Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

Methoden
Die spezifischen Extinktionkoeffizienten von HEK- E. coli-
1,77) wurden über das Programm ProtParam [4] ermittelt. Für die Messungen wurden 60 µl
Probe in eine Kunststoff-Einmalküvette (UVette, Firma Eppendorf) gegeben und bei einer
Wellenlänge von 280 nm im Photometer (BioPhotometer, Firma Eppendorf) gemessen. Als
Leerwert diente das jeweilige Lösungsmittel der Probe, in dem es sich befand.
3.2 Dialyse von Proteinlösungen
Die Dialyse wird zum Entfernen von niedermolekularen Bestandteilen und zur Umpufferung
einer Lösung eingesetzt. Kleine Moleküle diffundieren durch eine semipermeable Membran
längs eines Konzentrationsgradienten, bis auf beiden Seiten ein Gleichgewicht eingestellt ist.
Die Wahl der Dialysemembranen ist abhängig von dem Molekulargewicht der zu
dialysierenden Probe. Bevor die Probe in den Dialyseschlauch gefüllt wurde, musste dieser
vorher für 20 min in aqua dest. gewaschen und eingeweicht werden. Für das Einfüllen der
Probe, wurde der Dialyseschlauch zuerst auf einer Seite verschlossen. Nach dem Einfüllen
wurde die andere Seite ebenfalls verschlossen und der Schlauch und in das 100 – 1000fache
Volumen Dialyselösung gelegt. Die Dialyse fand über 24 h bei 4°C unter rühren statt, wobei
die Dialyselösung nach 1 und 3 Stunden gewechselt wurde. Nach der Dialyse wurde die
Probe wieder aus dem Schlauch entnommen, und es wurde die Proteinkonzentration bestimmt
(s. 3.1)
3.3 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) nach Laemmli
(1970)
Die SDS-PAGE wird zur Trennung von Proteinen aus einem Molekülgemisch eingesetzt.
Dabei werden die Proteine nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Durch SDS (sodium
dodecyl sulfate), ein anionisches Detergenz, werden die hydrophoben Bindungen innerhalb
des Proteins aufgehoben. Das Protein geht in eine lineare Form über. Die Eigenladung des
Proteins wird durch das SDS überdeckt und es erhält eine negative Nettoladung. Aus diesem
Grund werden Proteine nur noch nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt, anders als bei
einer nativen PAGE. Dort wird sowohl nach Größe als auch nach Ladung getrennt. Wird zu
dem Protein zusätzlich zum SDS noch --ME) oder Dithiothreitol (DTT)
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