Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

Methoden
3.5 Dot-Blot
Der Dot-Blot wird als immunologische Nachweistechnik eingesetzt. Die zu untersuchenden
Proben wurden mittels einer Filtrationsapparatur (SCR 96 D Minifold II, Firma Schleicher &
Schuell) punktförmig auf eine zurechtgeschnittene Nitrozellulosemembran („Protran“ BA 85,
Firma Schleicher & Schuell) gebracht. Dafür wurden zwei Blottingpapiere (GB 003, Firma
Schleicher & Schuell) auf die Filterplatte gelegt, die wiederum auf der Vakuumkammer liegt,
und diese mit PBS pH 7,4 getränkt, um so die Nitrozellulosemembran luftblasenfrei auf die
Blottingpapiere zu bringen. Die Membran wurde dann mit der „96-well“-Probenauftragsplatte
(SRC 60) bedeckt und die Apparatur fest verschlossen. Damit wird verhindert, dass sich die
Proben auf der Membran mischen. Es wurden insgesamt 100µl Probe (in PBS pH 7,4) pro
Dot pipettiert und gewartet, bis die Flüssigkeit durch die Kapillarkräfte der Blottingpapiere
eingesaugt wurde. Danach wurde pro Dot mit 200 µl PBS pH 7,4 gewaschen, wobei der
Puffer durch Anlegen von Vakuum durch die Membran hindurchgezogen wurde.
Anschließend wurden die Proben auf der Membran durch Erhitzen mit einem Fön fixiert und
die Membran in TBST für 2h bis über Nacht blockiert. Nach dem Blockieren wurde die
Membran nochmals trocken gefönt und konnte dann für verschiedene Versuche eingesetzt
werden. In dieser Arbeit wurde der Dot-Blot entweder für den Bindungsnachweis von E. coli-
IPSE an IgG, IgG-Fab und IgG-Fc verwendet als auch für verschiedene Sandwich-Blot-
Experimente, um die Bindungsstöchiometrie von IPSE an Immunglobulin zu untersuchen.
Dafür wurde die Membran mit den enthaltenen Proben ausgeschnitten und für den jeweiligen
Versuch mit den verschiedenen Bindungspartnern inkubiert (mind. 1,5 h). Die
Bindungspartner wurden dafür in TBST verdünnt. Nach jeder Inkubation wurde die Membran
3x für 10 min mit TBST gewaschen, um nicht gebundene Proteine zu entfernen. Vor der
Detektion mit NBT/BCIP (s. 3.6) wurden die einzelnen Dots oder Streifen mit Tesafilm am
oberen nicht-proteinenthaltenen Bereich der Membran zusammengeklebt und für 10 min in
TBS pH 9,5 gewaschen.
3.6 Nachweis membrangebundener Proteine
Der immunologische Nachweis membrangebundener Proteine erfolgte mit Alkalischer
Phosphatase. Alkalische Phosphatase (AP) ist entweder direkt an den eingesetzten
Antikörpern gebunden oder an Streptavidin (SAVAP). AP ist ein Enzym, das
Dephosphorylierungen katalysiert und wird in dieser Arbeit dazu eingesetzt von einem
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