagenzien<br />
EDC [1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)carbodiimid Hydrochlorid] und Sulfo-NHS (N-<br />
Hydroxysulfosuccinimid) verwendet. EDC reagiert mit <strong>der</strong> Carboxylgruppe <strong>eines</strong> Moleküls<br />
und formt dabei ein Amin-reaktives Zwischenprodukt (O-acylisourea), welches unstabil in<br />
einer wässrigen Lösung vorliegt. Durch Zugabe von Sulfo-NHS wird das Produkt durch die<br />
Entstehung <strong>eines</strong> Amin-reaktiven Sulfo-NHS- Ester stabilisiert und es folgt die stabile<br />
Amidbindung an ein weiteres Molkül (s. Abbildung 3.1).<br />
Abbildung 3.1: Chemische Quervernetzung von Proteinen mit EDC und Sulfo-NHS [aus 5]<br />
Für die Versuche in dieser Arbeit wurde nach <strong>der</strong> Methode von Daniela M. Schulz et al.<br />
(2004) vorgegangen. Hierbei wurden die zu vernetzenden Proben in dem <strong>Aktivierung</strong>spuffer<br />
(0,1 M MES-Puffer, pH 5,5) auf eine bestimmte Konzentration verdünnt (Gesamtvolumen<br />
300 µl) und das EDC, welches kurz vorher in aqua dest gelöst wurde, in 1000 fachen<br />
Überschuss zugegeben und sofort anschließend Sulfo-NHS (vorher in aqua dest gelöst) in 500<br />
fachen Überschuss zugeführt. Nach unterschiedlichen Inkubationszeiten wurden 50 µl<br />
Aliquots abgenommen und die Reaktion mit 20 mM Glycin (Endkonzentration) gestoppt<br />
(nach Herstellerprotokoll, Pierce). Die Proben wurden anschließend entwe<strong>der</strong> in einem bereits<br />
fertigen Tris-Acetat Gel (NuPage TM 7% Tris-Acetat Gel, Invitrogen) o<strong>der</strong> in einer SDS-PAGE<br />
mit anschließen<strong>der</strong> Silberfärbung untersucht (s. 3.4).<br />
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