Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

Methoden
Elektrodenpuffer
2x Probenpuffer (pH 6,8, reduzierend)
50 mM Tris-HCl Zusatz von 1 % (w/v) DTT in dem nicht-
384 mM Glycin reduzierenden Probenpuffer
0,1 % (w/v) SDS
Tabelle 3.1: Zusammensetzung von Sammelgel und Trenngel für die SDS-PAGE
Sammelgel Trenngel (C = 2,7 %)
T = 4% T = 7,5 % T = 10 % T = 12 %
Aqua dest. 2,9 ml 8 ml 6,6 ml 5,5 ml
Acrylamidlösung
(T = 30 %, Bis = 0,8 %)
850 µl 4 ml 5,4 ml 6,5 ml
4x Sammelgelpuffer 1,3 ml -
4x Trenngelpuffer - 4 ml
Pyronin G 16 µl -
SDS (10 % (w/v)) 51 µl 163 µl
TEMED 5 µl 16 µl
APS (10 % (w/v)) 30 µl 100 µl
3.4 Silberfärbung von Polyacrylamidgelen
Das Prinzip der Silberfärbung, ist die Komplexbildung von Ag + -Ionen mit Glutamat-,
Aspartat- und Cysteinresten von Proteinen. Durch alkalisches Formaldehyd wird das Ag + der
Komplexe zu Ag reduziert und die Proteinbanden sichtbar gemacht. Für die Silberfärbung der
Gele wurde ein Protokoll nach Heukeshoven und Dernick (1988) verwendet. Die
Nachweisgrenze liegt hierbei bei 50 bis 100 pg Protein pro Bande.
Vor dem Färben wurden die Proteine im Gel für 2h fixiert und das Gel anschließend über
Nacht in einer thiosulfathaltige Lösung inkubiert. Danach wurde das Gel 3x für 10 min mit
aqua bidest gewaschen und dann für 1 h in der Silberlösung inkubiert. Nach erneutem kurzem
Waschen mit aqua bidest wurden die Banden in der Entwicklerlösung bis zur gewünschten
Färbung entwickelt. Durch 10 min Inkubation in einer Stopplösung wurde die Reaktion
beendet. Danach wurde erneut für 10 min gewaschen und das Gel dann für mind. 1 Stunde zur
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