Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

Methoden
Substrat-Chromogengemisch Phosphat abzuspalten Als Substrat wurde in dieser Arbeit 5-
Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat (BCIP) verwendet, welches nach Dephosphorylierung in
einem blauen Farbstoff umgewandelt wird. Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT) diente in
dieser Reaktion als Oxidationsmittel, welches nach der Reaktion ebenfalls einen blauen
Farbstoff ergibt und damit farbverstärkend wirkt.
BCIP-Stammlösung
5mg/ml BCIP gelöst in TBS-Puffer pH 9,5
NBT-Stammlösung
33 mg/ml NBT gelöst in TBS-Puffer pH 9,5
Anwendung des NBT/BCIP-Chromogengemisches
Es wurden 1ml BCIP-Stammlösung in 30 ml NBT-Stammlösung gemischt und auf 37° C
erwärmt.
3.7 Biotinylierung von Proteinen
Biotin besitzt eine sehr hohe Affinität zu Avidin oder Streptavidin. Biotinylierte Proteine
können daher sehr gut mit AP-gekoppelten Streptavidin nachgewiesen werden (s. 3.6). Die
Biotinylierung von Proteinen erfolgt durch die Kopplung von Biotin über N-
Hydroxysuccinimid an Amingruppen unter milden alkalischen Bedingungen. Für die
Kopplung wurde NHS-Biotin in DMSO gelöst (1mg/ml). Das verwendete Protein wurde mit
der Biotinlösung im Verhältnis 1 mg Biotin auf 6 mg Protein vermischt. Danach wurde für 4
h bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Lösung durch Schwenken des Reaktionsgefäßes
zwischendurch gemischt wurde. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Glycin
(Endkonzentration von 50 mM) abgestoppt.
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