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Zertifizierte Fortbildung Abbildung 1: Ausgewählte Meilensteine der Entwicklung von Mikrobiologie und Hygiene zu wichtigen Bereichen der industriellen Pharmazie. Abbildung 2: Schematische Darstellung der Vorgehensweise zur Keimzahlbestimmung mittels Plattengussverfahren nach Pharm. Eur. - modifiziert nach [6]. domonas aeruginosa dürfen, wiederum bezogen auf eine Substanzmenge von 1 g bzw. eine Volumeneinheit von 1 ml, nicht anwesend sein [5]. Neben Nachweisprotokollen für diese beiden spezifizierten Keime werden in Kapitel 2.6.13 der Pharm. Eur. überdies Untersuchungsmethoden für Escherichia coli, Salmonellen, Clostridien und gegen Gallensalze resistente gramnegative Bakterien aufgeführt mit – im Gegensatz zu den nur in Europa geltenden Vorgängertexten des Arzneibuches – nun detaillierteren Angaben zu den Untersuchungsbedingungen (z.B. Selektivmedien und Bebrütungstemperaturen). Neu hinzugekommen ist in der harmonisierten Version die Methode zur Untersuchung auf Candida albicans, gestrichen wurde die Bestimmungsmethode von Clostridium perfringens. Die im Kapitel 2.6.12. des Europäischen Arzneibuches aufgeführten Methoden zur Zählung der vermehrungsfähigen Keime haben durch die Harmonisierung ebenfalls Änderungen und Erhöhungen des Detaillierungsgrades erfahren. So wurden die oben bereits verwendeten Maßzahlen als Grundlage der Akzeptanzkriterien neu eingeführt und deren jeweilige Bestimmungen exakt definiert. Grundsätzlich kann die Prüfung nach der Membranfilter-Methode, dem Plattengussverfahren oder dem Ausstrichverfahren erfolgen. Abbildung 2 verdeutlicht schematisch die wichtigsten Arbeitsgänge bei der Keimzahlbestimmung nach dem Plattengussverfahren entsprechend Arzneibuchvorgaben [6]. Für die Ermittlung der Gesamtzahl aerober Mikroorganismen (TAMC – Total Aerobic Microbial Count) muss ein Agarmedium mit Casein- und Sojapepton (CASO) verwendet werden, das 3-5 Tage bei 30-35°C bebrütet wird. Zur Messung der Gesamtzahl an Hefen und Schimmelpilzen (TYMC – Total Combined Yeast/Mould Count) ist nunmehr der Einsatz von Sabouraud-Dextrose-Agar (SDA) ohne Zusatz eines Antibiotikums und einer Bebrütungsdauer von 5-7 Tagen bei 20-25°C vorgeschrieben. Neu in diesem Kontext ist ferner, dass auch Ausgangsstoffe halbfester Dermatika (Wirk- und Hilfsstoffe), bei denen in der Monographie keine mikrobiologische Prüfung verlangt wird, Prüfungen hinsichtlich TAMC und TYMC unterzogen werden müssen. Als Akzeptanzkriterien sind hierbei 10 3 KBE/g bzw. ml für TAMC und 10 2 KBE/g bzw. ml für den TYMC-Wert gefordert. Wesentlich weniger Spielraum lässt der harmonisierte Arzneibuchtext bei der Beurteilung überhöhter Ergebnisse. Während bislang mit dem Fünffachen des Akzeptanzkriteriums argumentiert werden konnte, ist laut aktueller Vorgabe zur Ermittlung der maximal annehmbaren KBE- Anzahl lediglich die Multiplikation mit Faktor 2 statthaft [5]. Prüfung auf ausreichende Konservierung Während die im vorangegangenen Abschnitt dargelegten Anforderungen vor allem die Einhaltung mikrobiologischer Grundsätze vor und während der Herstellung halbfester Formulierungen sicherstellen sollen, ist es überdies nötig, Vorkehrungen zu treffen resp. Standards zu schaffen, die den mikrobiellen Produktschutz während der Verwendung des Arzneimittels gewährleisten. Sofern eine Formulierung nicht schon selbst ausreichende antimikrobielle Eigenschaften besitzt, kann dazu – besonders bei mikrobiologisch anfälligen Systemen mit hohen Wassergehalten (z.B. O/W-Cremes) – eine Konservierung der Zubereitung sinnvoll sein [7]. Wie jedoch schon in den allgemeinen Ausführungen zur mikrobiellen Qualität angedeutet wurde, muss die Notwendigkeit der Konservierung als Maßnahme zur Vermeidung von Patientengefährdungen bzw. des Verderbs der Zubereitung klar nachgewiesen werden. Sie darf nicht etwa als Ersatz für das Außerachtlassen von GMP- Regularien und mangelnder Hygiene während der Arzneimittelherstellung eingesetzt werden [3, 8]. Die Prüfung auf ausreichende Konservierung halbfester Formulierungen erfolgt gemeinhin mit einem landläufig als Keimbelastungstest (KBT) bezeichneten 9
PHARMAZEUTISCHE WISSENSCHAFT 10 Abbildung 3: Der Schimmelpilz Aspergillus niger A) Lichtmikroskopische Aufnahme bei 400-facher Vergrößerung - modifiziert nach [11]. B) Eine durch den Mikroorganismus infizierte Küchenzwiebel - modifiziert nach [12]. Abbildung 4: Häufig in Dermatika eingesetzte Konservierungsmittel, sortiert nach Klassen. Verfahren. Die von manchen Autoren verwendete synonym gemeinte Bezeichnung Konservierungsmittelbelastungstest ist etwas unglücklich gewählt, da der Qualitätsnachweis des ausreichenden Schutzes vor unerwünschten Wirkungen durch mikrobielle Kontamination oder Vermehrung von Mikroben während Lagerung und Anwendung des Arzneimittels für die Formulierung in jedem Fall erbracht werden muss, unabhängig davon, ob dafür ein zusätzliches Konservierungsmittel vonnöten war oder nicht [1]. Bei einem KBT werden die Zubereitungen, falls möglich in ihrem Endbehältnis, mit geeigneten Mikroorganismen kontaminiert. Hierfür finden nach festgelegten Protokollen hergestellte, genau vorgeschriebene Inokuli der jeweiligen Testkeime Verwendung. Die derart beimpften Proben werden bei ebenfalls exakt vorgegebenen Temperaturen gelagert und in bestimmten Zeitabständen auf die Anzahl der Kontrollkeime analysiert [9, 10]. Als Problemkeim unter den Testmikroorganismen und damit häufig maßgebend für das Ergebnis der Prüfung auf ausreichende Konservierung erweist sich in vielen Fällen der Schimmelpilz Aspergillus niger (Schwarzschimmel). Er hat seinen Namen von den dunklen, nahezu schwarzen Sporen (Abbildung 3A – modifiziert nach [11]), deren Bündel bei infizierten Organismen teilweise sogar mit bloßem Auge zu erkennen sind (Abbildung 3B – modifiziert nach [12]), und ist in der Lage, große Intervalle in Temperatur und pH-Wert ohne Einfluss auf sein Wachstum zu tolerieren. Detailliert beschrieben ist die KBT-Methodik im Kapitel 5.1.3 Prüfung auf ausreichende Konservierung des Europäischen Arzneibuchs [5]. Auch diese Prüfung war Gegenstand der Harmonisierungsbestrebung en zwischen den Behördenvertretern aus Europa, den USA und Japan. Im Gegensatz zu den im vorigen Abschnitt besprochenen Verfahren konnte für die Ausführung und vor allem die Ergebnisbewertung des Keimbelastungstests keine Einigung erzielt werden, so dass die Arbeit an der Harmonisierung dieses Verfahrens zunächst eingestellt wurde. Die Methode des Japanischen Arzneibuchs kann aufgrund von nur minimalen Unterschieden als mit der USP-Methode identisch angesehen werden [13]. Der tabellarische Vergleich (Tabelle 1) illustriert die wesentlichen Unterschiede der Arzneibuchvorgaben zum Test in Europa (Pharm. Eur., 5.1.3. Prüfung auf ausreichende Konservierung) und den USA (USP, 51 Antimicrobial Effectiveness Testing). Abgesehen von einem marginalen Unterschied bei der Auswahl der Testkeime (die USP fordert zusätzlich die Belastung der Formulierungen mit Escherichia coli, was in der Pharm. Eur. lediglich für orale Arzneiformen erforderlich ist) liegt die Hauptdifferenz neben der vergleichsweise erhöhten Anzahl an Prüfzeitpunkten in der Durchführung nach der Pharm. Eur.-Methode vor allem in der Bewertung der Ergebnisse [14, 15]. Dabei beinhaltet das Verfahren nach Europäischem Arzneibuch eindeutig die strikteren, schwieriger zu erfüllenden Akzeptanzkriterien. Dies war auch der Grund für die bislang nicht erfolgte Einigung auf ein gemeinsames Protokoll. Ein harmonisiertes Verfahren auf Basis der Pharm. Eur.-Akzeptanzkriterien würde die amerikanische Zulassungsbehörde Food and Drug Administration (FDA) dazu zwingen, für schon lange im Markt befindliche Topika (sogenannte „Grandfather“-Produkte) detaillierte Schutz- bzw. Ausnahmevorschriften zu erarbeiten, um zu verhindern, dass diese Produkte aufgrund der härteren europäischen Kriterien zur ausreichenden Konservierung nicht mehr marktfähig sind, obwohl sie sich als sicher und wirksam erwiesen haben [16]. Konservierungsmittel für topische Dermatika Abbildung 4 zeigt eine Auswahl häufig in Dermatika eingesetzter Konservierungsmittel und ihre chemische Klassifizierung. Ingesamt finden in etwa 40 Substanzen Verwendung zur Konservierung von Arzneimitteln zur dermalen Applikation. Bei den kosmetischen Präparaten zur Anwendung auf der Haut ist die Zahl der zulässigen Konservierungsmittel rund doppelt so hoch [17, 18]. Die schädigende Wirkung der eingesetzten Chemikalien auf Mikroorganismen liegt in der primären Toxizität dieser Stoffe begründet, also in ihrer Fähigkeit, entweder an der Mikroben-Zellwand oder in ihrem Zellinneren als Zellgift zu agieren. Dabei werden – meist in Abhängigkeit von der eingesetzten Konzentration – mikrobistatische, d.h. wachstumshemmende, und mikrobizide, d.h. den Zelltod der Mikroben herbeiführende, Effekte unterschieden. Neben diesen Eigenschaften, die den Sinn ihres Einsatzes begründen, gibt es viele weitere Anforderungen an ein ideales Konservierungsmittel, die in ihrer Gesamtheit keine der eingesetzten Substanzen zu erfüllen vermag [17, 18]. Diese sind vor allem physiologische Verträglichkeit, Kompatibilität mit Wirk- und Hilfsstoffen, chemische Stabilität und ein möglichst breites Wirkungsspektrum mit wenig Abhängigkeiten von Umgebungseinflüssen, wie z.B. pH-Wert- oder Temperaturänderungen. Die Phenolderivate gehören zu den ältesten zum Einsatz kommenden Konservierungsmitteln. Ihre Wirkung ist an das Vorhandensein der freien funktionellen Phenolgruppe geknüpft, wobei Chlorierungen und Alkylierungen am Ring zu Wirkverstärkung führen. Als wesentlicher Nachteil dieser Hilfsstoffe ist das Risiko von Kontaktekzemen und Sensibilisierungen zu nennen. Dies hat unter anderem dazu geführt, dass der Einsatz der Parabene (p-Hydroxybenzoesäureester), als deren wichtigste Vertreter die hier abgebildeten Methyl- und Propylester gelten, heutzutage eher kritisch zu bewerten ist und als nicht ratsam erscheint. Lange Zeit galten diese Substanzen als Universalkonservierungsmittel [4, 17]. Auch bei den Alkoholen, deren antimikrobieller Wirkmechanismus Abbildungen 1, 4, 5: Dr. Hagen Trommer
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