Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

Methoden
3 Methoden
Alle Experimente wurden mit rekombinanten IPSE/alpha-1-Molekülen durchgeführt.
Rekombinantes IPSE/alpha-1 wurde sowohl in einem prokaryotischen Expressionsystem (E.
coli) als auch in einem eukaryotischen Expressionssystem (293 HEK-Zellen) als Hisgetaggtes
Fusionsprotein hergestellt. Es wird je nach Herstellungsweise entweder E. coli-
IPSE/alpha-1 oder HEK-IPSE/alpha-1 genannt. In dieser Arbeit wurde mit beiden Molekülen
gearbeitet. Zur Vereinfachung werden die Moleküle im Folgenden nur als E. coli-IPSE bzw.
HEK-IPSE bezeichnet.
3.1 Bestimmung der Proteinkonzentrationen
3.1.1 Proteinbestimmung mit dem BCA-Test (Smith et al. 1985)
Für den BCA-Test wurde der „BCA TM Protein Assay Reagent Kit“ (Firma Pierce) verwendet.
Für eine sensitivere Proteinbestimmung wurde mit dem „Micro BCA TM Protein Assay
Reagent Kit“ (Firma Pierce) gearbeitet. Dieser besitzt eine Nachweisgrenze bis 0,5 µg/ml.
Beide Tests wurden nach Herstellerangaben durchgeführt. Die Methode beruht auf der
Reduktion von Cu 2+ zu Cu + in einer alkalischen Lösung durch Proteine, die mit Cu 2+ einen
Komplex bilden. 2,2´- Bicinchoninsäure (BCA) bildet mit dem Cu + einen violetten
Farbkomplex (Biuret-Reaktion), was den Nachweis von Proteinen bei einer Wellenlänge von
570 nm ermöglicht.
3.1.2 Proteinbestimmung mit der spektralen Absorptionsmessung
Proteinkonzentrationen können mit Hilfe der Absorptionsmessung bei 280 nm Wellenlänge
bestimmt werden. Die aromatischen Aminosäuren Tryptophan und Tyrosin (in geringerem
Maß auch Phenyalanin) absorbieren bei dieser Wellenlänge. Über den spezifischen
Extinktionkoeffizienten und der Absorption lässt sich die Proteinkonzentration nach dem
Lambert-Beerschen-Gesetz ermitteln:
A 280 nm = log (I o / I) = s x c x d 280 nm x -1 s (für d = 1)
A = Absorption
s = spezifischer Extinktionkoeffizienten [1 x mol -1 x cm -1 ]
c = Proteinkonzentration [g x l -1 ]
d = Schichtdicke der Küvette
I 0 = einfallendes Licht
I = austretendes Licht
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