Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

Methoden
3.8 Chemische Quervernetzung von Proteinen
Für die chemische Quervernetzung von Proteinen wurden in dieser Arbeit die Reagenzien
EDC [1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)carbodiimid Hydrochlorid] und Sulfo-NHS (N-
Hydroxysulfosuccinimid) verwendet. EDC reagiert mit der Carboxylgruppe eines Moleküls
und formt dabei ein Amin-reaktives Zwischenprodukt (O-acylisourea), welches unstabil in
einer wässrigen Lösung vorliegt. Durch Zugabe von Sulfo-NHS wird das Produkt durch die
Entstehung eines Amin-reaktiven Sulfo-NHS- Ester stabilisiert und es folgt die stabile
Amidbindung an ein weiteres Molkül (s. Abbildung 3.1).
Abbildung 3.1: Chemische Quervernetzung von Proteinen mit EDC und Sulfo-NHS [aus 5]
Für die Versuche in dieser Arbeit wurde nach der Methode von Daniela M. Schulz et al.
(2004) vorgegangen. Hierbei wurden die zu vernetzenden Proben in dem Aktivierungspuffer
(0,1 M MES-Puffer, pH 5,5) auf eine bestimmte Konzentration verdünnt (Gesamtvolumen
300 µl) und das EDC, welches kurz vorher in aqua dest gelöst wurde, in 1000 fachen
Überschuss zugegeben und sofort anschließend Sulfo-NHS (vorher in aqua dest gelöst) in 500
fachen Überschuss zugeführt. Nach unterschiedlichen Inkubationszeiten wurden 50 µl
Aliquots abgenommen und die Reaktion mit 20 mM Glycin (Endkonzentration) gestoppt
(nach Herstellerprotokoll, Pierce). Die Proben wurden anschließend entweder in einem bereits
fertigen Tris-Acetat Gel (NuPage TM 7% Tris-Acetat Gel, Invitrogen) oder in einer SDS-PAGE
mit anschließender Silberfärbung untersucht (s. 3.4).
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