Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

Methoden
zugegeben kommt es zur Reduktion der Disulfidbrücken und somit zu einer vollständigen
Denaturierung des Proteins.
In dieser Arbeit wurde die diskontinuierliche SDS-PAGE eingesetzt. Diskontinuierlich
bedeutet die Verwendung von zwei Gelen, ein Sammelgel und ein Trenngel. Das Sammelgel
ist großporig und dient dazu, die Proteine vor dem Eintritt in das Trenngel zu fokussieren.
Durch den sauren pH-Wert (pH 6,8) des Sammelgels liegen die im Laufpuffer enthaltenen
Glycinionen ungeladen vor. Diese haben eine sehr geringe Wanderungsgeschwindigkeit
(Folgeionen) im Gegensatz zu den schnellwandernden Chloridionen (Leitionen). Zwischen
Leit- und Folgeionen baut sich aufgrund des Mangels an Ladungsträgern, nach Anlegen eines
elektrischen Feldes, eine hohe elektrische Spannung auf. Die dort befindlichen Proteine
wandern dadurch schneller und werden zu einer scharfen Bande fokussiert. Dieser Effekt geht
beim Eintritt in das Trenngel verloren. Das Trenngel besitzt einen pH-Wert von 8,8, was
bewirkt, dass die Glycinionen eine negative Nettoladung enthalten und der Mangel an
Ladungsträgern aufgehoben wird. Jetzt erfolgt die Trennung der Proteine nach ihrem
Molekulargewicht. Die Porengröße eines Gels wird durch die Gesamtkonzentration (T) von
Acrylamid (Ac) und des quervernetzenden Methylenbisacrylamid (Bis) bestimmt. Den
Vernetzungsgrad nennt man C (Cross-linking). Die Zusammensetzung für das Sammel- und
Trenngel sind in Tabelle 3.1 aufgeführt.
Vor dem Auftragen der Proben auf das Sammelgel wurden diese zu gleichen Teilen mit nichtreduzierendem
2x Probenpuffer versetzt. Neben den Proben wurde ein Marker (High
Molecular Weight / Low Molecular Weight, Firma Biorad) zur Abschätzung des
Molekulargewichtes mitlaufen gelassen. Dieser ist vorher entsprechend der Herstellerangaben
1:20 in 1x reduzierendem Probenpuffer verdünnt worden. Für die nachfolgenden
Silberfärbungen der Gele (s. 3.8) wurden 2 µl des jeweiligen Markers aufgetragen. Zur
Auftrennung der Proben wurde eine Elektrophoresekammer der Firma Phase verwendet. Die
Fokussierung und das Eintreten der Proteine in das Trenngel erfolgten bei 50 V. Danach
wurde die Spannung auf 100 V erhöht.
4x Sammelgelpuffer (pH 6,8)
2x Probenpuffer (pH 6,8, nicht-reduzierend)
0,5 M Tris-HCl 0,12 M Tris-HCl
20 % (v/v) Glycerin
4x Trenngelpuffer (pH 8,8)
4 % (v/v) SDS
1,5 M Tris-HCl 0,01 % (w/v) Bromphenolblau
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