Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

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Materialien 2.3 Antikörper Tabelle 2.1: Auflistung der verwendeten Antikörper Name (Quelle) Konjugation Firma Verdünnung IgG (human, polyklonal) - Octapharma unterschiedlich IgG-Fab Fragment (human) - Acris unterschiedlich IgG-F(c) Fragment (human) - Acris unterschiedlich IgE (human, monoklonal, Klon HE1) - Diatec unterschiedlich anti-IPSE/alpha-1 (Kaninchen) - * unterschiedlich anti-IPSE/alpha-1 (monoklonal, Klon 74-4B7) - Labsoft 1:50 anti-Kaninchen IgG (Esel) AP Dianova 1:15000 anti-Maus IgG (Ziege) AP Dianova 1:20000 anti-human IgG (Fc) (Ziege) AP Dianova 1:20000 anti-human Ig () (Ziege) AP Tago unterschiedlich * zur Verfügung gestellt von Prof. Michael J. Doenhoff (University of Bangor, Wales) 28
Methoden 3 Methoden Alle Experimente wurden mit rekombinanten IPSE/alpha-1-Molekülen durchgeführt. Rekombinantes IPSE/alpha-1 wurde sowohl in einem prokaryotischen Expressionsystem (E. coli) als auch in einem eukaryotischen Expressionssystem (293 HEK-Zellen) als Hisgetaggtes Fusionsprotein hergestellt. Es wird je nach Herstellungsweise entweder E. coli- IPSE/alpha-1 oder HEK-IPSE/alpha-1 genannt. In dieser Arbeit wurde mit beiden Molekülen gearbeitet. Zur Vereinfachung werden die Moleküle im Folgenden nur als E. coli-IPSE bzw. HEK-IPSE bezeichnet. 3.1 Bestimmung der Proteinkonzentrationen 3.1.1 Proteinbestimmung mit dem BCA-Test (Smith et al. 1985) Für den BCA-Test wurde der „BCA TM Protein Assay Reagent Kit“ (Firma Pierce) verwendet. Für eine sensitivere Proteinbestimmung wurde mit dem „Micro BCA TM Protein Assay Reagent Kit“ (Firma Pierce) gearbeitet. Dieser besitzt eine Nachweisgrenze bis 0,5 µg/ml. Beide Tests wurden nach Herstellerangaben durchgeführt. Die Methode beruht auf der Reduktion von Cu 2+ zu Cu + in einer alkalischen Lösung durch Proteine, die mit Cu 2+ einen Komplex bilden. 2,2´- Bicinchoninsäure (BCA) bildet mit dem Cu + einen violetten Farbkomplex (Biuret-Reaktion), was den Nachweis von Proteinen bei einer Wellenlänge von 570 nm ermöglicht. 3.1.2 Proteinbestimmung mit der spektralen Absorptionsmessung Proteinkonzentrationen können mit Hilfe der Absorptionsmessung bei 280 nm Wellenlänge bestimmt werden. Die aromatischen Aminosäuren Tryptophan und Tyrosin (in geringerem Maß auch Phenyalanin) absorbieren bei dieser Wellenlänge. Über den spezifischen Extinktionkoeffizienten und der Absorption lässt sich die Proteinkonzentration nach dem Lambert-Beerschen-Gesetz ermitteln: A 280 nm = log (I o / I) = s x c x d 280 nm x -1 s (für d = 1) A = Absorption s = spezifischer Extinktionkoeffizienten [1 x mol -1 x cm -1 ] c = Proteinkonzentration [g x l -1 ] d = Schichtdicke der Küvette I 0 = einfallendes Licht I = austretendes Licht 29
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Diskussion 5.1 E. coli-IPSE bindet
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Diskussion 5.3.1 Sandwich-Blot-Vers
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Diskussion zeigte. Protein L besteh
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Diskussion 5.4 Bindungsstudien von
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Diskussion 5.5 Rekombinante IPSE-Mo
Seite 93 und 94:
Diskussion 5.6 IPSE - ein unkonvent
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Diskussion IgE-Quervernetzung der F
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Literatur Brunner T, Heusser CH and
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Literatur Florio G, Petraroli A, Pa
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Literatur Kagey-Sobotka A, Dembo M,
Seite 103 und 104:
Literatur Min B, Prout M, Hu-Li J,
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Literatur Romagnani S (1991). Human
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Literatur Williams ME, Montenegro S
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Eigene Vorträge 7 Eigene Vorträge
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Danksagung Karo und Ulrike, Euch da
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10 Eidesstattliche Erklärung Hierm
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