Einfluss von Strahlung auf die Zellzyklus-Progression und die ...

Institut für Zoologie 

Technische Universität Darmstadt 

Fachbereich Biologie 

Gesellschaft 

für Schwerionenforschung mbH 

Darmstadt 

Diplomarbeit 

Einfluss von Strahlung 

auf die Zellzyklus-Progression und 

die Ausprägung von 

Chromosomenschäden 

Marcus Winter 

20. Oktober 2002 

Betreut durch Prof. Dr. G. Kraft (GSI) 

Externe Betreuung durch Prof. Dr. P. Layer (TUD)

Diese Diplomarbeit wurde mit dem Textsatzsystem L A TEX erstellt.

„Man muss nur wollen und daran glauben, dann wird es gelingen.“ 

Ferdinand Graf von Zeppelin

Vorwort 

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Februar bis Oktober 2002 an der Gesellschaft 

für Schwerionenforschung (GSI) in Darmstadt, unter der Leitung von Prof. Dr. 

G. Kraft und Dr. S. Ritter als externe Diplomarbeit im Fachbereich Biologie der 

Technischen Universität Darmstadt (TUD) angefertigt. Die Betreuung von Seiten 

der TUD erfolgte durch Prof. Dr. P. Layer. 

Die Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung strahleninduzierter Veränderungen 

der Zellzyklus-Progression und die Ausprägung von Chromosomenschäden in 

normalen humanen Fibroblasten, mit besonderen Blick auf die spezielle Wirkung 

von schweren Ionen. Die Arbeit steht im Zusammenhang mit dem Pilotprojekt zur 

Tumortherapie mit schweren Ionen, mit der seit Dezember 1997 Patienten an der GSI 

mit Kohlenstoff-Ionen behandelt werden. 

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Inhaltsverzeichnis 

I Einleitung 1 

1 Grundlagen der Strahlenbiologie 3 

1.1 Biologische Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 

1.1.1 Die strahlenempfindlichen Strukturen der Zelle . . . . . . . . 3 

1.1.2 Das Modellsystem Fibroblasten . . . . . . . . . . . . . . . . 4 

1.1.3 Der Zellzyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 

1.1.4 Die biologische Wirkung ionisierender Strahlung . . . . . . . 6 

1.2 Physikalische Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 

1.2.1 Eigenschaften ionisierender Strahlung . . . . . . . . . . . . . 8 

1.2.2 Dosis und RBE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 

1.3 Allgemeines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 

1.3.1 Quellen ionisierender Strahlung . . . . . . . . . . . . . . . . 10 

1.3.2 Tumortherapie mit schweren Ionen an der GSI . . . . . . . . 11 

2 Zielsetzung dieser Arbeit 13 

II Material und Methoden 15 

1 Zellen und Kultivierungsmethoden 17 

1.1 Verwendete Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 

1.2 Verfahren zur Zellkultivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 

1.2.1 Lagerung der Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 

1.2.2 Kultivierung der Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 

1.2.3 Synchronisierung der Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 

1.2.4 Ernten der Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 

1.2.5 Altersbestimmung der Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 

1.2.6 Subkultivierung der Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 

1.2.7 Sterilität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 

vii


2 Bestrahlung 21 

2.1 Vor- und Nachbereitung der Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 

2.2 Durchführung der Bestrahlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 

2.2.1 Bestrahlung mit Kohlenstoff-Ionen . . . . . . . . . . . . . . 21 

2.2.2 Röntgenbestrahlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 

3 Messmethoden 25 

3.1 Rahmenbedingungen bei den Messungen . . . . . . . . . . . . . . . 25 

3.2 Durchführung der Messungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 

3.2.1 Wachstumskinetik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 

3.2.2 Kontinuierliche BrdU-Markierung . . . . . . . . . . . . . . . 27 

3.2.3 Durchflusszytometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 

3.2.4 Analyse von Chromosomenschäden . . . . . . . . . . . . . . 31 

3.3 Fehlerbetrachtung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 

III Ergebnisse 39 

1 Einfluss von Strahlung 41 

1.1 Einfluss von Strahlung auf die Zellzyklus-Progression . . . . . . . . 41 


1.1.2 Hoechst-BrdU-Quenching . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 

1.1.3 Zellzyklus-Verteilung in PCC-Präparaten . . . . . . . . . . . 48 

1.1.4 Veränderung des Mitoseindex . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 

1.2 Analyse der Chromosomenschäden . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 

1.2.1 Anzahl aberranter Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 

1.2.2 Aberrationen pro Zelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 

2 Einfluss von BrdU 57 

2.1 Veränderung des Wachstums . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 

2.2 Veränderung des Mitose- und Kondensationsindex . . . . . . . . . . 58 

IV Diskussion 61 

1 Einfluss von Strahlung 63 

1.1 Veränderungen der Zellzyklus-Progression . . . . . . . . . . . . . . 63 


1.1.2 Hoechst-BrdU-Quenching . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 

1.1.3 Bestimmung des Mitoseindex . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 

1.1.4 Vorzeitige Chromosomenkondensation . . . . . . . . . . . . . 68 

1.1.5 Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 

1.2 Erzeugung von Chromosomenschäden . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 

viii


1.3 RBE von Kohlenstoff-Ionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 

2 Einfluss von BrdU 75 

2.1 Zytotoxische Wirkung von BrdU . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 

2.2 Einfluss auf den Zellzyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 

3 Zusammenfassung und Ausblick 79 

Anhang 81 

A Verwendete Materialien 83 

A.1 Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 

A.2 Lösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 

A.3 Verbrauchsmaterialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 

A.4 Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 

B Messergebnisse 89 

B.1 Kontinuierliche BrdU-Markierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 

B.2 Zellzyklus-Phasenverteilung nach Flussyztometrie . . . . . . . . . . 92 

B.3 Zellzyklus-Verteilung in PCC Präparaten . . . . . . . . . . . . . . . 95 

B.4 Mitoseindex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 

B.5 Aberrationsdaten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101 

B.6 Wachstumskinetik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102 

Abbildungsverzeichnis 103 

Abkürzungsverzeichnis 105 

Literaturverzeichnis 107 

Danksagung 117 

ix


x

Teil I 

Einleitung 

1

1 Grundlagen der Strahlenbiologie 

1.1 Biologische Grundlagen 

Die Strahlenbiologie beschäftigt sich mit physikalischen, chemischen und biologischen 

Effekten, die auftreten, wenn ein Organismus einer Strahlung ausgesetzt wird. Ziel 

ist es dabei, die komplizierten Prozesse zu verstehen, die in Atomen, Molekülen, einzelnen 

Zellen, Zellverbänden und Geweben ablaufen und schließlich zur Reaktion des 

Gesamtorganismus führen. Da es sich bei ihr um einen interdisziplinären Forschungszweig 

handelt, soll in dieser Einleitung auf die für diese Arbeit relevanten biologischen 

und physikalischen Grundlagen gleichermaßen eingegangen werden. 

1.1.1 Die strahlenempfindlichen Strukturen der Zelle 

Die Zelle stellt die kleinste lebens- und vermehrungsfähige Einheit dar, aus der alle 

höheren Organismen aufgebaut sind. Eine eukaryontische Zelle teilt sich in verschiedene 

Kompartimente auf, darunter das Zytoplasma und der Zellkern. Während das 

Zytoplasma die Zellorganellen enthält, in denen die Stoffwechselvorgänge ablaufen, 

befindet sich im Zellkern das Erbgut, von dem die Kontrolle der Lebensvorgänge 

ausgeht. Die Erbinformation ist in der Struktur der 46 DNA Moleküle gespeichert, 

die im Zellkern jeder menschlichen Zelle enthalten sind (Überblick in: Alberts u. a. 

1994). 

Die durch Bestrahlung ausgelösten Veränderung im Zytoplasma wirken sich nur 

im geringen Maße auf die weitere Entwicklung der Zelle aus. Die dort vorhandenen 

Moleküle liegen in vielen Kopien vor und können anhand der genetischen Information 

neu gebildet werden. Dagegen wirkt sich Strahlung auf den Zellkern viel stärker aus 

(Munro 1970). Die im Kern erzeugten direkten Veränderungen an der DNA, dem 

Trägermolekül der Erbinformation, können zu einer Vielzahl von Schäden führen. 

Der Ort, von dem vorwiegend die strahlenbiologische Wirkung ionisierender Strahlen 

ausgeht, ist also der Zellkern. 

Dabei zeigen Zellen, die sich kaum reproduzieren (z. B. Nervenzellen), eine hohe 

Strahlenresistzenz, wohingegen die stark proliferierenden Zellen (z. B. der Schleimhaut), 

die den Zellzyklus häufig durchlaufen, besonders empfindlich auf Strahlung 

reagieren. Außerdem verändert sich die Strahlensensibilität der Zellen im Laufe des 

Zellzyklus, bedingt durch Änderungen der Zellkerngröße und der Chromatinstruktur 

(Sinclair 1968). 

3

Teil I – Einleitung 

Kapitel 1 – Grundlagen der Strahlenbiologie 

1.1.2 Das Modellsystem Fibroblasten 

Fibroblasten sind Zellen mesodermalen Ursprungs und machen den Hauptteil der 

Zellen des Bindegewebes aus. Neben ihrem Vorkommen in der Haut spielen sie auch 

eine Rolle in vielen anderen Geweben wie z. B. Knorpel, Sehnen, Bändern und Blutgefäßen. 

Sie besitzen ein großes und verzweigtes Zytoplasma, das den elliptischen 

Zellkern umschließt. Ihre Funktion im Organismus ist die Produktion von Fasern bestehend 

aus Proteinen wie z. B. das Kollagen, welche die extrazelluläre Matrix, das 

Gerüst des Bindegewebes, bilden. Normale humane Fibroblasten besitzen in vivo und 

auch in vitro eine endliche Lebensdauer, daher werden sie als primäre, nach seriellem 

Passagieren auch als sekundäre Fibroblasten bezeichnet (Überblick in: Alberts u. a. 

1994). 

Da sie multipotente Zellen sind, können sie zu anderen Zelltypen mit spezieller 

Funktion ausdifferenzieren, einzelne Zellen lassen sich auf Grund der dabei auftretenden 

morphologischen und biochemischen Unterschiede nach dem Stadium ihrer Differenzierung 

klassifizieren. Diese, von den Fibroblasten nacheinander durchlaufenen 

Stadien, können in drei Gruppen mit insgesamt sieben Zelltypen eingeteilt werden, 

wobei die Zusammensetzung einer primären Zellpopulation mit dem Alter des Spenders 

korreliert. Die erste Gruppe besteht aus mitotisch aktiven Zellen, die sich im 

Stadium I, II und III befinden und die auch als Progenitorfibroblasten bezeichnet werden. 

In die zweite Gruppe werden postmitotische Fibroblasten eingeordnet, die ihre 

Fähigkeit zur Proliferation verloren haben und zu spezialisierten Funktionszellen ausdifferenziert 

sind. Diese Zellen lassen sich in die Stadien IV, V und VI unterscheiden 

und werden auch als seneszente Zellen bezeichnet. In der dritten Gruppe findet sich 

ein letztes Stadium VII, Zellen in dieser Gruppe haben das Ende ihrer Lebensspanne 

erreicht, an dem sie absterben (Mensch, Huhn) oder transformieren können (Maus, 

Ratte) (nach: Bayreuther u. a. 1988). Der Übergang zwischen den mitotisch potentiell 

aktiven und den postmitotischen Zellstadien erfolgt spontan, sein zeitlicher Verlauf 

ist von den Kultivierungsbedingungen und der Zelllinie abhängig. Fibroblasten, die 

ionisierender Strahlung ausgesetzt werden, erreichen die postmitotischen Stadien IV– 

VI früher als unbestrahlte Zellen, d. h. sie differenzieren schneller (Rodemann u. a. 

1991). 

1.1.3 Der Zellzyklus 

Ein Organismus muss ständig neue Zellen produzieren, sei es, um Verluste durch Alterung 

und Verletzung auszugleichen oder um zu wachsen. Die Vermehrung der Zellen 

wird durch Zellteilung erreicht, in denen sich eine einzelne Ursprungszelle in zwei 

Tochterzellen aufteilt. Dabei durchläuft die Zelle verschiedene, sich wiederholende 

zyklische Phasen, die zusammen den Zellzyklus bilden (Abbildung I 1.1). 

Der Zellzyklus wird durch verschiedene Prozesse definiert, die für die Teilung der 

Zelle kontrolliert ablaufen müssen. Zu Beginn des Zellzyklus wächst die Zelle und be- 

4


Abbildung I 1.1: Schematischer Überblick über den Zellzyklus-Ablauf. 

ginnt mit der Produktion von Proteinen, die für die folgenden Prozesse benötigt werden. 

Gegen Ende dieser relativ langen G 1 -Phase muss die Zelle einen Kontrollpunkt 

passieren. Ist die Zelle groß genug und die Umgebung günstig für die Zellteilung, 

so geht sie in die S-Phase über. Zellen in der G 1 -Phase können aus diesem Zyklus 

ausscheren und für Minuten bis Jahre in der G 0 -Phase verharren. 

Die Ursprungszelle teilt sich am Ende des Zellzyklus in zwei Tochterzellen. Damit 

die beiden Tochterzellen die komplette Erbinformation des Organismus besitzen, 

muss vorher eine Kopie des Erbgutes erstellt werden. Dies wird in der relativ kurzen 

S-Phase erreicht, in der das gesamte Genom repliziert wird. Auch hier existiert ein 

Kontrollpunkt, der sicherstellt, dass die Zelle erst nach der Replikation in die nächste 

Phase eintritt. 

Mit der G 2 -Phase, in der am G 2 -Kontrollpunkt nochmal die optimalen Bedingungen 

für eine Zellteilung und die Vollständigkeit der DNA-Replikation überprüft 

werden, endet die in der G 1 -Phase begonnene Interphase und die eigentliche Zellteilung 

in der Mitose beginnt. 

In der Mitose kommt es zu starken Veränderungen der Zellmorphologie: Das Chromatin, 

mit Proteinen verbundene DNA, das vorher im Zellkern verteilt ist, kondensiert 

zu dicht gepackten Chromosomomen, die aus je zwei Chromatiden bestehen, 

welche die beiden Kopien des Erbgutes enthalten. Die Kernmembran wird abgebaut. 

In dem folgenden Organisationsprozess werden alle Chromatidenpaare getrennt und 

von zwei neuen Kernhüllen umschlossen. Nach dieser Kernteilung folgt die cytoplasmatische 

Teilung, in der sich die gesamte Zelle in die Tochterzellen aufteilt. Mit ihr 

beginnt der Zellzyklus erneut (Überblick in: Alberts u. a. 1994). 

5



1.1.4 Die biologische Wirkung ionisierender Strahlung 

1.1.4.1 Schädigung der DNA 

Die biologische Wirkung von ionisierender Strahlung geht, wie eingangs geschildert, 

primär auf Veränderungen an der DNA zurück, die DNA-Schäden auslösen. Werden 

die DNA-Schäden nicht oder nur fehlerhaft repariert, kann dies zu Mutationen, 

Transformationen oder dem Tod der Zelle führen. Die Schäden können sich als Basenschäden, 

oder Einzel- und Doppelstrangbrüche der DNA-Doppelhelix äußern. Unter 

diesen stellen Doppelstrangbrüche die schwerwiegendste Form der Schädigung dar, 

die eine Zelle nach ionisierender Strahlung erleiden kann. Wenn sie lokal gehäuft 

auftreten, kann der Verlust komplementärer Information die Integrität der DNA zerstören 

(Roots u. a. 1989). 

Die Erzeugung von Doppelstrangbrüchen ist zwischen dicht- und dünnionisierender 

Strahlung nicht signifikant unterschiedlich (Heilmann u. a. 1995). Die Fähigkeit der 

Zelle, die nach verschiedenen Strahlungsarten auftretenden Doppelstrangbrüche zu 

reparieren, unterscheidet sich jedoch. Es wurde gezeigt, dass die Doppelstrangbrüche, 

die von niederenergetischen Ionen induziert wurden, sehr viel schlechter repariert 

werden, als die Doppelstrangbrüche, die nach Bestrahlung mit Röntgenstrahlung 

oder hochenergetischen Ionen auftreten (Taucher-Scholz u. a. 1996, Heilmann u. a. 

1996). Es wird diskutiert, dass diese strahlenspezifische Reparaturfähigkeit mit der 

räumlichen Verteilung der Ionisationsereignisse der verwendeten Strahlung zusammen 

hängt. Es wurde bereits gezeigt, dass aus Bestrahlung mit hohem LET eine 

erhöhte Fragmentierung der DNA resultiert (Löbrich u. a. 1998). 

1.1.4.2 Reparatur der DNA 

Beschädigungen der DNA bedrohen die genetische Stabilität der Zelle. Aus diesem 

Grund hat die Zelle im Laufe der Evolution ein System zur Erkennung und Reparatur 

von DNA-Schäden entwickelt, das durch Enzyme gesteuert wird (Kohn 1999). 

Die Reparatur wird dabei hauptsächlich durch die Basenexzisionsreparatur (BER), 

homologe Rekombination (HR) und das „non-homologous end joining“ (NHEJ) erreicht 

(Überblick in: Hoeijmakers 2001), wobei die BER primär für die Beseitigung 

oxidativer Schäden an den Basen und von Einzelstrangbrüchen verantwortlich ist 

(Überblick in: Caldecott 2001). Doppelstrangbrüche können durch die HR und NHEJ 

repariert werden, wobei der Reparaturmechanismus vom Zellzyklus-Stadium der Zelle 

ab hängig ist. Die HR findet vorwiegend in der S- und G 2 -Phase statt, wo sie mit 

Hilfe der Schwerster-Chromatide – seltener mit dem homologen Chromosom – durchgeführt 

wird (Johnson und Jasin 2000). Mit dem NHEJ können die freien Enden der 

DNA-Doppelhelix dagegen ohne eine Matrize zusammengefügt werden. 

6


1.1.4.3 Zellzyklus-Verzögerungen 

Die Folge der DNA-Schädigung und Reparatur sind Störungen im Ablauf des Zellzyklus. 

Es wird diskutiert, dass durch Zellzyklus-Verzögerungen die Zeit zur Reparatur 

der Schäden verlängert wird. Dies wird u. a. durch die beiden Zellzyklus-Proteine 

p53 und p21 (CDKN1A) vermittelt. Nach Schädigung der DNA durch Bestrahlung, 

chemische Agenzien und andere Faktoren steigt die Proteinmenge an p53 in der Zelle 

an. Das Protein p53 bewirkt u. a. eine Expression des Proteins p21 (CDKN1A), welches 

einen Zellzyklus-Arrest auslösen kann, indem die Aktivität der zyklinabhängigen 

Kinasen inhibiert wird (Überblick in: Vogelstein u. a. 2000). Die Folge sind Verzögerungen 

des Zellzyklus, wobei insbesondere der G 1 -Arrest beschrieben (Di Leonardo 

u. a. 1994) und auch molekular gut charakterisiert ist (Überblich in: Bartek und Lukas 

2001). Bei einem transienten Arrest ist die Reparatur so weit abgeschlossen, dass 

die Zelle weiter durch den Zellzyklus laufen kann (Di Leonardo u. a. 1994). Es wird 

diskutiert, dass Zellen nach irreparabler Schädigung entweder durch permanenten Arrest, 

gefolgt von Differenzierung und Seneszenz (Rodemann u. a. 1991, Di Leonardo 

u. a. 1994, Ross 1999) oder apoptotischen Zelltod aus dem Zellzyklus ausscheiden können 

(inaktiviert werden) (Überblick in: Ross 1999). Fibroblasten können dabei durch 

Differenzierung und Seneszenz auch nach starker Schädigung noch als postmitotische 

Zellen eine Funktion im Organismus übernehmen, während z. B. Lymphozyten 

überwiegend durch Apoptose inaktiviert werden (z. B. Hertveldt u. a. 1997). 

1.1.4.4 Strahlung und Krebs 

Die Mutation des p53-Gens ist die häufigste genetische Läsion (mehr als 50 % der 

Erkrankungen) bei einigen Krebsarten des Menschen, und es ist wahrscheinlich, dass 

hier ein Zusammenhang zwischen Schaden, Schadenserkennung, Zellzyklus-Arresten 

und der Entstehung vieler Krebsarten vorliegt (Überblick in: Carson und Lois 1995). 

Im gesunden Organismus liegt ein ausgewogenes Verhältnis zwischen Zellteilung 

und Zelltod vor. Abgestorbene Zellen werden durch Zellteilung im gleichen Maße 

ersetzt. Bei der Entstehung von Krebs wird dieses Gleichgewicht nachhaltig gestört. 

Eine Zelle, die bisher der Regulierung des Zellzyklus unterstand, verändert sich und 

teilt sich unkontrolliert. Diese ungebremste Teilungsaktivität führt zur Bildung eines 

Tumors, der in seinem Wachstum die Grenzen des umgebenden Gewebes ignoriert 

und es dadurch zerstört. Die Ursache hierfür liegt in Veränderungen des Erbgutes 

der einzelnen Zelle, die später den Tumor bildet. Der Prozess der Tumorentstehung 

kann sich dabei über große Zeiträume erstrecken und viele einzelne Stationen umfassen. 

Die Progressionsrate kann jedoch sowohl durch mutagene als auch durch nichtmutagene 

Substanzen beschleunigt werden (Tumorinitiatoren, bzw. Tumorpromoter) 

(Überblick in: Alberts u. a. 1994). 

Durch Strahlung können Veränderungen im Erbgut erzeugt werden. Häufig werden 

diese durch das zellinterne Reparatursystem beseitigt. Durch hohe Strahlendosen 

7



und lang andauernde Einwirkung können jedoch auch zu viele bzw. zu komplexe 

Schäden entstehen, die vom Reparatursystem nicht bewältigt werden können. In den 

meisten dieser Fälle wird die Zelle inaktiviert. Es ist aber auch möglich, dass die Zelle 

weiter proliferiert und fortan ein verändertes Erbgut besitzt. Dies wäre ein Schritt 

zur Entstehung von Krebs, für den endgültigen Ausbruch der Krankheit müssen 

aber derartige Veränderungen an verschiedenen kritischen Bereichen des Genoms 

stattgefunden haben (Überblick in: Alberts u. a. 1994). 

1.2 Physikalische Grundlagen 

1.2.1 Eigenschaften ionisierender Strahlung 

Die kovalente chemische Bindung ist die stabilste Valenzbindung in der Natur und 

wird durch Elektronen vermittelt. Besitzen Strahlen mindestens eine Energie von 

10 eV, so sind sie in der Lage, Atome bzw. Moleküle zu ionisieren. Die ionisierenden 

Strahlen erzeugen dabei Elektronen-Ionen-Paare, es können Bindungs-Elektronen aus 

dem Molekül herausgelöst werden. Wird ein fehlendes Elektron nicht schnell genug 

ersetzt, kann dies zum Aufbrechen einer chemischen Bindung im Molekül führen. Es 

lässt sich hierbei die direkte und indirekte Strahlenwirkung unterscheiden. Bei ersterer 

wird durch die Ionisierung eine Bindung am Zielmolekül (DNA) selbst aufgebrochen. 

Im letzteren Fall werden umgebende Moleküle (z. B. Wasser) zu hochreaktiven 

Radikalen ionisiert, die schließlich das Zielmolekül schädigen (Überblick in: Kiefer 

1989). 

Bei diesen Prozessen wird durch die Strahlung Energie in die Materie abgegeben. 

Die räumliche Verteilung der Energieabgabe und der daraus folgenden Ionisationsereignisse 

ist für verschiedene Arten von Strahlung unterschiedlich und hat Einfluss 

auf deren biologische Wirkung (Kraft 1990, Heilmann u. a. 1993, Krämer und Kraft 

1994). Sie führt zu einer Unterteilung von dicht und dünn ionisierender Strahlung. 

In der Strahlenbiologie quantifiziert man die Unterschiede durch den Linearen 

Energie Transfer (LET), also die Energie, die vom Primärstrahl auf das Zielvolumen 

pro Wegstrecke übertragen wird. Im allgemeinen wird der LET in der Einheit 

keV angegeben. Dicht ionisierende Strahlung liegt deutlich über einem LET von 

µm 

10 keV , dünn ionisierende darunter. Zu dicht ionisierenden Strahlen gehören die schweren 

Ionen von denen in dieser Arbeit Kohlenstoff verwendet wird. Dünn ionisierend 

µm 

sind elektromagnetische Strahlen wie Röntgen und Gamma Strahlen sowie Elektronen. 

Elektromagnetische Strahlung produziert Ionisation und freie Elektronen über 

Photoeffekt, Comptoneffekt und Paarbildung, stochastisch auftretende, d. h. unkorrelierte 

Prozesse, welche die Ionisationen im allgemeinen in Abständen produzieren, 

die erheblich größer sind als der Durchmesser der DNA (Überblick in: Kiefer 1989). 

Ionenstrahlen wie z. B. die in dieser Arbeit benutzten Kohlenstoff-Ionen wechselwirken 

durch Coulomb-Kräfte, vor allem mit den Elektronen der Targetmolelüle und er- 

8

1.2 Physikalische Grundlagen 

Abbildung I 1.2: Simulation der Ionisationsereignisse durch δ-Elektronen entlang einer 

Teilchenspur von Kohlenstoff-Ionen mit hoher und niedriger Energie. Bei hoher Energie 

treten weniger Ereignisse auf als bei niedriger Energie. Zur Demonstration der Reichweite 

sind exemplarisch die Dimensionen der DNA eingezeichnet (aus: Krämer und Kraft 1994). 

zeugen so längs ihrer Trajektorie eine Spur von dicht liegenden Ionisationsereignissen 

und Elektronen (Überblick in: Kraft 1987). In Abbildung I 1.2 werden die Elektronenspuren 

von einem hochenergetischen (noch dünn ionisierenden) Kohlenstoff-Ion 

und einem niederenergetischen, dicht ionisierenden Kohlenstoff-Ion mit den Dimensionen 

eines schematisch dargestellten DNA-Moleküls verglichen. Die dichte Ionisation 

führt zu einer Anhäufung von Schäden, die eine Veränderung der biologischen Wirkung 

bedingen (Überblick in: Krämer und Kraft 1994). 

1.2.2 Dosis und RBE 

Physikalischer Parameter zur Quantifizierung von Strahleneffekten ist die Dosis. Sie 

ist definiert als die deponierte Energie pro Masseneinheit und wird in Gray angegeben 

(Nach: ICRU Report Nr. 60 1998): 

D [Gy] = d¯ɛ 

dm 

[J] 

[kg] 

(1) 

D : Absorbierte Dosis 

¯ɛ : Mittlere übermittelte Energie 

m : Masse an Materie 

Die unterschiedlichen Arten der Energiedeposition bei dünn und dicht ionisierenden 

Strahlen führen dazu, dass ein biologischer Effekt bei gleicher applizierter Dosis 

9



eine qualitativ und quantitativ unterschiedliche Ausprägung zeigen kann. Mit der 

relativen biologischen Wirksamkeit (relative biological effectiveness, RBE) lässt sich 

die Strahlartabhängigkeit eines solchen Effektes quantifizieren (Überblick in: Kiefer 

1989). 

Als Bezugspunkt wird üblicherweise eine standardisierte Referenzstrahlung 

(250 kV Röntgenstrahlung) benutzt. Berechnet wird die RBE aus dem Verhältnis 

der absorbierten Dosis der Referenzstrahlung und der Teststrahlung bei der 

beide einen gleich großen biologischen Effekt auslösen (Nach: ICRU Report Nr. 60 

1998): 

RBE = D γ 

D I 

∣ 

∣∣∣Isoeffekt 

(2) 

RBE : Relative Biologische Wirksamkeit (relative biological effectiveness) 

D γ : Absorbierte Dosis bei Referenzstrahlung und gleicher Wirkung 

D I : Absorbierte Dosis bei Teststrahlung und gleicher Wirkung 

1.3 Allgemeines 

1.3.1 Quellen ionisierender Strahlung 

Ionisierende Strahlung entstammt natürlichen und künstlichen Quellen (Tabelle 

I 1.1). Eine natürliche Quelle ionisierender Strahlen ist zum einen die kosmische 

Strahlung, die aus dem Weltall auf unsere Atmosphäre trifft und zum anderen die terrestrische 

Strahlung, die beim radioaktiven Zerfall natürlicher Substanzen der Erdrinde 

entsteht (zum Beispiel bei Radon-Isotopen). Die Intensität der kosmischen Strahlung 

hängt vor allem von der Höhe über dem Meeresspiegel ab, sie spielt daher eine 

Tabelle I 1.1: Mittlere Strahlenexposition der Bevölkerung der Bundesrepublik Deutschland 

und ihre natürlichen und künstlichen Quellen (nach: Junkert u. a. 2002) 

Quellen der Strahlung 

Natürliche Direkte kosmische Strahlung 0,3 

Direkte terrestrische Strahlung 0,4 

Nahrung 0,3 

Inhalation von Radon und seinen Zerfallsprodukten 1,1 

Künstliche Kerntechnische Anlagen

1.3 Allgemeines 

Rolle bei der bemannten Raumfahrt (z. B. Yang u. a. 1997) und dem Luftfahrtverkehr 

(Benton und Benton 2001, Kraft 2001). 

Seit der Entdeckung der nach ihm benannten Strahlen durch Wilhelm Conrad 

Röntgen im Jahr 1895 erzeugt der Mensch bewusst ionisierende Strahlung. Mit Radiodiagnostik, 

Nuklearmedizin und Strahlentherapie entstammt ein wesentlicher Teil 

medizinischen Quellen. Daneben tragen Baustoffe und Gebrauchsgegenstände zu unserer 

Strahlenexposition bei (Junkert u. a. 2002). Der Konsum von Tabakrauch, in 

dem radioaktive Isotope der Elemente Blei und Polonium enthalten sind, sei hier 

besonders betont (Kilthau 1996). Letztlich tragen auch radioaktive Emissionen kerntechnischer 

Anlagen zu einem geringen Teil zur Strahlenbelastung bei (Junkert u. a. 

2002). 

Den Effekt, den diese Strahlen auf Organismen, also auch auf den Menschen, haben, 

versucht die Disziplin der Strahlenbiologie aufzuklären. Das dabei erworbene Wissen 

dient unter anderem als Grundlage für viele Anwendungen von Strahlen. Gegenüber 

der häufig übersteigerten Sorge um ionisierende Strahlen tritt dieser Aspekt aber oft 

zurück. So gelingt es nur in seltenen Fällen, den nutzbringenden Einsatz ionisierender 

Strahlung in den Vordergrund zu bringen. An der Gesellschaft für Schwerionenforschung 

(GSI) stellt die Tumortherapie mit schweren Ionen einen derartigen Transfer 

von der Grundlagenforschung zur Anwendung dar (Eickhoff u. a. 1999, Kraft 1998). 

1.3.2 Tumortherapie mit schweren Ionen an der GSI 

Bei der Behandlung von Krebs, ist es das Ziel, das erkrankte Gewebe aus dem Körper 

zu entfernen oder abzutöten, dabei aber gesundes Gewebe zu schonen. Wo die chirurgischen 

Mittel eine solche vollständige Beseitigung des Tumors nicht ermöglichen, 

versucht man dies durch den Einsatz von Strahlen zu erreichen. 

In der konventionellen Strahlentherapie werden derzeit vor allem Photonen aus 

hochenergetischer Röntgenbremsstrahlung aus Elektronenbeschleunigern verwendet. 

Sie besitzen im Vergleich zu den niederenergetischen Strahlen eine günstigere Tiefendosisverteilung 

(Abbildung I 1.3), d. h. eine relativ hohe Dosis bei großer Eindringtiefe. 

Dieses Dosisprofil kann nur noch durch die Verwendung von Ionenstrahlen wie 

Protonen oder schwereren Ionen wie Kohlenstoff verbessert werden (Abbildung I 1.3). 

Dort wird ein Maximum der Dosis am Ende der Reichweite deponiert und führt zu 

einer weiteren Steigerung der Tumordosis im Vergleich zu den Protonen. 

Entscheidend für die Wahl der schweren Ionen ist die zusätzliche Potenzierung des 

Strahlenschadens auf Grund der dort erhöhten RBE. Während die RBE im Eingangskanal 

niedrig bleibt (1 ≤ RBE ≤ 2) erreicht man im Tumor drei- bis fünffach erhöhte 

RBE-Werte. Damit lässt sich die Inaktivierung der Tumorzellen weiter steigern, ohne 

das Normalgewebe im Eingangsbereich wesentlich stärker zu belasten (Überblick in: 

Kraft 1990). 

Die klinischen Ergebnisse der Kohlenstofftherapie sind so erfolgreich, dass dafür in 

11



Heidelberg ein Therapiezentrum gebaut wird (Debus u. a. 1998). Gleichzeitig ist aber 

die erhöhte biologische Wirkung am Ende der Reichweite ein wesentlicher Ansatz zu 

weiteren, vor allem biologischen Fragestellungen, wie die in dieser Arbeit untersuchten 

Einflüsse von Ionenbestrahlung auf die Zellproliferation. 

Abbildung I 1.3: Tiefendosisprofil verschiedener Strahlenarten. Die Dosis der Röntgenstrahlung 

sinkt mit dem Eintritt in das Target ab, bei 18 MeV 

u 

Photonen- und Co-γ-Strahlung 

sinkt sie ebenfalls nach Überwinden des Aufbaueffekts ab, während die Ionenstrahlen zuerst 

nur wenig Energie deponieren, bis sie am Ende ihrer Reichweite bei 17 cm im Bragg- 

Maximum eine sehr hohe Dosis erzeugen (aus: Weber 1996). 

12

2 Zielsetzung dieser Arbeit 

Die Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit sollten sich auf Veränderungen der 

Zellzyklus-Progression und die Induktion von Chromosomenschäden erstrecken und 

dabei auch den Einfluss von BrdU (5-Brom-2’-desoxyuridin) auf das Modellsystem 

berücksichtigten. Insbesondere die Zellzyklus-Effekte sollten mit verschiedenen Methoden 

über einen längeren Zeitraum nach der Bestrahlung untersucht werden. Dabei 

wurde der Einfluss verschiedener Strahlenarten durch den Einsatz von niederenergetischen 

Kohlenstoff-Ionen ( 12 C, 11 MeV ) und Röntgenstrahlung (250 kV) verglichen. 

u 

Für die Experimente wurden primäre diploide Hautfibroblasten der Zelllinie 

AG 1522 eingesetzt, die nach mehreren Passagen als Sekundärkultur in vitro in der 

G 0 /G 1 -Phase synchronisiert bestrahlt wurden. Hautfibroblasten sind ein strahlenbiologisches 

Modell, das den Bindegewebszellen im Organismus ähnlicher ist als etablierte 

Zelllinien, da bei ihnen Zellzyklus-Arrest, beschleunigte Differenzierung und 

Seneszenz auftreten. Außerdem sind die Haut und Bindegewebe bei jeder Art von 

Bestrahlung immer betroffen, weshalb Fibroblasten ein gut untersuchtes Modell für 

das Normalgewebe von Patienten der Strahlentherapie darstellen (Rodemann u. a. 

1991, Herskind u. a. 1998). Für die im Rahmen dieser Arbeit verwendete Zelllinie liegen 

Vergleichsdaten zur Wirkung von schweren Ionen vor (Füssel 1997, Größer 1998, 

Fournier 1999, Azzam u. a. 2000, Kawata u. a. 2001). 

Es wird diskutiert, dass Zellzyklus-Verzögerungen der Zelle Zeit zur Reparatur 

von Schäden an der DNA geben und auf diese Weise die Vererbung von Schäden 

an Tochterzellen und somit schwerwiegende Folgen für den Gesamtorganismus verhindert 

werden. Das Auftreten strahlenbedingter Zellzyklus-Verzögerungen bei Fibroblasten 

sollte mit vier Methoden, der kontinuierlichen BrdU-Markierung, dem 

Hoechst-BrdU-Quenching, der vorzeitigen Chromosomenkondensation und der Bestimmung 

des Mitoseindex untersucht werden. Ziel war es, Dauer und Ausmaß des 

transienten und permanenten Zellzyklus-Arrest für die zwei Strahlenqualitäten innerhalb 

des Untersuchungszeitraums zu vergleichen und aufzuzeigen, ob sie vornehmlich 

in der G 0 /G 1 -Phase oder auch in G 2 - und anderen Phasen des Zellzyklus auftreten 

können. Zum anderen waren die Untersuchungen von Berger (2001) zum Einfluss von 

BrdU auf die Zellzyklus-Progression weiterzuführen. 

Daneben sollte in Chromosomenpräparaten von AG-Zellen mittels zweier Methoden, 

der vorzeitigen Chromosomenkondensation durch Calyculin A (Durante u. a. 

1998) und der etablierten Methode der Metaphasen-Anreicherung durch Colcemid 

(IAEA Report Nr. 260 1986), die durch Strahlung hervorgerufene Art und Zahl der 

Chromosomenschäden im Zeitraum von 30 bis 70 Stunden untersucht werden. Da die 

13


Kapitel 2 – Zielsetzung dieser Arbeit 

Analyse von Chromosomenschäden eine weithin genutzte Methode zur Untersuchung 

der Strahlenwirkung ist, sollte auch diskutiert werden, inwieweit das Auftreten von 

Zellzyklus-Verzögerungen bei deren Anwendung in Hinblick auf eine mögliche Unterschätzung 

des Strahlenschadens berücksichtigt werden muss. 

Da bei Berger (2001) diskutiert wird, dass BrdU einen Einfluss auf die Zellzyklus- 

Progression von Fibroblasten hat, war dieser Aspekt in dieser Arbeit mittels Bestimmung 

der Wachstumskinetik und des Mitoseindex zu konkretisieren. Zu untersuchen 

war hierbei, wann und in welcher Zellzyklus-Phase Veränderungen durch den Einsatz 

von BrdU auftreten und wie stark sich diese in Form von Zellzyklus-Arresten 

auswirken. Dieser Aspekt sollte auch für die BrdU-abhängigen Messmethoden (kontinuierliche 

BrdU-Markierung und Hoechst-BrdU-Quenching) überprüft werden. 

Die Zellzyklus-Verteilung bei Fibroblasten, ihr Zusammenhang mit der Analyse von 

Chromosomenaberrationen und dem Einfluss von BrdU wurde nach Bestrahlung mit 

Kohlenstoff-Ionen und Röntgenstrahlung bisher in keiner anderen Arbeit miteinander 

verglichen. 

14

Teil II 

Material und Methoden 

15

1 Zellen und Kultivierungsmethoden 

Alle im Folgenden verwendeten Chemikalien und Geräte sind mit ihrem Hersteller 

bzw. den Bezugsquellen im Anhang aufgeführt (Anhang A). Ferner finden sich dort 

auch die detaillierten Rezepturen zu allen eingesetzten Lösungen. 

1.1 Verwendete Zellen 

Alle Experimente wurden mit humanen Fibroblasten der Zelllinie AG01522C durchgeführt. 

Die Zelllinie wurde vom Coriell Institute for Medical Research (Camden, NJ, 

USA) als Sekundärkultur bezogen. Die Primärzellen stammen aus dem Bindegewebe 

der Vorhaut eines gesunden, drei Tage alten Säuglings. Im Folgenden wird für sie die 

Bezeichnung AG-Zellen verwendet. Bei den AG-Zellen handelt es sich um adhärent 

wachsende Zellen. Unter Kulturbedingungen wachsen sie auf der Wachstumsunterlage 

einschichtig (Monolayer), bei Erreichen der Konfluenz werden sie durch Kontaktinhibition 

in der G 0 /G 1 -Phase angereichert. 

1.2 Verfahren zur Zellkultivierung 

Im Vorfeld der in dieser Arbeit durchgeführten Methoden mussten, ausgehend von 

eingefrorenen Zellen aus früheren Experimenten, genügend Zellen durch geeignete 

Kultivierungsmethoden herangezüchtet werden. Außerdem mussten die Zellen nach 

der Bestrahlung weiter kultiviert und zu bestimmten Zeiten Proben entnommen werden. 

Um beide Vorgaben zu erfüllen wurden die Zellen nach den folgenden Protokollen 

behandelt (Paul 1980). 

1.2.1 Lagerung der Zellen 

Für diese Arbeit wurden Fibroblasten benutzt, deren kumulative Populationsverdoppelungen 

(cumulative population doublings, CPD, Abschnitt II 1.2.5) beim Auftauen 

bei 16,9 und 15,6 lag und die im Rahmen einer vorhergehenden Arbeit als Reserve 

eingefroren wurden (Berger 2001). Zur Langzeitlagerung wurden diese Zellen in Tiefkühlmedium 

(Tabelle A.2.2) bei −196 °C in flüssigem Stickstoff in einer Zelldichte 

von 1–2·10 6 Zellen in Kryoröhrchen eingefroren. Zum Auftauen wurden die Kryoröhrchen 

aus dem Stickstofftank entnommen und durch kurzes Aufschrauben entgast, 

ml 

um ein Explodieren durch ausdehnenden Stickstoff zu verhindern. Danach wurde die 

17

Teil II – Material und Methoden 

Kapitel 1 – Zellen und Kultivierungsmethoden 

Zellsuspension in den Kryoröhrchen zügig in einem Wasserbad bei 37 °C aufgetaut 

und in eine mit 15 ml warmem Nährmedium (Tabelle A.2.1) gefüllte Kulturflasche 

von 75 cm 2 gegeben. Nach drei Stunden wurden das alte Einfriermedium und die 

toten Zellen durch Ersetzen des Mediums entfernt und die Anheftungseffizienz im 

Lichtmikroskop abgeschätzt, sie lag bei 80 %. 

1.2.2 Kultivierung der Zellen 

Für die Kultivierung der Zellen mussten die für ein optimales Wachstum notwendigen 

Bedingungen geschaffen werden. Dazu mussten zum einen adäquate Umgebungsverhältnisse 

geschaffen werden, zum anderen musste die Nährstoffversorgung der Zellen 

sichergestellt werden. 

Die Kultivierung der Zellen fand in Kulturflaschen und -schalen in Inkubatoren 

statt (95 % rel. Luftfeuchtigkeit, 5 % CO 2 , 37 °C). Die Flüssigkeitshöhe des Nährmediums 

betrug 2 mm, um die Sauerstoffdiffusion zu gewährleisten. Je nach Größe der 

Kulturflaschen (75 cm 2 , 25 cm 2 , 12,5 cm 2 ) wurden dafür unterschiedliche Volumina 

an Nährmedium (Tabellen A.1.1 und A.2.1) hinzugegeben (15 ml, resp. 5 ml und 

2,5 ml). Das verbrauchte Nährmedium wurde, soweit nicht anders angegeben, im 

Rhythmus von drei und vier Tagen durch frisches ersetzt. 

1.2.3 Synchronisierung der Zellen 

Für alle Experimente wurden in der G 0 /G 1 -Phase synchronisierte Zellen verwendet. 

Zur Synchronisierung wurden die Zellen in Kulturflaschen ausgesät und bis zum Erreichen 

der Konfluenz kultiviert. Da die AG-Zellen bei konstanter Nährstoffversorgung 

und genügend geringem Zellalter kontinuierlich auf ihrer Wachstumsunterlage wachsen, 

bilden sie schließlich einen geschlossenen Monolayer. Danach stellen sie auf Grund 

der Kontaktinhibition ihre Teilungsaktivität ein und treten in die G 0 /G 1 -Phase des 

Zellzyklus ein. In diesem Zustand lassen sich die Zellen über Wochen bei Kulturbedingungen 

halten. Durch Lösen der Kontaktinhibition und durch Neuaussaat in 

geringerer Zelldichte treten die Zellen synchron wieder in den Zellzyklus ein. Die Synchronität 

der Zellen wurde mittels Flusszytometrie kontrolliert (Abschnitt II 3.2.3.2), 

demnach befanden sich zur Bestrahlung 90 % der Zellen in der G 0 /G 1 -Phase. 

1.2.4 Ernten der Zellen 

Da die Zellen adhärent auf dem Gefäßboden wachsen, das heißt eine feste Verbindung 

mit ihrer Wachstumsunterlage eingehen, müssen sie zur Subkultivierung und für verschiedene 

Experimente, bei denen der Zellverband aufgelöst werden soll, von dieser 

Wachstumsunterlage getrennt und vereinzelt werden. Dazu wurde das Nährmedium 

entfernt und der Zellrasen mit 2–3 ml EDTA-Trypsinlösung gespült (Tabelle A.1.1). 

18

1.2 Verfahren zur Zellkultivierung 

Trypsin ist ein Verdauungsenzym, das die Verbindung der Zellen zu ihrer Wachstumsunterlage 

auflöst, durch EDTA werden Calcium-abhängige Zell-Zell-Verbindungen gelöst. 

Anschließend wurden die Zellen mit EDTA-Trypsinlösung überschichtet (3 ml 

bei 75 cm 2 bzw. 2 ml bei 12,5 cm 2 , 5 min, 37 °C) und danach mit einer Glaspipette 

durch mehrmaliges Ansaugen vereinzelt. Durch Zugabe des dreifachen Volumens 

an Nährmedium (Tabelle A.2.1) wurde das Verdauungsenzym schließlich abgestoppt. 

Zur Bestimmung der Zellzahl wurde der Zellsuspension ein Aliquot (0,2 ml) in isotonischer 

Lösung (10 ml, Tabelle A.1.1, Isoton) entnommen und in einem elektronischen 

Zellzählsystem (Casy1, Tabelle A.4.1) nach dem Coulter-Prinzip gemessen. Dabei 

wird die Widerstandsänderung aufgezeichnet, die jede Zelle beim Durchtritt durch 

einen Kanal mit einer Mikroelektrodenanordnung verursacht und daraus Zellzahl und 

Zellgröße bestimmt (Coulter 1956). 

1.2.5 Altersbestimmung der Zellen 

Das Alter der Zelle ist ein wichtiger Parameter für die Kultivierung und die Beurteilung 

der Ergebnisse. Die verwendeten AG-Zellen sind nicht immortalisiert, sie 

unterliegen also der Alterung und Differenzierung (Bayreuther u. a. 1988). Der Grad 

der Differenzierung steigt mit der Anzahl an Zellteilungen, welche die Zelle durchgeführt 

hat. Zur Beschreibung des Alters einer Zellkultur werden daher nach jeder 

Passage die kumulativen Populationsverdoppelungen (cumulative population doublings, 

CPD) berechnet und protokolliert: 

CP D neu = CP D alt + ln N N 0 

ln 2 

Dabei bedeutet N die Anzahl der geernteten Zellen und N 0 die Anzahl der zuvor 

eingesäten Zellen. CP D alt ist die CPD der vorherigen Passage. Die Anheftungseffizienz 

nach einer Passage liegt im Bereich der Messgenauigkeit der Zellzahlbestimmung 

und konnte daher bei der Berechnung der CPD vernachlässigt werden. Wie 

bereits eingangs erwähnt hatten die Zellen zum Zeitpunkt ihres Auftauens eine CPD 

von etwa 16. Zu Beginn der Bestrahlung hatten sie eine CPD von etwa 22. 

(3) 

1.2.6 Subkultivierung der Zellen 

Um genügend Zellen für die Experimente zu gewinnen, wurden die Kulturen nach 

dem Erreichen der Konfluenz zur Subkultivierung passagiert und in geringerer Zelldichte 

(6,5·10 3 Zellen ) in mehreren Kulturflaschen neu ausgesät. Zur Aussaat wurden 

cm 2 

die trypsinierten Zellen mit vorgewärmten Nährmedium auf die benötigte Zellkonzentration 

verdünnt und die Zellsuspension in die Kulturflaschen pipettiert. Zur Protokollierung 

wurde die aktuelle CPD ermittelt und die Passagennummer der Kultur 

um eins erhöht. 

19


Kapitel 1 – Zellen und Kultivierungsmethoden 

1.2.7 Sterilität 

Alle Arbeiten an Zellen wurden in einer sterilen Werkbank (Laminar-Flow Box, Tabelle 

A.4.1) mit sterilen Materialien durchgeführt. Nach Abschluss der Experimente 

wurden nicht fixierte Zellen mittels Helipur (4 % Endkonzentration, Tabelle A.1.1) 

mindestens 30 min inaktiviert und danach entsorgt. 

Hitzebeständige trockene Materialien (Glaswaren, Tabletts) wurden durch Heißluft 

sterilisiert (6 h, 180 °C); Lösungen, Wasser und Kunststoffartikel wurden autoklaviert 

(25 min, 2 bar, 121 °C). Nicht autoklavierbare Flüssigkeiten wurden sterilfiltriert 

(Porengröße 0,2 µm). Die Probenmagazine für die Bestrahlungsanlage am Linearbeschleuniger 

(universal linear Accelerator, UNILAC, Abschnitt II 2.2.1) wurden mit 

Ethanol (70 %) und UV-Licht (2 h) entkeimt. 

20

2 Bestrahlung 

2.1 Vor- und Nachbereitung der Zellen 

Um genügend synchronisierte G 0 /G 1 -Zellen für die Bestrahlungsexperimente zur Verfügung 

zu haben, wurden 10– 14 Tage vor dem Bestrahlungszeitpunkt Zellen in einer 

Zelldichte von 12,5·10 3 Zellen ausgesät. Der letzte Wechsel des Nährmediums wurde 

cm 2 

mindestens einen Tag vor der Bestrahlung durchgeführt. Der Transport der Zellen zur 

Bestrahlungseinrichtung erfolgte in geschlossenen Behältern. Die nicht zu bestrahlenden 

Kontrollzellen wurden für die Dauer der Bestrahlung ebenfalls aus dem Inkubator 

genommen, um sie den gleichen Bedingungen auszusetzen. 

Nach der Bestrahlung wurden die Zellen zur Lösung der Kontaktinhibition trypsiniert 

(Abschnitt II 1.2.4) und die Zellen gesammelt, die eine gleiche Dosis erhalten 

hatten (gepoolt). Unter Lichtabschluss wurde in das Nährmedium der Zellen BrdU 

gegeben (10 µmol , A.2.3). Danach wurden die Zellen in einer Zelldichte von 6 000 Zellen 

ml cm 2 

neu ausgesät. Zum besseren Lichtabschluss wurden die Kulturgefäße im Inkubator 

mit Aluminiumfolie abgedeckt. Durch den Einbau von BrdU wird die DNA photosensibilisiert, 

Lichteinfluss kann daher zu Chromosomenschäden führen und muss 

vermieden werden (Ikushima und Wolff 1974). 

2.2 Durchführung der Bestrahlung 

2.2.1 Bestrahlung mit Kohlenstoff-Ionen 

Die Bestrahlung mit schweren Ionen fand am UNILAC statt. Die in Petrischalen 

(⌀ 35 mm, 8,04 cm 2 ) ausgesäten Zellen wurden vorher senkrecht in ein steriles, mit 

Nährmedium befülltes Plexiglas-Magazin eingesetzt. Die Füllhöhe lag dabei knapp 

unter dem oberen Rand der Kulturschalen. Als Nährmedium wurde konditioniertes 

Medium benutzt, das bei vorhergehenden Mediumwechseln gesammelt wurde. 

Die dicht verschlossenen Magazine wurden zum Experimentierplatz X6 am 

UNILAC getragen, dort in die biologische Bestrahlungsanlage (BiBA) eingesetzt und 

geöffnet (Becher u. a. 2001). Bei der BiBA liegt das Strahl-Austrittsfenster in einem 

sterilen Plexiglasbehälter. Die Magazinhalterung wird von außen über einen PC 

gesteuert, so dass sich einzelne Magazinplätze gezielt anfahren lassen. Die Kulturschalen 

werden zur Bestrahlung von oben mit einem pneumatischen Sauger in den 

Strahlengang gehoben. 

Die Zellen wurden mit Kohlenstoff-Ionen ( 12 C) bestrahlt. Die Energie der Ionen 

wird beim Durchgang durch das Austrittsfenster und den Transmissions-Monitor 

21


Kapitel 2 – Bestrahlung 

von 11,4 MeV auf 11 MeV verringert, der LET beträgt hier 150 keV (Weinrich u. a. 

u 

u 

µm 

1991). Die Magazine waren so bestückt, dass alle Schalen mit der gleichen Dosis 

bestrahlt wurden. Zum Erreichen der geplanten Dosis wurde eine entsprechende Anzahl 

an Teilchen eingestrahlt (Abschnitt II 2.2.1 und Gleichung 4). Die Bestrahlung 

eines Magazins mit maximal 20 Proben dauerte je nach Höhe der Dosis zwischen 

15 und 30 Minuten. Die applizierten Dosen lagen zwischen 1 und 4 Gy, die Fluenzen 

zwischen 4 und 16·10 6 Teilchen . Die mittlere Fläche der Zellkerne betrug etwa 200– 

Fläche 

300 µm 2 (Größer 1998, Berger 2001). 

Nach der Bestrahlung wurden die Magazine wieder verschlossen und zurück zum 

Labor getragen. Dort wurden die Zellen aufgearbeitet. Bedingt durch die Form der 

Kulturschalen sammelte sich beim Herausheben aus dem Magazin ein Flüssigkeitstropfen 

am unteren äußeren Rand der Schale. Dieser Tropfen schattete die dahinter 

liegenden Zellen während der Bestrahlung ab, daher wurden diese Zellen vor der Aufarbeitung 

mit einem sterilen Wattestäbchen entfernt, um Dosisinhomogenitäten zu 

vermeiden. 

Für die Dosimetrie der Ionenstrahlen wurde ein Sekundärelektronen-Monitor (secondary 

electron monitor, SEM) verwendet, der einen Sekundärelektronenstrom 

misst, der proportional zur Strahlintensität ist. Zur Kalibrierung wurden Kunststoffplättchen 

aus CR-39 in leere Kulturschalen eingesetzt und den Zellen analog 

bestrahlt. Durch Ätzung in Natronlauge (5 N, 6–8 min) wurden die durch die Bestrahlung 

erzeugten Teilchenspuren sichtbar und die Fluenz lichtmikroskopisch ermittelt 

(Details in: Kirchner 1996). Diese Fluenz wurde mit den Pulsen des SEM 

Teilchen 

korreliert ( ) und ein direkter Bezug zwischen Fluenz und Dosis hergestellt 

Fläche · Puls 

(Kraft-Weyrather u. a. 1989, Gleichung 4). In den Experimenten betrug dieser Eichfaktor 

200– 300 Teilchen 

cm 2· . Puls 

[ ] [ ] 

keV 1 

[ 

D [Gy] = 1, 6 · 10 -9 · L ∆ · Φ 

µm cm 2 · ρ −1 

] 

cm 3 

g 

(4) 

D : Absorbierte Dosis 

L ∆ : Linearer Energietransfer 

Φ : Fluenz 

ρ : Dichte des Targetmaterials 

2.2.2 Röntgenbestrahlung 

Zur Referenz wurden Zellen auch mit Röntgenstrahlung bestrahlt. Dabei wurden 

geschlossene Kulturflaschen (25 cm 2 ) mit normalem Nährmedium verwendet. Als 

Strahlungsquelle diente eine Röntgenröhre IV320-13 (Seifert). Die Beschleunigungsspannung 

betrug 250 kV, die Stromstärke 16 mA. Die Anode bestand aus Wolfram, 

22

2.2 Durchführung der Bestrahlung 

die Folie des Austrittsfensters aus Beryllium. Zur Absorption der weichen Strahlbestandteile 

wurden Filter (Aluminium und Kupfer) mit 1 mm Dicke eingesetzt. Es 

wurden Dosen von 2 bis 16 Gy mit einer Dosisrate von 3 Gy bestrahlt wobei die 

min 

Zeit vom Ende der Inkubation über die Bestrahlung bis zur Aufarbeitung der Zellen 

zwischen 15 und 30 Minuten betrug. Bei Röntgenbestrahlung erfolgte die Dosimetrie 

mit einer Ionisationskammer (Stabdosimeter DL4, Pychlau), die nach Fricke und 

Hart (1966) kalibriert worden war. 

23


Kapitel 2 – Bestrahlung 

24

3 Messmethoden 

3.1 Rahmenbedingungen bei den Messungen 

Soweit nicht anders angegeben, wurden alle Messungen an AG-Zellen durchgeführt, 

die zum Zeitpunkt der Bestrahlung in der G 0 /G 1 -Phase synchronisiert waren (Abschnitt 

II 1.2.3). Nach Lösung der Kontaktinhibition (Abschnitt II 1.2.4) wurden die 

Zellen mit einer Zelldichte von 6000 Zellen ausgesät und zwischen 2–144 Stunden inkubiert 

(Abschnitt II 1.2.2). Zur Unterscheidung der durchlaufenen Zellzyklen wurde die 

cm 2 

Zellen immer mit BrdU im Nährmedium kultiviert(10 µmol ). Wurden für eine Methode 

Zellen in Suspension benötigt, so wurden sie vorher trypsiniert (Abschnitt II 1.2.4). 

ml 

Einen allgemeinen Überblick über den Untersuchungsbereich und die einzelnen Abschnitte 

der Methoden geben Abbildung II 3.1 und Abbildung II 3.2 . 

Abbildung II 3.1: Allgemeine Übersicht über die verwendeten Methoden. 

25


Kapitel 3 – Messmethoden 

Abbildung II 3.2: Schematische Darstellung des Bereiches, über den sich die Untersuchungen 

dieser Arbeit erstreckten. Der untersuchte Zeitraum betrug 144 Stunden, in denen 

Zellen bis zum dritten Zellzyklus betrachtet wurden. 

3.2 Durchführung der Messungen 

3.2.1 Wachstumskinetik 

Zur Untersuchung der Wachstumskinetik der AG-Zellen wurden die Zellen mit einer 

Dichte von 6 000 Zellen in Kulturflaschen (12,5 cm 2 ) mit Nährmedium ausgesät. Nach 

cm 2 

der Aussaat wurden die Zellen bis zu 12 Tage inkubiert und zu verschiedenen Zeiten in 

1–3 parallelen Proben trypsiniert und gezählt (Abschnitt II 1.2.4). Verglichen wurde 

dabei das Wachstum mit und ohne BrdU im Kulturmedium. 

Abbildung II 3.3: Übersicht über die Abschnitte der kontinuierlichen BrdU-Markierung 

26

3.2.2 Kontinuierliche BrdU-Markierung 


Mit der kontinuierlichen BrdU-Markierung lässt sich für einzelne Zellen nachweisen, 

ob und wann sie in die S-Phase des Zellzyklus eingetreten sind. Dazu wird dem Nährmedium 

das Nukleosid BrdU zugegeben, welches dann als Analogon in Konkurrenz 

zum intrazellulär synthetisierten Thymidin während der Replikation in die DNA eingebaut 

wird. Das in die DNA aufgenommene BrdU wird danach mit Antikörpern 

detektiert. Entsprechend lässt sich der Anteil an Zellen, welche die S-Phase erreicht 

oder durchlaufen haben, bestimmen. Im Umkehrschluss gewinnt man eine Aussage 

über den Anteil der Zellen, welche die G 0 /G 1 -Phase nicht verlassen haben. Dieser 

Anteil an nicht-markierten Zellen fällt bei weiteren Teilungen der markierten Zellen 

im Laufe der Zeit ab. Durchgeführt wurde die Methode mit einem vorgefertigtem Experimentiersatz 

(BrdU Labeling and Detection Kit II, Tabelle A.1.1). Eine Übersicht 

über die Abschnitte der Methode gibt Abbildung II 3.3. 

Nach der Bestrahlung wurden die Zellen in einer Dichte von 6 000 Zellen in Kulturschalen 

(⌀ 35 mm) homogen ausgesät und nach unterschiedlichen Zeitspannen in 

cm 2 

dieser Kulturschale untersucht. Dazu wurden die Zellen sauer fixiert (Ethanol/Glycin, 

20 min, −20 °C, pH 2,0, Tabelle A.2.8). Inkorporiertes BrdU wurde durch Inkubation 

(37 °C) mit einem monoklonalen Anti-BrdU-Antikörper (aus der Maus) 

markiert und durch einen zweiten Antikörper (Anti-Maus-Ig-AP) mit der daran 

konjugierten alkalischen Phosphatase detektiert. Nach Zugabe einer Substratlösung 

(BCIP(X-Phosphat)/NBT, Tabelle A.2.9) katalysiert die alkalische Phosphatase die 

Produktion eines dunkelblau gefärbten Präzipitates, das sich in den mit BrdU markierten 

Zellkernen niederschlägt. Zur Gegenfärbung wurde leicht basische Giemsa- 

Färbelösung benutzt (pH 7,5, Tabelle A.2.6), welche die nicht-markierten Zellen rot 

färbt. Zwischen allen Schritten wurde drei Mal mit PBS w / o 

gewaschen. Die Proben 

Abbildung II 3.4: Lichtmikroskopische Aufnahme von AG-Zellen nach kontinuierlicher 

BrdU-Markierung. Dunkel: Zellkerne, die BrdU aufgenommen, d. h. die S-Phase erreicht 

haben. Rot: Zellen, die nicht in die S-Phase eingetreten sind. (Maßstab: 10 µm). 

27



wurden danach nicht eingedeckt, sondern eingetrocknet, da das wasserlösliche Eindeckmedium 

die Gegenfärbung sonst auswäscht. 

Bei der Auswertung wurde im Lichtmikroskop das Verhältnis von BrdU-markierten 

(dunkelblauen) zu nicht-markierten (roten) Zellkernen bestimmt. Um den Einfluss 

von Aussaat-Inhomogenitäten auf die Markierungsrate zu berücksichtigen, wurde für 

jede Probe der Mittelwert aus bis zu 20 Gesichtsfeldern mit insgesamt 1 000 bis 3 000 

Zellkernen berechnet (Abbildung II 3.4). 

3.2.3 Durchflusszytometrie 

Mittels flusszytometrischer Untersuchungen lassen sich Eigenschaften einer großen 

Zahl an Zellen schnell messen. In den durchgeführten Experimenten stand der 

DNA-Gehalt im Zentrum des Interesses, der sich beim Durchlaufen des Zellzyklus 

verändert. 

Zur Messung wird die DNA der zu untersuchenden Zellen mittels eines fluoreszierenden 

DNA-Farbstoffes markiert. Bei Anregung des Fluoreszenzfarbstoffes ist die 

Intensität des emittierten Lichtes der DNA-Menge im Zellkern proportional. Untersucht 

man auf diese Weise viele Zellen einer Zellpopulation, so erhält man ein 

Häufigkeits-Spektrum, mit dem sich quantitative Aussagen über die Verteilung der 

Zellen in verschiedenen Zellzyklus-Phasen machen lassen. Abbildung II 3.5 gibt 

einen Überblick über den Ablauf der Messung. 

3.2.3.1 Allgemeine Vorgehensweise 

Die zu untersuchenden Zellen wurden trypsiniert und in ein Zentrifugenröhrchen überführt 

(Abschnitt II 1.2.4). Nach der Zentrifugation (800 

U (RCF: 133 g), 10 min) 

min 

wurde der Überstand verworfen und die Zellen nach Vereinzelung mit der Färbelösung 

fixiert (1–2 ml, Tabelle A.2.10 bzw. Tabelle A.2.11). Die Zellen wurden unter 

Lichtabschluss bei 4 °C gelagert. Vor der Messung (frühestens eine Stunde nach dem 

Fixieren und Färben) wurden die Zellen mit einem Vortex-Rührer wieder vereinzelt 

Abbildung II 3.5: Übersicht über die Abschnitte der flusszytometrischen Messungen. 

28


und die Konzentration auf etwa 10 5 Zellen eingestellt. Für die Messung einer Probe 

ml 

wurden 50– 100·10 3 Zellen benötigt. 

Die Messung wurde mit einem Partec PAS II Flusszytometer (Tabelle A.4.1) durchgeführt. 

Zur Messung wurde die Zellsuspension mittels Unterdruck in eine Messkapsel 

geführt, in der sie durch einen Hüllstrom aus ultrareinem Wasser zu einem Strom aus 

Zellen vereinzelt wurde. In der Messkapsel passierte jede Zelle einen dünnen Kanal 

vor einem Mikroskopobjektiv, durch das sie mit dem gefilterten Anregungslicht einer 

Quecksilberlampe bestrahlt wurde. Der emittierte Puls an Fluoreszenzlicht wurde 

mit dem Objektiv aufgefangen und nach einer Filterung in einem Photomultiplier 

verstärkt und detektiert (Abbildung II 3.6). Die Intensität jedes Lichtpulses wurde 

über eine Rechnereinheit aufgezeichnet und die Gesamtdaten einer Messung als 

Spektrum ausgegeben. Die Messrate betrug dabei 200–400 Zellen . 

s 

3.2.3.2 Eindimensionale Messungen 

Zur einfachen Bestimmung der Zellzyklus-Phasen und zur Kontrolle der Synchronität 

der Zellen am Anfang des Experimentes wurden eindimensionale flusszytometrische 

Messungen des DNA-Gehaltes der Zelle durchgeführt (Latt u. a. 1977). Dazu 

wurden die Zellen mit einem einzelnen Fluoreszenzfarbstoff angefärbt (Bisbenzimid 

Hoechst 33258, λ Ex = 352 nm, λ Em = 461 nm, Tabelle A.2.10), der membrangängig 

ist und spezifisch an Adenosin-Thymidin-Paaren der DNA bindet (Latt und 

Wohlleb 1975, Latt und Stetten 1976). Während der Messung wurde ein zweidimensionales 

Spektrum aufgenommen, in dem die Intensitätshäufigkeiten gegen die 

Intensitäten aufgetragen wurde (Abbildung II 3.7). Da die Messapparatur nur die 

Fluoreszenz-Intensität einer Zelle registriert, aber nicht deren Volumen, können sich 

in der G 2 -Population auch Paare von G 0 /G 1 -Zellen befinden. 

Abbildung II 3.6: Strahlengang im Partec PAS II Flusszytometer. Die zwei Filter- und 

Photomultiplierwege erlauben die synchrone Detektion zweier Signale. 

29



(a) 0 h nach Lösen der Kontaktinhibition 

(b) 42 h nach Lösen der Kontaktinhibition 

Abbildung II 3.7: Spektren einer eindimensionalen Messung unbestrahlter AG-Zellen nach 

Färbung mit Hoechst 33258. Auf der Abszisse ist der relative DNA-Gehalt aufgetragen, auf 

der Ordinate die Zellzahl. Direkt nach der Aussaat sind 90 % der Zellen in der G 0 /G 1 -Phase 

synchronisiert (a). Nach 42 Stunden ist die Synchronität verloren gegangen, und es befinden 

sich 54 % der Zellen in der ersten G 0 /G 1 - oder in späteren G 1 -Phasen und 27 % bzw. 19 % 

in der S- und G 2 -Phase (b). 

3.2.3.3 Hoechst-BrdU-Quenching 

Für die Verfolgung des Zellzyklus nach der ersten Zellteilung wurde die Methode 

des BrdU-Quenchings angewendet. Durch die der Bestrahlung folgenden Kultivierung 

der Zellen mit BrdU (Abschnitt II 2.1) wurden die Adenosin-Thymidin- 

Paare (A-T-Paare) der DNA bei jedem S-Phasendurchgang zum Teil durch 

Adenosin-BrdU-Paare (A-BrdU-Paare) ersetzt. Dies bedeutet eine geringere Zahl 

an Bindungsstellen für den Farbstoff Hoechst 33258, der an A-T-Paaren bindet 

und eine entsprechend verringerte Intensität der Fluoreszenz während der Messung 

(Quenching) (Böhmer und Ellwart 1981, Rabinovitch u. a. 1988, Poot 1990). 

Nach Zugabe von Ethidiumbromid, einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff (λ Ex = 

523 nm, λ Em = 605 nm, Tabelle A.2.11), der im Gegensatz zu Hoechst 33258 in die 

DNA interkaliert, d. h. dessen Bindungseigenschaft also von der Nukleotidzusammensetzung 

der DNA unabhängig ist, lassen sich nun zwei Parameter messen: Erstens der 

Gesamtgehalt an DNA (diesmal mittels Ethidiumbromid), und zweitens der Gehalt 

an A-T-Paaren (mittels Hoechst 33258), der nach jeder Zellteilung abnimmt. 

Trägt man die Intensitätshäufigkeit gegen die Intensität der Hoechst-Fluoreszenz 

und der Ethidiumbromid-Fluoreszenz auf, so erhält man ein dreidimensionales Spektrum, 

in dem sich die einzelnen Zellzyklen und Zellzyklus-Phasen unterscheiden lassen 

(Abbildung II 3.8). Dabei wird die Subpopulation in der S-Phase des Zellzyklus 

30


jedoch nicht erfasst. Durch geeignete Wahl der Zählregionen werden diese Zellen zu 

gleichen Teilen den Werten für die G 0 /G 1 - bzw. G 1 - und G 2 -Phasen eines Zyklusdurchlaufs 

zugerechnet. 

3.2.4 Analyse von Chromosomenschäden 

Für die Analyse der Chromosomenschäden wurden nach der Bestrahlung Präparate 

in einem Zeitraum von 30–70 Stunden hergestellt. Es wurden zwei Methoden verwendet, 

wobei bei der ersten Methode die Zellen durch mehrstündige Zugabe von Colcemid 

in der Mitose angereichtert wurden, wodurch ihre Metaphasen-Chromosomen 

sichtbar werden (IAEA Report Nr. 260 1986). Mit der zweiten Methode wurde durch 

Zugabe von Calyculin A eine vorzeitige Chromosomenkondensation (premature chromosome 

condensation, PCC) ausgelöst, wodurch auch in Zellen, die sich in der G 2 - 

und S-Phase befinden, kondensiertes Chromatin sichtbar wird (Durante u. a. 1998). 

Zur Unterscheidung der Zellzyklus-Durchläufe wurden die Zellen mit BrdU kultiviert. 

Einen Überblick über die Abschnitte der beiden Methoden gibt Abbildung II 3.9. 

(a) 6 h nach Lösen der Kontaktinhibition 

(b) 54 h nach Lösen der Kontaktinhibition 

Abbildung II 3.8: Spektren einer Hoechst-BrdU-Quenching-Messung unbestrahlter Zellen. 

Nach 6 Stunden befinden sich die meisten Zellen in der ersten G 0 /G 1 -Phase (a). Nach 

54 Stunden sind die Zellen durch den Zellzykus gelaufen und können den einzelnen Zellzyklus- 

Phasen zugeordnet werden (b). 

31



Abbildung II 3.9: Übersicht über die Abschnitte der Chromosomenpräparation. 

3.2.4.1 Präparation von Metaphasen-Chromosomen 

Vier Stunden vor der Präparation wurde dem Nährmedium Colcemid zugegeben 

(0,1 µg , Tabellen A.1.1). Dieses Alkaloid aus der Herbstzeitlose (Colchicum autumnale 

L.) verhindert die Ausbildung des Spindelapparates im Verlauf der Zellteilung 

ml 

und führt zu einer Anreicherung der Metaphasen in der Probe. 

Die zu präparierenden Zellen wurden nach der Inkubation trypsiniert (Abschnitt 

II 1.2.4). AG-Zellen nehmen in der Mitose eine kugelige Form an und haben 

einen geringen Kontakt mit der Wachstumsunterlage. Um diese Zellen nicht mit dem 

Medium zu verwerfen, wurde in diesem Fall das Kulturmedium zusammen mit der 

trypsinierten Zellsuspension in Zentrifugenröhrchen (10 ml) gegeben. 

Nach jedem der folgenden Zentrifugationsschritte wurde der Überstand verworfen 

und das Zellpellet vereinzelt. Nach der ersten Zentrifugation (1000 U (RCF: 209 g), 

min 

6 min) wurden unter stetigem Klopfen des Röhrchens tropfenweise 10 ml hypertonische 

KCl-Lösung (0,075 mol , 37 °C) zugegeben. Nach mindestens fünf Minuten 

l 

wurden die Zellen erneut zentrifugiert (1000 

U (RCF: 209 g), 8 min), und 10 ml 

min 

Fixativ (1 Teil Eisessig, 3 Teile Methanol abs.) tropfenweise unter Klopfen hinzugegeben. 

Nach 30 Minuten Einwirkzeit wurde erneut zentrifugiert (1200 U (RCF: 301 g), 

min 

10 min) und die Fixativzugabe und Zentrifugation noch einmal wiederholt. Das Zellpellet 

wurde danach in einer geringen Menge Fixativ gelöst. Je 7,5 µl Zellsuspension 

pro Tropfen wurden mit einer Pipette auf befeuchtete Objektträger getropft und diese 

getrocknet. Dabei nicht verbrauchte Suspension wurde bei -20 °C gelagert. Nach 

32


der Trocknung wurden die Objektträger gefärbt. 

3.2.4.2 Präparation von Chromosomen anderer Zellzyklus-Phasen 

Auf natürliche Weise werden in Zellen Chromosomen nur während der Metaphase der 

Mitose sichtbar. Um auch Chromosomen in anderen Phasen des Zellzyklus untersuchen 

zu können, wurde durch Zugabe von Calyculin A eine vorzeitige Kondensation 

der Chromosomen (premature chromosome condensation, PCC) ausgelöst (Gotoh 

u. a. 1995). Calyculin A ist ein Zellgift aus Discodermia calyx D., einem marinen 

Schwamm aus dem Pazifik. Es inhibiert die Protein-Phosphatasen 1 und 2A und ist 

ein starker Tumorpromoter (Fujiki und Suganuma 1993). Die wesentlichen Vorteile 

der PCC / Calyculin A-Methode sind: 

1. Potentielle Schädigungen können in anderen Zellzyklus-Phasen als der Metaphase 

erfasst werden. 

2. Selbst bei stärkster zytotoxischer Wirkung einer Substanz, bei der normalerweise 

wenig oder keine Metaphasen mehr vorgefunden werden könnten, kann eine 

Auswertung stattfinden. 

3. Ein geringerer technischer Aufwand als bei einer PCC mittels Zellfusion. 

Vor der Präparation wurde dem Nährmedium Calyculin A zugegeben (0,1 mM, 

45 min). Als Reaktion auf das Calyculin A nehmen die AG-Zellen Kugelform an und 

lösen sich daher von der Wachstumsunterlage ab. Eine Ablösung durch Trypsinierung 

war daher nicht nötig, statt dessen ließen sich die Zellen mit einer Pipette herunterspülen. 

Auf Grund der gesundheitsschädlichen Eigenschaften von Calyculin A wurde bei 

diesen Arbeiten nur Einwegware verwendet. Kontaminierte Flüssigkeiten und Geräte 

wurden gesondert entsorgt. Die Zellsuspension wurde in Zentrifugenröhrchen gegeben, 

die weiteren Arbeitsschritte (Zentrifugation, etc.) entsprachen dem vorherigen 

Abschnitt. 

3.2.4.3 Färbung der Präparate 

Da die Anzahl an Chromosomenaberrationen im ersten Zellzyklus nach der Bestrahlung 

am höchsten ist und mit jeder weiteren Teilung sinkt, muss die Zahl 

der Zellzyklus-Durchläufe für eine Analyse der Chromosomen unterscheidbar sein 

(Überblick in: Bender u. a. 1988). Um Zellen im ersten Zellzyklus erkennen zu können, 

wurden die Chromosomenpräparate mit der differentiellen Färbung nach Perry 

und Wolff (1974) gefärbt. Während der S-Phase wird dabei das Thymidin des 

neusynthetisierten DNA-Stranges mit BrdU substituiert. Da die DNA-Replikation 

semikonservativ ist, treten also voll-substituierte DNA-Bereiche erst bei zweiten 

und späteren Mitosen auf (Abbildung II 3.10). Diese Bereiche zeigen, wenn 

man sie mit Hoechst 33258 anfärbt, eine geringere Stabilität und lassen sich durch 

33



UV-Bestrahlung derart verändern, dass sie sich mit Giemsa schwächer als die übrige 

DNA färben (Abbildung II 3.12). 

Chromosomenpräparate aus Zellen, die mit BrdU kultiviert worden waren, wurden 

nach jedem Behandlungsschritt mit ultrareinem Wasser gewaschen und luftgetrocknet. 

Zuerst wurden die Zellen mit Hoechst 33258 gefärbt (5 µg in ultrareinem Wasser, 

ml 

1 h). Danach wurden die Objektträger mit Bestrahlungspuffer (Tabelle A.2.4) überschichtet 

und eine Stunde mit UV-Licht (λ = 365 nm) bestrahlt. Schließlich wurden 

die Objektträger 30 Minuten in 2×SSC gewaschen (bei 60 °C, Tabelle A.2.5) und 

danach mit Giemsa-Lösung (Tabelle A.2.6) gefärbt. 

Chromosomenpräparate von Zellen, die nicht mit BrdU kultiviert worden waren, 

wurden bereits direkt nach dem Tropfen und Trocknen mit Giemsa-Lösung gefärbt, 

da bei ihnen keine differentielle Färbung zu erwarten war. Die gefärbten und getrockneten 

Objektträger wurden mit Eukitt eingedeckt und lichtmikroskopisch bei 100- bis 

1000-facher Vergrößerung ausgewertet. 

Abbildung II 3.10: Illustration des Mechanismus der FpG-Färbung. Zu Beginn, vor der 

S-Phase, hat die DNA der Zelle kein BrdU eingebaut. Während der ersten S-Phase wird 

ein neuer Strang der DNA synthetisiert, der BrdU inkorporiert hat. Da BrdU nur in einem 

Strang der DNA vorkommt, erscheint das Chromosom in der ersten Metaphase noch dunkel 

gefärbt. Nach der zweiten S-Phase ist die Hälfte der DNA in beiden Strängen mit BrdU 

substituiert, an diesen Stellen erscheinen die Chromatiden dunkel. Mit der dritten S-Phase 

erhöht sich der Anteil an substituierter DNA noch weiter und die dunkel gefärbten Bereiche 

in den Chromatiden nehmen ab. 

34

3.3 Fehlerbetrachtung 

Abbildung II 3.11: Übersicht über den Ablauf der Fluoreszenz-plus-Giemsa-Färbung. 

3.2.4.4 Auswertung der Chromosomenpräparate 

Bei den Metaphase-Präparaten wurden zur Bestimmung des Mitoseindex pro Untersuchungspunkt 

2 000 Zellkerne und die darunter enthaltenen Metaphasen gezählt. Zur 

Bestimmung der Aberrationsrate wurden, soweit möglich, 50 Metaphasen untersucht. 

Metaphasen, die 46 Chromosomen enthielten wurden als nicht aberrant gewertet. Zur 

genauen Registrierung der verschiedenen Typen von Chromosomenschäden bedarf es 

einer langen Einarbeitungszeit, die bei dieser Arbeit nicht zur Verfügung stand. Um 

wenigstens eine grobe Abschätzung der Chromosomenschäden vornehmen zu können, 

wurde daher in aberranten Zellen nur die Anzahl der Chromosomenfragmente 

bestimmt. 

Bei den PCC-Präparaten gestaltete sich die Untersuchung, bedingt durch die Methode, 

schwieriger: G 0 /G 1 -PCCs wurden nicht beobachtet, vermutlich weil der Spiegel 

an Mitose förderndem Faktor (mitosis promoting factor, MPF) am Anfang des 

Zellzyklus für eine Kondensation zu gering ist. In der S-Phase können keine einzelnen 

Chromosomen aufgelöst werden. In der frühen G 2 -Phase lassen sich Chromosomen 

darstellen, auf Grund der nicht sichbaren Zentromere konnte in dieser Arbeit jedoch 

nur die Gesamtmenge an Fragmenten bestimmt und den Kontrollen gegenübergestellt 

werden. Ausgewertet wurden, soweit möglich, 50 G 2 -PCCs und Metaphasen 

mit mindestens 46 Chromosomen. 


Bei der Vorbereitung, Durchführung und Auswertung strahlenbiologischer Experimente 

mit vielen verschiedenen Dosen und Messzeitpunkten entsteht ein beträchtlicher 

materieller und personeller Aufwand. Als Folge konnte für jedes der hier durchgeführten 

Experimente nur eine Probe pro Zeitpunkt und Dosis untersucht werden. 

Deshalb wurden in dieser Arbeit keine statistischen Betrachtungen der Ergebnisse 

durchgeführt, da nicht genügend Daten aus gleichartigen Experimenten zur Verfügung 

standen. Dieser Faktor wurde bei der Bewertung der Resultate beachtet und 

35



(a) Interphasekern 

(b) Erste Mitose 

(c) Zweite Mitose 

(d) Dritte Mitose 

Abbildung II 3.12: Zellen in der ersten, zweiten und dritten Mitose nach Beginn der Inkubation 

mit BrdU und nach Präparation mit Colcemid. Abbildung (a) zeigt einen Interphasekern. 

Die Chromosomen aus der ersten Mitose sind dunkel (b), die aus der zweiten Mitose 

zu 50 % hell (c) und die späterer Mitosen überwiegend hell gefärbt (d) (Maßstab: 1 µm). 

lässt sich gegebenenfalls durch zukünftige Wiederholungen der entsprechenden Experimente 

minimieren. 

Es existieren jedoch auch spezielle Fehlerquellen, die ebenfalls bei der Diskussion 

der Ergebnisse berücksichtigt wurden: Da beim Hoechst-BrdU-Quenching ein Verdünnungseffekt 

gemessen wurde, sank die Auflösung des Spektrums mit jedem Zellzyklus, 

wodurch wiederum der Messfehler mit der Progression der Zellen anstieg. Die Messdaten 

späterer Zeitpunkte sind also mit größeren Fehlern behaftet. 

Die Anfälligkeit gegenüber Messfehlern war bei der kontinuierlichen BrdU- 

Markierung geringer. Bei unkritischer Analyse können sich jedoch durch Inhomogenitäten 

bei der Zellaussaat starke Schwankungen der Markierungsraten ergeben, was 

bei der Auswertung beachtet wurde. 

36


(a) G 0 /G 1 -Phase: keine Kondensation 

(b) S-Phase 

(c) frühe G 2 -Phase 

(d) späte G 2 -Phase 

(e) Mitose 

(f) späte Mitose 

Abbildung II 3.13: Zellkerne nach einer PCC mit Calyculin A. Kerne aus der 

G 0 /G 1 -Phase werden nicht kondensiert (a). Die wolkigen DNA-Aggregate werden der 

S-Phase zugeordnet und lassen sich nicht in einzelne Chromosomen auflösen (b). Liegen nur 

unvollständig kondensierte Chromosomen vor, zählt man die Zelle zur frühen G 2 -Phase (c). 

Wenn vollständige Chromatiden ohne Zentromer zu erkennen sind, ordnet man sie der 

G 2 -Phase zu (d). In der M-Phase sind beide Chromatiden gut getrennt und das Zentromer 

ist sichtbar (e). Nach der Trennung der Chromatiden befindet sich die Zelle in der späten 

M-Pase (f) (Maßstab: 1 µm). 

37



Bei der Analyse der Chromosomenpräparate war die Häufigkeit der untersuchbaren 

Metaphasen und PCCs zu den betrachteten Zeitpunkten sehr gering. Demzufolge 

waren die Stichprobengrößen zu klein, um aus den Ergebnissen gesicherte Schlussfolgerungen 

ziehen zu können. Außerdem ist die PCC mittels Calyculin A nicht etabliert, 

weshalb die Beurteilung ihrer Resultate mit Vorsicht erfolgte, da sie nicht immer auf 

gesicherten Grundlagen beruhte. 

38

Teil III 

Ergebnisse 

39

1 Einfluss von Strahlung 

Vorbemerkung 

Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist der Einfluss von Strahlung auf die Zellzyklus- 

Progression und das Auftreten von Chromosomenschäden. Die ermittelten Messwerte 

sind im Anhang B aufgeführt. 

Die Experimente wurden mit Fibroblasten durchgeführt, die mittels Kontaktinhibition 

synchronisiert (Abschnitt II 1.2.3 und II 3.2.3.2) und nach dem Lösen der 

Kontaktinhibiton kontinuierlich mit 10 µmol 

ml 

kultiviert wurden (Abschnitt II 3.1). 

1.1 Einfluss von Strahlung auf die 

Zellzyklus-Progression 


Mit der kontinuierlichen BrdU-Markierung wurde überprüft, inwieweit die Zellen 

nach Lösen der Kontaktinhibition von der G 0 /G 1 -Phase in die S-Phase des Zellzyklus 

eintreten. Bei der Proliferation durchlaufen sie die S-Phase und anschließend 

die anderen Phasen des Zellzyklus. Zu verschiedenen Zeitpunkten zwischen null und 

144 Stunden wurde das in der S-Phase inkorporierte BrdU mit Antikörpern detektiert 

und die so markierten Zellkerne dunkel angefärbt (Abschnitt II 3.2.2). Zellkerne, die 

nach Durchführung dieser Methode nicht dunkel gefärbt waren, hatten demnach die 

G 0 /G 1 -Phase des Zellzyklus nicht verlassen. Zur Interpretation der Daten wurden 

der Anteil an markierten Zellen einer Population gegen die Kultivierungsdauer seit 

der Bestrahlung aufgetragen (Abbildung III 1.1). Aufgeführt sind die Ergebnisse 

nach Bestrahlung mit Kohlenstoff-Ionen und nach Röntgenbestrahlung. 

Für die Kontrollpopulationen beider Experimente ergibt sich, dass auch 144 Stunden 

nach der Neuaussaat ein Teil der Zellen nicht markiert ist. Nach Bestrahlung 

mit Kohlenstoff-Ionen sind es 20 %, nach Röntgenbestrahlung 10 % der Zellen, auf 

Grund dieses Unterschieds wurden die Effektkurven auf die Kontrollen normiert. Mit 

steigender Dosis sinkt der Anteil an markierten Zellen. 72 Stunden nach Bestrahlung 

mit Kohlenstoff-Ionen sinkt er von 40 % bei 1 Gy über 25 % bei 2 Gy auf einen Sättigungswert 

von unter 10 % bei 4 Gy. In der Kontrolle sind nach 72 Stunden 80 % 

der Zellen markiert. Die Markierungskurven für 1 und 2 Gy liegen dicht beieinander 

(Abbildung III 1.1(a)). Auch nach Röntgenbestrahlung sinkt der Anteil markierter 

Zellen mit steigender Dosis. Nach 72 Stunden sind bei 2 Gy 75 %, bei 4 Gy 40 % und 

41

Teil III – Ergebnisse 

Kapitel 1 – Einfluss von Strahlung 

(a) Schwerionenbestrahlung ( 12 C, 11 MeV 

Anteil markierter Zellen [%] 

100 

90 

80 

70 

60 

50 

40 

30 

20 

10 

Kontrolle 

1 Gy 

2 Gy 

4 Gy 

u ) 

0 

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 

Zeit nach Bestrahlung [h] 

(b) Röntgenbestrahlung (250 kV) 

100 

Anteil markierter Zellen [%] 

90 

80 

70 

60 

50 

40 

30 

20 

10 

Kontrolle 

2 Gy 

4 Gy 

8 Gy 

16 Gy 

0 

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 


Abbildung III 1.1: Zeitliche Entwicklung des Anteiles BrdU-markierter AG-Zellen an der 

Gesamtpopulation nach Bestrahlung in der G 0 /G 1 -Phase und nach Lösen der Kontaktinhibition. 

(a): Nach Bestrahlung mit 11 MeV 

u 

Kohlenstoff-Ionen. (b): Nach Bestrahlung mit 

250 kV Röntgenstrahlung. Mit zunehmender Inkubationszeit steigt der Anteil an markierten 

Zellen, d. h. Zellen, welche die S-Phase erreicht haben, an. Steigende Dosen führen zu einem 

Absinken der Markierungsrate, d. h. es verlassen weniger Zellen die G 0 /G 1 -Phase. Die 

Fehlerbalken stellen die Standardabweichung der Messung dar. 

42

1.1 Einfluss von Strahlung auf die Zellzyklus-Progression 

Anteil nicht-markierter Zellen [%] 

60 

50 

40 

30 

20 

10 

0 

12 

C 11 MeV/u 

Röntgen 250 kV 

0 1 2 3 4 5 

Dosis [Gy] 

Abbildung III 1.2: Anteile nicht-markierter AG-Zellen, 72 Stunden nach der Bestrahlung 

in der G 0 /G 1 -Phase und Lösen der Kontaktinhibition, über die Dosis (bezogen auf die 

Kontrollpopulation). Bei gleicher Dosis erreichen nach Bestrahlung mit Kohlenstoff-Ionen 

weniger Zellen die S-Phase als nach Röntgenbestrahlung. 

bei 8 Gy 10 % der Zellen markiert. Bei 16 Gy ist mit nur 5 % markierten Zellen der 

Sättigungsbereich erreicht (Abbildung III 1.1(b)). 

Der Verlauf der Markierungskurven zu späteren Zeitpunkten hin zeigt, dass sich 

bei den Kontrollen beider Bestrahlungsexperimente nach 72 Stunden ein Plateau 

ausbildet, der Anteil an markierten Zellen steigt ab hier nicht mehr an. Ein Plateau 

kann sich nur ausbilden, wenn zum einen die nicht-markierten Zellen nicht zu späteren 

Zeitpunkten markiert werden, oder wenn die bereits markierten Zellen nicht 

durch weitere Zellteilungen den Anteil an markierten Zellen erhöhen und damit eine 

Verdünnung der nicht-markierten Zellen bewirken. 

Bei den mit Kohlenstoff-Ionen bestrahlten Zellen ist dieses Plateau ebenso vorhanden, 

nach Röntgenbestrahlung gibt es dieses Plateau jedoch nicht. Hier ist auch 

nach 72 Stunden noch ein deutlicher Anstieg in der Markierungsrate zu beobachten 

(Abbildung III 1.1). Im Experiment mit Röntgenstrahlung wurde nach 72 Stunden 

ein Wechsel des Mediums mit BrdU durchgeführt, beim Experiment mit Kohlenstoff- 

Ionen war dies nicht der Fall. 

Zur Einschätzung des Dosis-Effektes von Kohlenstoff-Ionen und Röntgenstrahlung 

wurde der Anteil nicht-markierter Zellen nach dem Eintritt in die Plateauphasen 

(nach 72 h) den applizierten Dosen gegenübergestellt. Dabei ergibt sich ein linearer 

43



Zusammenhang zwischen dem Anteil nicht-markierter Zellen und der Kohlenstoffresp. 

Röntgendosis (Abbildung III 1.2). 

Die Regressionsgerade für Kohlenstoff-Bestrahlung verläuft steiler als die für Röntgenbestrahlung 

(Kohlenstoff-Ionen: r = −0, 96, Steigung : 29 % Gy , Röntgenstrahlung: 

r = −0, 99, Steigung : 11,7 % ), für eine gleiche Markierungsrate ist die Dosis bei 

Gy 

Bestrahlung mit Kohlenstoff-Ionen um den Faktor 2,5 niedriger als bei Röntgenstrahlung. 

Die mit 8 und 16 Gy Röntgenstrahlung behandelten Zellen wurden hierbei 

nicht betrachtet, da hier nicht mehr ein linearer Zusammenhang zwischen Dosis und 

Markierungsrate vorliegt. 

1.1.2 Hoechst-BrdU-Quenching 

Um ein präziseres Bild über die Progression der Zellen durch mehrere Zellzyklen zu 

erhalten, wurden synchronisierte Zellen ausgesät und nach Hoechst-BrdU-Quenching 

zu mehreren Zeitpunkten zwischen null und 144 Stunden flusszytometrisch untersucht. 

Damit konnte die Zellpopulation in Subpopulationen aufgetrennt werden, die 

sich dann zu G 0 /G 1 -, G 1 - und G 2 -Phase zuordnen ließen (Abschnitt II 3.2.3.3). Für 

das Kohlenstoff-Experiment standen weniger Proben zur Messung zur Verfügung als 

für das Experiment mit Röntgenstrahlung, daher fehlen hier die Daten zu den sehr 

frühen und späten Zeitpunkten. 

1.1.2.1 Frühe Zellzyklus-Progression 

Die Anteile an Zellen in der ersten G 0 /G 1 -Phase wurden zu verschiedenen Zeitpunkten 

ermittelt (Abbildung III 1.3). Nach 72 Stunden sind in beiden Kontrollpopulationen 

Teile der Zellen noch in der G 0 /G 1 -Phase, im Kohlenstoff-Experiment sind das 

20 % der Zellen, im Röntgen-Experiment 10 %. Hier zeigt sich eine Übereinstimmung 

mit den bei der kontinuierlichen BrdU-Markierung ermittelten Werten für Zellen, die 

nicht in die S-Phase eintraten. 

Mit zunehmender Dosis verlassen weniger Zellen die erste G 0 /G 1 -Phase. 72 Stunden 

nach Bestrahlung und Aussaat der Zellen bildet sich bei den mit 1 Gy Kohlenstoff- 

Ionen bestrahlten Zellen ein Plateau aus, obwohl noch über 50 % der Zellen in der 

ersten G 0 /G 1 -Phase sind. Nach 2 Gy sinkt der Phasenanteil auch nach 72 Stunden 

weiter ab. Bei den mit 4 Gy bestrahlten Zellen lässt sich keine Progression nachweisen, 

der Anteil an Zellen in der ersten G 0 /G 1 -Phase bleibt über die Zeit konstant. 

Nach 2 bis 8 Gy Röntgenbestrahlung zeigt sich im Vergleich zu den G 0 /G 1 -Anteilen 

nach Kohlenstoffbestrahlung deutlicher, dass sich bei den mit bestrahlten Zellen kein 

Plateau ausbildete. Die Zahl der in der ersten G 0 /G 1 -Phase liegenden Zellen fällt 

auch 72 Stunden nach der Bestrahlung noch ab. Nach einer Dosis von 16 Gy bleibt 

die Größe der G 0 /G 1 -Subpopulation über die gesamte Experimentdauer konstant. 

44



u ) 


Abbildung III 1.3: Durch Hoechst-BrdU-Quenching ermittelter Anteil an AG-Zellen, welche 

die erste G 0 /G 1 -Phase nach dem Bestrahlen und Lösen der Kontaktinhibition nicht verlassen 

haben. Mit steigender Dosis wird ein größerer Anteil von Zellen in der G 0 /G 1 -Phase 

gefunden. Auch in den Kontrollpopulationen verlässt ein Teil der Zellen die G 0 /G 1 -Phase 

nicht. Bei der Röntgenbestrahlung standen mehr Messpunkte zur Verfügung als im Experiment 

mit Kohlenstoff-Ionen. 

45



(a) 0 Gy, 12 C, 11 MeV 

100 

80 

u 

(b) 0 Gy, Röntgenbestrahlung (250 kV) 

100 

1. G 1 

/G 0 

2. G 1 

1. G 1 

/G 0 

2. G 1 

1. G 2 

2. G 2 

80 

1. G 2 

2. G 2 

Phasenanteil [%] 

60 

40 

20 


60 

40 

20 

0 

0 24 48 72 96 120 144 


0 

0 24 48 72 96 120 144 


(c) 2 Gy, 12 C, 11 MeV 

100 

80 

u 

(d) 2 Gy, Röntgenbestrahlung (250 kV) 

100 

80 


60 

40 

20 


60 

40 

20 

0 

0 24 48 72 96 120 144 


0 

0 24 48 72 96 120 144 


(e) 4 Gy, 12 C, 11 MeV 

u 

(f) 4 Gy, Röntgenbestrahlung (250 kV) 

100 

80 


60 

40 

20 

0 

0 24 48 72 96 120 144 


Abbildung III 1.4: Nach Hoechst-BrdU-Quenching ermittelte Zellzyklus-Progression von 

AG-Zellen nach Bestrahlung in der G 0 /G 1 -Phase und Lösen der Kontaktinhibition. Dargestellt 

sind die zu verschiedenen Zeitpunkten gemessenen Phasenanteile von Zellen in G 0 /G 1 - 

und G 2 -Phase des ersten Zellzyklus (1. G 0 /G 1 , 1. G 2 ) sowie in der G 1 - und G 2 -Phase im 

zweiten (2. G 1 , 2. G 2 ) Zellzyklus. Linke Spalte: Nach Einwirkung von Kohlenstoff-Ionen. 

Rechte Spalte: Nach Einwirkung von Röntgenstrahlung. 

46


1.1.2.2 Spätere Zellzyklus-Progression 

Die Progression der Zellen durch den ersten, zweiten und dritten Zellzyklus nach 

der Bestrahlung lässt sich illustrieren, wenn die jeweiligen Anteile an Zellen in den 

G 0 /G 1 -, G 1 - und G 2 -Subpopulationen über die Zeit miteinander verglichen werden 

(Abbildung III 1.4). 

Für die Kontrolle des Experimentes mit Kohlenstoff-Ionen standen weniger Messpunkte 

zur Verfügung, es zeichnet sich aber ein ähnlicher Trend ab wie im Röntgenexperiment 

(Abbildung III 1.4(a)). In der Kontrolle des Experimentes mit Röntgenstrahlen 

sinkt der Anteil an Zellen in der ersten G 0 /G 1 -Phase innerhalb von 72 Stunden 

auf einen konstanten Wert (Abbildung III 1.4(b)). Nach 24 Stunden steigt der 

Anteil an Zellen in der ersten G 2 -Phase auf ein Maximum und fällt danach wieder, 

währenddessen sich die Zellen in der G 1 -Phase des zweiten Zellzyklus ansammeln. 

Diese Phase des Zellzyklus verlassen in der folgenden Zeit nur noch wenige Zellen. 

Die zweite G 2 -Phase wird nur von 3 % der Zellen erreicht. Lediglich 10 % der Zellen 

erreichen den dritten Zellzyklus. 

Bei 2 Gy Kohlenstoff-Bestrahlung sind auch 120 Stunden nach der Bestrahlung 

noch 60 % der Zellen in der ersten G 0 /G 1 -Phase (Abbildung III 1.4(c)). Ein Maximum 

lässt sich deshalb in der ersten G 2 -Phase nicht beobachten. Der G 2 -Anteil bleibt 

ebenso wie bei der G 1 -Phase über die Zeit nach 54 Stunden konstant. Der Anteil an 

Zellen, welche die zweite G 2 -Phase, und spätere Phasen erreichen, liegt unter 1 %. 

Der Vergleich mit der Entwicklung nach 2 Gy Röntgenbestrahlung zeigt, dass bei 

gleicher Dosis mehr Zellen in der ersten G 0 /G 1 -Phase bleiben, wenn mit Kohlenstoff- 

Ionen bestrahlt wird (Abbildung III 1.4(d)). Nach 54 Stunden treten keine großen 

Veränderungen mehr in der Verteilung der Subpopulationen auf, die Kurven flachen 

ab, es bildet sich aber kein klar definiertes Plateau aus. Erst nach 144 Stunden 

konnten Zellen im dritten Zellzyklus nachgewiesen werden (9 % der Population). 

Zu höheren Dosen hin verlassen noch weniger Zellen die erste G 0 /G 1 -Phase. Nach 

Bestrahlung mit 4 Gy Kohlenstoff-Ionen bilden die Subpopulationen über die gesamte 

Dauer des Experimentes Plateaus aus (Abbildung III 1.4(e)). Bei Röntgenbestrahlung 

mit 4 Gy kommt es nicht zur Bildung eines Plateaus, zwischen 54 Stunden 

und 144 Stunden verlassen noch 20 % der Zellen die erste G 0 /G 1 -Phase (Abbildung 

III 1.4(f)). Es konnten keine Zellen nachgewiesen werden, die über die zweite 

G 1 -Phase herausgekommen waren. Nach 8 und 16 Gy Röntgenstrahlung erreichen 

nach 144 Stunden weniger als 10 % der Zellen die erste G 2 -Phase (keine Abbildungen, 

Daten in Anhang B, Tabelle B.2.8 und B.2.9). 

Der Anteil an Zellen in der ersten G 0 /G 1 -Phase korreliert mit der Höhe der applizierten 

Dosis. Bis zu einer Dosis von 2 Gy bei Kohlenstoff-Ionen und 4 Gy bei 

Röntgenstrahlung ist der Zusammenhang annähernd linear. Dabei zeigt sich, ähnlich 

zu den Ergebnissen der kontinuierlichen BrdU-Markierung, auch hier, dass nach Bestrahlung 

mit Kohlenstoff-Ionen mehr Zellen in der G 0 /G 1 -Phase bleiben als nach 

Röntgenbestrahlung mit der gleichen Dosis (Abbildung III 1.5). 

47



60 

Phasenanteil in 1. G 0 

/G 1 

[%] 

50 

40 

30 

20 

10 

0 

12 

C 11 MeV/u 

Röntgen 250 kV 

0 1 2 3 4 

Dosis [Gy] 

Abbildung III 1.5: Anteil an Zellen in der G 0 /G 1 -Phase, 72 Stunden nach der Bestrahlung 

und dem Lösen der Kontaktinhibition, über die Dosis (bezogen auf die Kontrollpopulation). 

Nach gleicher Dosis Kohlenstoff-Ionen sind mehr Zellen in der G 0 /G 1 -Phase als nach 

Röntgenbestrahlung. 

Die Regressionsgeraden (Kohlenstoff-Ionen: r = −0, 99, Steigung : 12 % Gy , Röntgenstrahlung: 

r = −0, 97, Steigung : 23 % ) ergeben, dass die für einen gleich hohen 

Gy 

Phasenanteil in G 0 /G 1 benötigte Dosis bei Kohlenstoff-Ionen um den Faktor 1,9 geringer 

ist als bei Röntgenbestrahlung. 

1.1.3 Zellzyklus-Verteilung in PCC-Präparaten 

Zur Untersuchung der Verteilung der Zellen auf die einzelnen Zellzyklus-Phasen wurden 

sie 30, 54 und 70 Stunden nach der Bestrahlung für 45 Minuten mit Calyculin A 

behandelt und damit zur vorzeitigen Kondensation ihrer DNA gebracht (PCC). Nach 

einer Chromosomenpräparation wurden die Zellen den einzelnen Zellzyklus-Phasen 

zugeordnet (Abschnitt II 3.2.4.2). Auf diese Weise konnte bestimmt werden, in welcher 

Phase des Zellzyklus sie sich zu den untersuchten Zeitpunkten befinden. 

Der Kondensationsindex, also der Anteil an Zellen, der auf Calyculin A mit einer 

Kondensation des Chromatins reagiert, zeigte nach Bestrahlung deutliche Änderungen 

(Tabellen III 1.1 und III 1.2). Die kondensierten Zellen befanden sich 30 Stunden 

nach der Bestrahlung zum überwiegenden Teil in der S-Phase des Zellzyklus. In 

den Kontrollen waren etwa 30 % der Zellen kondensiert. Nach Bestrahlung mit 2 und 

48


4 Gy Kohlenstoff-Ionen sank dieser Anteil um das 8,7fache auf lediglich 3,5 % und 

1,1 % (Tabelle III 1.1). 

Im Referenzexperiment mit Röntgenstrahlung zeigte sich ein übereinstimmendes 

Bild, jedoch waren die Änderungen kleiner als nach Bestrahlung mit Kohlenstoff- 

Ionen gleicher Dosis. Nach 2 Gy Röntgenstrahlung sank der Kondensationsindex von 

27 % auf etwa die Hälfte (14 %) ab, nach 4 Gy auf 5,8 % (Tabelle III 1.2). 

Nach 30 Stunden sind die meisten kondensierten Zellen in der S-Phase. Da mit steigender 

Dosis der Kondensationsindex und damit der Anteil an Zellen in der S-Phase 

fällt, sind diese Zellen wahrscheinlich in der G 0 /G 1 -Phase. Bei gleicher Dosis ist der 

Anteil an Zellen in der G 0 /G 1 -Phase nach Kohlenstoffbestrahlung größer als nach 

Röntgenbestrahlung. 

Zu einem späteren Zeitpunkt, 54 Stunden nach der Bestrahlung, ist der Kondensationsindex 

in den Kontrollen und den bestrahlten Proben niedrig. Auch hier sinkt 

Tabelle III 1.1: Kondensationsindex und Phasenverteilung nach PCC 

und Schwerionenbestrahlung ( 12 C, 11 MeV 

u ) 

Zeit [h] Dosis [Gy] kondensierte Zellkerne [%] Davon in Phase [%] 

S G 2 M 

30 0 30,9 98,2 1,3 0,4 

2 3,5 92,9 5,4 1,8 

4 1,1 100 0 0 

54 0 3,1 85,9 10,3 3,8 

2 1,9 85,1 12,8 2,1 

4 0,5 75 25 0 

Tabelle III 1.2: Kondensationsindex und Phasenverteilung nach PCC 

und Röntgenbestrahlung (250 kV) 

Zeit [h] Dosis [Gy] kondensierte Zellkerne [%] Davon in Phase [%] 

S G 2 M 

30 0 1 41,5 68,7 30,6 0,7 

0 27 92,3 7,7 0 

2 14 96,4 3,6 0 

4 5,8 95,2 4,8 0 

54 0 1,7 94,4 5,6 0 

2 1,1 82,6 13 4,3 

4 0,8 88,9 11,1 0 

1 Kontrolle ohne Zugabe von BrdU 

49



er mit steigender Dosis, wobei die relativen Änderungen nicht so stark sind wie nach 

30 Stunden. Nach Röntgenbestrahlung ist er kleiner als nach Kohlenstoffbestrahlung. 

Der Anteil an Zellen in der G 2 - und M-Phase ist größer als nach 30 Stunden und 

er steigt mit der Dosis. Nach 70 Stunden lagen die Kondensationsindizes bei den 

Kontrollen und den bestrahlten Proben unter 1 % und für die Ermittlung der Phasenverteilung 

waren zu wenig kondensierte Zellen vorhanden. 

1.1.4 Veränderung des Mitoseindex 

Da die Zellen beim Durchlaufen des Zellzyklus die Mitose passieren, lässt sich die Zellproliferation 

anhand des Mitoseindex messen. Für die Bestimmung des Mitoseindex 

wurden die Zellen vier Stunden mit Colcemid inkubiert und anschließend Chromosomenpräparate 

hergestellt (Abschnitt II 3.2.4.1). Der Zeitraum von 30 bis 70 Stunden 

nach der Bestrahlung wurde im Intervall von vier Stunden untersucht. In den Präparaten 

wurde die Anzahl an Metaphasen und Zellkernen bestimmt und aus diesem 

Verhältnis der Mitoseindex berechnet (Abschnitt II 3.2.4.4). 

Mit zunehmender Dosis wird der Mitoseindex kleiner und sein Maximum ist weniger 

stark ausgeprägt (Abbildung III 1.6). Bei allen Proben wird das Maximum 

des Mitoseindex 42 Stunden nach der Aussaat erreicht. Ein zweites Maximum ist 

hier wegen der Auflösung der Synchronität des Anteils der Zellen, die weiter proliferieren 

und in Mitose gehen, nicht zu beobachten. Der Abfall des Mitoseindex nach 

42 Stunden findet in den bestrahlten Proben langsamer statt als in den Kontrollen. 

Zwischen 42 und 50 Stunden fällt er in den Kontrollen um das Vierfache ab. Nach Bestrahlung 

mit Kohlenstoff-Ionen nur um das Zweifache (1 Gy) und bei 2 und 4 Gy um 

das 1,15fache. Nach Röntgenbestrahlung entsprechend um das 2,3fache und 2,8fache 

(2 und 4 Gy). 

50



3,5 

u ) 

3,0 

2,5 

Kontrolle 

1 Gy 

2 Gy 

4 Gy 

Mitoseindex [%] 

2,0 

1,5 

1,0 

0,5 

0,0 

30 34 38 42 46 50 54 58 62 66 70 



3,5 


3,0 

2,5 

2,0 

1,5 

1,0 

Kontrolle 

2 Gy 

4 Gy 

8 Gy 

16 Gy 

0,5 

0,0 

30 34 38 42 46 50 54 58 62 66 70 


Abbildung III 1.6: Anteil an AG-Zellen in erster, zweiter und späterer Mitose nach dem 

Bestrahlen in der ersten G 0 /G 1 -Phase und Lösen der Kontaktinhibiton. Mit zunehmender 

Dosis erreichen weniger Zellen die Mitose. 

51



1.2 Analyse der Chromosomenschäden 

Zur Bestätigung eines Teils der Ergebnisse von Berger (2001) und zur Untersuchung 

der möglichen Auswirkungen von Zellzyklus-Verzögerungen auf die Chromosomenanalyse 

wurden auch Chromosomenschäden ausgewertet. Um Veränderungen an 

den Chromosomen lichtmikroskopisch nachzuweisen, wurden Chromosomenpräparate 

nach 30, 54 und 70 Stunden untersucht. Dabei wurden die Zellen vier Stunden vor der 

Präparation mit Colcemid behandelt (Abschnitt II 3.2.4.1). Für einen Vergleich zwischen 

Metaphase und G 2 -Phase wurden zeitgleich, durch Behandlung mit Calyculin A, 

Präparate mit vorzeitiger Chromosomenkondensation erzeugt (Abschnitt II 3.2.4.2). 

Jede Zelle mit mehr als 46 Chromosomen oder Chromosomenfragmenten wurde als 

aberrant gewertet. 

1.2.1 Anzahl aberranter Zellen 

Bei allen drei untersuchten Zeitpunkten war die Anzahl an auswertbaren G 2 -PCCs 

und Metaphasen sehr niedrig (Anhang B.3). Lediglich in der Probe nach 54 Stunden 

konnten genügend G 2 -PCCs und Metaphasen für eine Auswertung gefunden werden. 

Die Anzahl der aberranten Zellen lag in den Kontrollen unter 8 %. Bei den G 2 -PCCs 

wurden in der Kontrolle mehr aberrante Zellen gezählt als bei den Metaphasen (8 % 

gegenüber 6 % bei Kohlenstoff- und 2 % gegenüber 0 % bei Röntgenbestrahlung). 

Nach Bestrahlung steigt die Anzahl aberranter Zellen zunächst an 

(Abbildung III 1.7). Bei Bestrahlung mit Kohlenstoff-Ionen erreicht sie mit 

Erhöhung der Dosis ein Maximum und fällt nach weiterer Steigerung der Dosis ab. 

Bei den Metaphasen fällt sie von 59 % (1 Gy) auf 48 % (2 Gy), bei den G 2 -PCCs 

wurden ähnliche Werte ermittelt (von 63 % auf 60 %). Nach Röntgenbestrahlung 

zeigt sich in den G 2 -PCCs ein gleichartiges Bild (Abbildung III 1.7). Zwar ist hier 

kein Maximum in der Anzahl der aberranten Zellen zu beobachten, die Dosisabhängigkeit 

konnte jedoch nicht bis zu höheren Dosen als 4 Gy untersucht werden, weil zu 

den untersuchten Zeitpunkten die Ausbeute an G 2 -PCCs und Metaphasen zu gering 

für eine Auswertung war. Der Zuwachs wird jedoch von 2 Gy nach 4 Gy geringer. 

Bei den Metaphasen ist dies nicht zu beobachten. In den G 2 -PCCs war die Anzahl 

aberranter Zellen größer als in den Metaphasen, eine Ausnahme hiervon stellt der 

Wert nach 54 Stunden und 4 Gy Röntgenbestrahlung dar. 

1.2.2 Aberrationen pro Zelle 

Neben der Anzahl aberranter Zellen wurde die durchschnittliche Zahl an Aberrationen 

pro erste G 2 -PCC bzw. Metaphase quantifiziert (Abbildung III 1.8). 

Hier steigt die Anzahl der Aberrationen linear mit der Dosis an. Nach Bestrahlung 

mit Kohlenstoff-Ionen und Röntgenstrahlung liegt bei G 2 -PCCs und Metaphasen 

der Dosiseffekt im gleichen Bereich (0,78 bzw. 0,76 Aberrationen pro Gray 

52


70 

Anteil aberranter Zellen [%] 

60 

50 

40 

30 

20 

10 

0 

Kohlenstoff, 11 MeV/u: 

G 2 

-Phase (PCC) 

Metaphase 

Röntgen, 250 kV: 

G 2 

-Phase (PCC) 

Metaphase 

0 1 2 3 4 

Dosis [Gy] 

Abbildung III 1.7: Anteil aberranter Zellen in der ersten G 2 - und Metaphase, in Abhängigkeit 

von der Dosis, 54 Stunden nach der Bestrahlung. Die G 2 -Zellen wurden nach 45- 

minütige Behandlung mit Calyculin A, die Metaphasen nach vierstündige Behandlung mit 

Colcemid präpariert. Bei gleicher Dosis sind nach Kohlenstoff-Bestrahlung mehr aberrante 

Zellen vorhanden als nach Röntgenbestrahlung. In den G 2 -PCCs finden sich mehr aberrante 

Zellen als in den Metaphasen. Mit zunehmender Dosis fällt bei Kohlenstoff-Bestrahlung der 

Anteil an aberranten Zellen nach Erreichen eines Maximums ab. Die Anteile wurden auf 

die Kontrollen normiert. 

11 MeV Kohlenstoff-Ionen und 0,29 bzw. 0,23 Aberrationen pro Gray 250 kV Röntgenstrahlung). 

Mit Kohlenstoffbestrahlung wird also bei gleicher Dosis die 2,7 bis 

u 

3,6fache Menge an Aberrationen erzeugt als nach Röntgenbestrahlung. Die Anzahl 

der Aberrationen nach Röntgenstrahlung ist in den G 2 -PCCs größer als in den Metaphasen. 

Die Verteilung von Zellen mit einer bestimmten Anzahl an Aberrationen änderte 

sich mit der Art der Strahlung (Abbildung III 1.9). Bei einer applizierten Dosis von 

2 Gy Kohlenstoff-Ionen wurden mehr geschädigte Zellen gefunden als nach Röntgenbestrahlung. 

Außerdem treten mehr Zellen mit einer größeren Zahl an Aberrationen 

pro Zelle auf. Beim Vergleich zwischen G 2 -PCCs und Metaphasen zeigt sich, dass 

in den G 2 -PCCs eine größere Zahl an aberranten Zellen auftritt, während sich die 

Verteilung der Zahl der Aberrationen pro Zelle nicht signifikant verändert. Die Anzahl 

der auswertbaren G 2 -PCCs und Metaphasen ist jedoch zu gering, um gesicherte 

Aussagen über den Einfluss der Strahlenart und der Methode auf die Anzahl der 

Fragmente treffen zu können. 

53



Aberrationen pro Metaphase bzw. G 2 

-PCC 

1,5 

1,0 

0,5 

0,0 

Kohlenstoff, 11 MeV/u: 

G 2 

-Phase (PCC) 

Metaphase 

Röntgen, 250 kV: 

G 2 

-Phase (PCC) 

Metaphase 

0 1 2 3 4 5 

Dosis [Gy] 

Abbildung III 1.8: Aberrationen pro G 2 -PCC bzw. Metaphase in Abhängigkeit von der 

Dosis, 54 Stunden nach der Bestrahlung in der G 0 /G 1 -Phase und dem Lösen der Kontaktinhibition. 

Bei gleicher Dosis treten nach Bestrahlung mit Kohlenstoff-Ionen mehr Aberrationen 

auf als nach Röntgenbestrahlung. Bei den G 2 -PCCs wurden mehr Aberrationen gezählt 

als bei den Metaphasen. 

54


12 

C, 11 MeV/u 

2 Gy 

G2-Phase 

12 

C, 11 MeV/u 

2 Gy 

M-Phase 

Anteil an Zellen [%] 

100 

80 

60 

Röntgen, 250 kV 

2 Gy 

G -Phase 

2 

Röntgen, 250 kV 

2 Gy 

M-Phase 

40 

20 

0 

0 1 2 3 4 5 6 

0 1 2 3 4 5 6 

Anzahl an Aberrationen pro Zelle 

Abbildung III 1.9: Veränderung der Verteilung der Zahl der Aberrationen in der ersten 

G 2 - und M-Phase, 54 Stunden nach der Bestrahlung mit einer Dosis von 2 Gy und dem 

Lösen der Kontaktinhibition. Nach Kohlenstoff-Bestrahlung ist der Anteil an ungeschädigten 

Zellen kleiner als nach Röntgenbestrahlung. Die Anzahl der Aberrationen pro Zelle ist nach 

Kohlenstoff-Bestrahlung größer als nach Röntgenbestrahlung. In den G 2 -PCCs wurden mehr 

aberrante Zellen gefunden als in den Metaphasen. 

55



56

2 Einfluss von BrdU 

Vorbemerkung 

Im Folgenden sind die Ergebnisse der Experimente zur Wirkung von BrdU auf das 

benutzte Modellsystem aufgeführt. Schwerpunkt der Untersuchungen waren die Veränderungen 

in der Zellzyklus-Verteilung durch den Einsatz von BrdU. Die Rahmenbedingungen 

entsprachen den Angaben auf Seite 41. Die ermittelten Messwerte sind 

im Anhang B aufgeführt. 

2.1 Veränderung des Wachstums 

Zur Beurteilung des Einflusses von BrdU auf die Wachstumskinetik wurden die AG- 

Zellen mit und ohne BrdU kultiviert und ihr Wachstum unter diesen Bedingungen 

bestimmt (Abschnitt II 3.2.1). Die dabei erhaltenen Ergebnisse wurden außerdem für 

die Planung der Experimente benötigt, um die geeigneten Zeitpunkte für die Zellaussaat 

und Probennahme festlegen zu können. Zum Zeitpunkt der Aussaat waren die 

Zellen in der G 0 /G 1 -Phase synchronisiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden im 

Zeitraum von 12 Tagen die Zellen trypsiniert, gezählt und die Anzahl der Verdoppelungen 

seit der Aussaat bestimmt. 

Die Wachstumskurven untergliedern sich in die für das Wachstum von Zellen charakteristischen 

Phasen. In der exponentiellen Phase wächst die Population stark an 

und geht schließlich in die stationäre Phase über, in der kein Wachstum mehr stattfindet 

(Abbildung III 2.1). 

Für die ohne BrdU kultivierten Zellen beträgt die Länge des Zellzyklus in der exponentiellen 

Phase 31 Stunden. Die stationäre Phase tritt nach 144 Stunden und drei 

Verdoppelungen ein (Aussaat: 6 000 Zellen ), es bildet sich ein Plateau aus, in diesem 

cm 2 

Fall bedingt durch die Kontaktinhibition (die Wachstumsfläche war voll besetzt). 

Bei Kultivierung mit BrdU wachsen die Zellen langsamer, der Zellzyklus ist hier in 

der exponentiellen Phase 67 Stunden lang. Nach 144 Stunden beginnt auch hier eine 

stationäre Phase, allerdings schon nach 1,25 Verdoppelungen. Da die Wachstumsfläche 

jedoch nicht voll bewachsen war, lässt sich dieses Plateau nicht auf Kontaktinhibition 

zurückführen (Aussaat ebenfalls 6 000 Zellen 

cm 2 ). 

57


Kapitel 2 – Einfluss von BrdU 

4,0 

3,5 

3,0 

ohne BrdU 

mit BrdU 

Verdoppelungen 

2,5 

2,0 

1,5 

1,0 

0,5 

0,0 

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288 312 

Zeit nach Aussaat [h] 

Abbildung III 2.1: Wachstum der AG-Zellen mit und ohne BrdU im Nährmedium. Zum 

Zeitpunkt der Aussaat waren die Zellen in der G 0 /G 1 -Phase synchronisiert 

2.2 Veränderung des Mitose- und 

Kondensationsindex 

. 

Zur Quantifizierung des Einflusses von BrdU auf die Teilungsaktivität der Zellen wurde 

der Mitoseindex aus Chromosomenpräparaten bei kontinuierlicher Kultivierung 

mit 10 µmol BrdU im Nährmedium bestimmt (Abbildung III 2.2). 

l 

Der Mitoseindex der mit BrdU kultivierten Kultur ist über den größten Teil des 

Experimentes immer niedriger als der Mitoseindex der Kontrollpopulation, die ohne 

BrdU im Medium kultiviert wurde. Das Maximum des Mitoseindex wird in der 

BrdU-Kultur 42 Stunden nach Lösen der Kontaktinhibition erreicht, bei der Kontrolle 

liegt es früher, zwischen 34 und 38 Stunden. In beiden Kulturen ist nur ein 

deutliches Maximum zu erkennen. Dies liegt daran, dass die Synchronität der Zellen 

nach dem ersten Zellzyklus-Durchlauf verloren geht. An seinem höchsten Punkt ist 

der Mitoseindex in der BrdU-Kultur mit 3 % um mehr als die Hälfte kleiner als in 

der Kontrollkultur (6,5 %). 

Nach der differentiellen Färbung der Chromosomen war bei jeder Metaphase 

die Zahl ihrer Zellzyklus-Durchläufe seit der Bestrahlung zu erkennen (Abschnitt 

II 3.2.4.3). Die Verteilung der Zellzyklus-Durchläufe zeigt, wann Zellen in 

der Kultur erscheinen, die in der Mitose am Ende ihres ersten, zweiten oder späteren 

Zellzyklus sind (Abbildung III 2.3). 

58

2.2 Veränderung des Mitose- und Kondensationsindex 

(a) Mitoseindex über die Zeit 

7,0 ohne BrdU 

mit BrdU 

6,0 

5,0 


4,0 

3,0 

2,0 

1,0 

0,0 

30 34 38 42 46 50 54 58 62 66 70 

Zeit nach Aussaat [h] 

Abbildung III 2.2: Anteil an AG-Zellen in erster, zweiter und späterer Mitose bei einer 

Kontrollpopulation nach Kultivierung ohne und mit BrdU im Medium (10 µmol 

ml 

). Bei Kultivierung 

mit BrdU im Medium ist der Mitoseindex kleiner als ohne BrdU. Außerdem wird 

das Maximum des Mitoseindex unter BrdU-Zugabe später erreicht. 

Die ersten Zellen, die in ihrer ersten Metaphase sind, erscheinen schon nach 34 Stunden 

in der Zellkultur. Nach 42 Stunden ist das Maximum dieser Phase erreicht. Nach 

46 Stunden sind bereits Zellen in der zweiten Metaphase zu beobachten, ihr Anteil 

ist jedoch wesentlich kleiner. Zellen in der dritten Metaphase seit Beginn des Experimentes 

lassen sich nur am Ende des untersuchten Zeitraumes, nach 66 Stunden, 

feststellen. Ihr Anteil liegt unterhalb des Promillebereiches. 

Die Höhe des Kondensationsindex mit und ohne BrdU wurde 54 Stunden nach der 

Aussaat bestimmt (Tabelle III 1.2). Er ist mit 41,5 % ohne BrdU-Zugabe größer als 

mit BrdU-Zugabe (27 %). Der Anteil an Zellen, die in der G 2 -Phase kondensieren hat 

sich von 31 % auf 8 % verringert. 

59



3,5 

3,0 

2,5 

1. Mitose 

2. Mitose 

3. Mitose 


2,0 

1,5 

1,0 

0,5 

0,0 

30 34 38 42 46 50 54 58 62 66 70 


Abbildung III 2.3: Anteil an AG-Zellen der Kontrollpopulation in der 1., 2. und 3. Mitose. 

Es erreichten immer weniger Zellen die nachfolgende Mitose. 

60

Teil IV 

Diskussion 

61

1 Einfluss von Strahlung 

Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung von Zellzyklus-Verzögerungen, die nach Bestrahlung 

mit schweren Ionen und Röntgenstrahlung auftreten und deren Auswirkungen 

auf die Detektion von Chromosomenschäden in primären menschlichen Fibroblasten. 

Als Modellsystem dienten dabei AG-Zellen, humane Vorhaut-Fibroblasten, 

die auch in einer Reihe von anderen strahlenbiologischen Arbeiten Verwendung fanden 

(Little und Nagasawa 1985, Fournier u. a. 1998; 2001, Füssel 1997, Größer 1998, 

Gotoh u. a. 1999, DeSimone u. a. 2000, Kawata u. a. 2001, Jha u. a. 2002). Obwohl 

humane Fibroblasten in vielen Studien als Modellsystem dienen (Rodemann u. a. 

1991, Di Leonardo u. a. 1994, Gadbois u. a. 1996, Linke u. a. 1997, Virsik-Peuckert 

u. a. 1997, Azzam u. a. 2000, DeSimone u. a. 2000, Herskind und Rodemann 2000), 

sind Zellzyklus-Verzögerungen zwar untersucht (Di Leonardo u. a. 1994, Gadbois u. a. 

1996, Azzam u. a. 2000, DeSimone u. a. 2000, Berger 2001), der Zusammenhang zur 

Detektierbarkeit von Chromosomenschäden aber nur wenig betrachtet worden (Berger 

2001, Nasonova u. a. 2001). 

Strahlenbedingte Veränderungen der Zellzyklus-Progression der AG-Zellen wurden 

daher mit verschiedenen Methoden untersucht, mit denen Anteile aus transientem 

und permanentem Arrest in verschiedenen Phasen des Zellzyklus besser unterschieden 

werden sollten. Daneben wurden auch strahleninduzierte Chromosomenschäden 

untersucht. Zur Bestrahlung wurden 11 MeV Kohlenstoff-Ionen und 250 kV Röntgenstrahlen 

benutzt. Da ein möglicher Einfluss von BrdU auf die zu untersuchenden 

u 

biologischen Endpunkte nicht ausgeschlossen werden konnte, sondern nach Berger 

(2001) sogar kritisch betrachtet werden muss, wurde auch dieser Aspekt in den Experimenten 

und der Diskussion gesondert behandelt. 

1.1 Veränderungen der Zellzyklus-Progression 

Strahlung erzeugt in der DNA Schäden, welche die Funktion der Zelle beinträchtigen 

können. Proliferierende Zellen sind in dieser Hinsicht besonders strahlenempfindlich, 

da hohe Anforderungen an ihre Wachstums- und Teilungsfähigkeit gestellt werden. 

Die Induktion von Zellzyklus-Verzögerungen nach Schwerionen- und Röntgenstrahlung 

wurde in vielen Arbeiten verglichen (Lücke-Huhle u. a. 1979, Scholz u. a. 1994; 

1998, Gadbois u. a. 1996, Azzam u. a. 2000). 

Insbesondere bei Fibroblasten kann zwischen transientem und permanenten 

Zellzyklus-Arrest unterschieden werden (Di Leonardo u. a. 1994). Es wird diskutiert, 

ob die strahlenbedingte Verzögerung der Zellzyklus-Progression an Kontrollpunkten 

63

Teil IV – Diskussion 


ein Mechanismus ist, welcher der Zelle Zeit zur Reparatur von Schäden gibt. Eine 

transiente Verzögerung wird nach dieser Vorstellung von der Zelle dann aufgehoben, 

wenn die Reparatur abgeschlossen ist. Ist die Verzögerung hingegen permanent, 

könnten dadurch Zellen mit irreparablen oder falsch reparierten Schäden aus der reproduktiven 

Population entfernt und damit die genetische Stabilität sichergestellt 

werden. Dies dient auch der Tumor-Suppression (Sager 1989, Di Leonardo u. a. 1994, 

Hartwell und Kastan 1994, Gupta u. a. 1996, Linke u. a. 1997, Azzam u. a. 2000). 

In verschiedenen Arbeiten wurde gezeigt, dass Fibroblasten nach Bestrahlung verfrüht 

terminal differenzieren (Rodemann u. a. 1991, Herskind u. a. 1998, Herskind 

und Rodemann 2000) und Seneszenz-ähnliche Stadien (Gadbois u. a. 1996) dominieren, 

die Zellen also weiter leben, während der Zelltod durch Apoptose keine Rolle 

spielt (Enns u. a. 1998, Berger 2001). Es ist wahrscheinlich, dass diesem Differenzierungsprozess 

ein permanenter Arrest vorausgeht (Burger u. a. 1998, Stein u. a. 1999). 

Es stellt sich die Frage, an welchen Kontrollpunkten des Zellzyklus die Zelle arretiert 

(Gadbois u. a. 1996). In den meisten Studien wird gezeigt, dass in der G 1 -Phase 

Zellzyklus-Arreste auftreten (Di Leonardo u. a. 1994, Williams u. a. 1997, Azzam u. a. 

2000), es wurden aber auch G 2 -Arreste gemessen (Gadbois u. a. 1996). Es wurde 

gezeigt, dass in Fibroblasten mit einem defekten p53-Gen ein wesentlich geringerer 

Arrest in der G 0 /G 1 -Phase auftritt (Linke u. a. 1997, Williams u. a. 1997, Azzam u. a. 

2000). 

Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Messungen mittels kontinuierlicher 

BrdU-Markierung und des Hoechst-BrdU-Quenchings und die Bestimmung des 

Mitose- und Kondensationsindex zeigen, dass permanente und auch wahrscheinlich 

transiente Zellzyklus-Verzögerungen in verschiedenen Zellzyklus-Phasen auftreten 

und dass ihre Ausprägung mit der Strahlenart zusammen hängt. 


Zur Untersuchung der Zellzyklus-Progression wurden mit der Methode der kontinuierlichen 

BrdU-Markierung über einen Zeitraum von 144 Stunden die Zellen detektiert, 

die nach der Bestrahlung BrdU in die DNA inkorporiert hatten. Dies erlaubt 

die Unterscheidung von Zellen, die nach dem Lösen der Kontaktinhibition in der 

G 0 /G 1 -Phase arretiert geblieben sind und solchen, die mindestens die erste S-Phase 

des Zellzyklus erreicht haben (Abschnitt II 3.2.2). 

Eine Abnahme der Markierungsrate nach der Bestrahlung bedeutet, dass über 

den betrachteten Zeitraum weniger Zellen die S-Phase erreichten als in den Kontrollen 

(Abbildung III 1.1, S. 42). Sowohl nach Bestrahlung mit Kohlenstoff-Ionen als 

auch nach Röntgenbestrahlung fiel die Markierungsrate mit steigender Dosis ab (Abbildung 

III 1.2, S. 43). Die Abnahme der Markierungsrate war dabei 72 Stunden 

nach der Bestrahlung mit Kohlenstoff-Ionen um das Dreifache höher als nach Röntgenstrahlung 

gleicher Dosis. Dementsprechend unterschiedlich sind auch die Dosen, 

die nötig sind, um einen nahezu völligen Stillstand der Teilungsaktivität auszulösen: 

64


Bei Kohlenstoff-Ionen genügen dazu 4 Gy, bei Röntgenstrahlung ist dies erst nach 

16 Gy der Fall. Die Ursachen für diese und die im Folgenden gezeigten Strahlenartabhängigen 

Reaktionen werden in Abschnitt IV 1.3 gesondert diskutiert. 

Wird das Markierungsniveau der Kontrollen nicht erreicht, ist dies ein Hinweis auf 

die Existenz eines strahlenbedingten langen, vermutlich permanenten G 0 /G 1 -Arrestes 

bei den AG-Zellen. Dies steht im Einklang mit den Beobachtungen anderer Experimentatoren 

(Azzam u. a. 2000, Gadbois u. a. 1996, DeSimone u. a. 2000, Linke u. a. 

1997, Di Leonardo u. a. 1994). 

In den Kontrollen beider Experimente ändert sich die Markierungsrate nach 

72 Stunden nicht mehr und es bilden sich Plateaus aus, obwohl die Fibroblasten 

noch genügend Wachstumsfläche für weitere Teilungen hatten. Die dabei zwischen 

den Kontrollen des Kohlenstoff- und Röntgenexperimentes auftretenden Unterschiede 

beruhten wahrscheinlich auf biologische Variabilitäten die durch die Verwendung 

zweier verschiedener Zell-Chargen ausgelöst wurden. Die Markierungsrate verändert 

sich im Zeitraum zwischen 72 und 144 Stunden nach Bestrahlung mit Kohlenstoff- 

Ionen nicht mehr deutlich, eine Plateaubildung ist nach 1 und 4 Gy zu erkennen und 

nach 2 Gy wahrscheinlich (Abbildung III 1.1(a), S. 42). 

Nach Kohlenstoffbestrahlung bilden sich nach 72 Stunden Plateaus aus, das bedeutet, 

dass keine nicht-markierten Zellen aus der G 0 /G 1 -Phase in den Zellzyklus eintreten, 

sie also wahrscheinlich permanent in der G 0 /G 1 -Phase arretiert sind. Außerdem 

bedeutet es, dass keine der bereits markierten Zellen weiter durch den Zellzyklus 

laufen, sie also in späteren Zellzyklus-Phasen permanent arretiert sein müssen. 

Nach Röntgenbestrahlung bilden sich dagegen keine Plateaus aus, die Markierungsrate 

steigt weiter an. Da dies in der Kontrollpopulation nicht der Fall ist, muss der 

Anstieg nach Bestrahlung von Zellen ausgelöst werden, die nach einem transienten Arrest 

wieder in den Zellzyklus eintreten. Diese transient arretierten Zellen könnten aus 

der ersten G 0 /G 1 -Phase heraus wieder in den Zellzyklus eingetreten sein und damit 

den Anteil an nicht-markierten Zellen verringern. Sie könnten aber auch als bereits 

markierte Zellen in einer späteren Zellzyklus-Phase arretiert worden sein. Wird diese 

Verzögerung aufgehoben und die markierten Zellen proliferieren weiter, so könnten 

sie den Anteil an markierten Zellen (bei gleich bleibender Anzahl der G 0 /G 1 -Zellen) 

erhöhen. Nach Röntgenbestrahlung gibt es einen großen Anteil transient arretierter 

Zellen. Hier muss beachtet werden, dass im Kohlenstoff-Experiment kein Mediumwechsel 

erfolgte, während dies im Röntgen-Experiment nach 72 Stunden geschah. Es 

ist denkbar, dass der Wiedereintritt arretierter Zellen in den Zellzyklus durch den 

Mediumwechsel beschleunigt oder sogar erst ermöglicht wurde. Ein Einfluss des Mediumwechsels 

auf die Zellzyklus-Verzögerung bei langer Kultivierungsdauer wurde 

auch bei DeSimone u. a. (2000) nach γ-Strahlung festgestellt. Es muss in weiteren 

Experimenten überprüft werden, wie groß die Anteile von transient und permanent 

arretierten Fibroblasten nach Schwerionenbestrahlung und einem Mediumwechsel zu 

einem späteren Zeitpunkt sind und in welchem Maße sich beide Strahlenarten unter 

exakt gleichen experimentellen Bedingungen unterscheiden. 

65



1.1.2 Hoechst-BrdU-Quenching 

Nach dem Einbau von BrdU konnte die Zellzyklus-Verteilung der Zellen flusszytometrisch 

gemessen und damit ihre Progression durch mehrere Zellzyklen über 144 Stunden 

verfolgt werden (Abschnitt II 3.2.3.3). Dabei decken sich die Ergebnisse der 

flusszytometrischen Messungen weitgehend mit den Befunden der kontinuierlichen 

BrdU-Markierung. 

Der Anteil an Zellen die in der ersten G 0 /G 1 -Phase inhibiert werden, nimmt mit 

steigender Dosis zu. Der Anstieg ist 72 Stunden nach der Bestrahlung mit Kohlenstoff- 

Ionen um den Faktor zwei größer als nach Röntgenbestrahlung gleicher Dosis. Nach 

4 Gy Kohlenstoff-Ionen bzw. 16 Gy Röntgenstrahlung war die Zellzyklus-Progression 

nahezu vollständig inhibiert (Abbildung III 1.5, S. 48). 

Ein Teil der Zellen blieb über die gesamte Dauer des Experiments in der ersten 

G 0 /G 1 -Phase arretiert, da deren Phasenanteil für die unterschiedliche Strahlendosen 

bei beiden Strahlenarten nie das Kontrollniveau erreichte (Abbildung III 1.3, S. 45). 

Dies weist auf einen langen, wahrscheinlich permanenten Zellzyklus-Arrest hin. Der 

Anteil an Zellen in der G 0 /G 1 -Phase stimmte dabei mit den in der kontinuierlichen 

BrdU-Markierung gemessenen Werten nahezu überein (Abbildung III 1.2, S. 43 und 

Abbildung III 1.5, S. 48). 

Wie auch bei der kontinuierlichen BrdU-Markierung änderte sich der Anteil an 

Zellen in der G 0 /G 1 -Phase bei den Kontrollen nach 72 Stunden nicht mehr (Abbildung 

III 1.3, S. 45), was mit den Ergebnissen von Berger (2001) übereinstimmt, wo 

dieser Anteil unverändert bei 10–20 % lag. Übereinstimmend mit den Ergebnissen 

der kontinuierlichen BrdU-Markierung zeigen sich 72 Stunden nach der Bestrahlung 

mit 1 und 4 Gy Kohlenstoff-Ionen Plateaus, nach 2 Gy unterscheiden sich die jeweiligen 

Kurven im Verlauf, wodurch eine eindeutige Aussage nicht möglich ist. Nach 

Röntgenbestrahlung gibt es bei 2 bis 8 Gy dagegen keine Plateaubildung, der Anteil 

an Zellen in der G 0 /G 1 -Phase fällt 72 Stunden nach der Bestrahlung weiter ab. 

Dieser Rückgang der Zellzahl bedeutet, dass ein Teil der Zellen nach Röntgenbestrahlung 

transient arretiert wurde. In diesem Zusammenhang muss jedoch der in 

Abschnitt IV 1.1.1 diskutierte Mediumwechsel beachtet werden. 

Weiterhin ließ sich die Zellzyklus-Progression der AG-Zellen mittels Hoechst-BrdU- 

Quenching über mehrere Zellzyklus-Durchläufe und verschiedene Zellzyklus-Phasen 

verfolgen (Abbildung III 1.4, S. 46). Parallel zum Absinken des Phasenanteils an Zellen 

in der ersten G 0 /G 1 -Phase stieg in den mit 2 und 4 Gy Kohlenstoff-Ionen und 

Röntgenstrahlung bestrahlten Kulturen der Anteil an Zellen in der ersten G 2 -Phase, 

gefolgt von einem Anstieg in der zweiten G 1 -Phase (Abbildung III 1.4(c), (d) und 

(f), S. 46). Nach 72 Stunden waren diese Phasenanteile fast statisch, was darauf hin 

deutet, dass auch in der ersten G 2 - und zweiten G 1 -Phase ein langer, eventuell permanenter 

Zellzyklus-Arrest auftritt. Dieser muss jedoch nicht strahlenbedingt sein, 

da diese Arreste auch in den unbestrahlten Kontrollen in der zweiten G 1 Phase auftreten 

(Abbildung III 1.4(a) und (b), S. 46), jedoch wurde auch schon von anderen 

66


Autoren berichtet, dass Fibroblasten nach Durchlaufen des ersten Zellzyklus nach 

Bestrahlung verzögert werden können (Williams u. a. 1997, Azzam u. a. 2000, mit 

3 H), (Gadbois u. a. 1996, DeSimone u. a. 2000, mit BrdU). 

Obwohl sich mit dem Hoechst-BrdU-Quenching auch spätere Phasen, die auf das 

zweite Durchlaufen des Zellzyklus folgen untersuchen lassen, kann man nicht eindeutig 

zuordnen, aus welchen Zellzyklus-Phasen die transient arretierten Zellen kommen, 

die nach Röntgenbestrahlung zu späteren Zeitpunkten zu einem Rückgang des Anteils 

an Zellen aus der ersten G 0 /G 1 -Phase führen. Dies kann bedeuten, dass auch zu 

späten Zeitpunkten Zellen die erste G 0 /G 1 -Phase verlassen. Es kann aber auch eine 

Zunahme der Gesamt-Zellzahl durch Proliferation von nicht verzögerten Zellen den 

relativen Anteil der ersten G 0 /G 1 -Phase herabsetzen, ohne dass Zellen tatsächlich in 

die nächste Zellzyklus-Phase übergehen. 

Generell muss beachtet werden, dass mit dem Hoechst-BrdU-Quenching nur die 

relative Verteilung der Zellen auf die Zellzyklus-Phasen bestimmt wurde. Prozentuale 

Anteile können gleich bleiben, auch wenn sie sich aus einem Gleichgewicht aus Zellzuund 

-abnahme zusammensetzen. 

1.1.3 Bestimmung des Mitoseindex 

Durch das Auftreten eines strahlenbedingten permanenten oder transienten Arrestes 

müsste die Teilungsaktivität und damit der Mitoseindex nach Bestrahlung geringer 

sein, als in den Kontrollen. Zur Bestimmung des Mitoseindex wurden die AG-Zellen 

mit Colcemid in der Metaphase akkumuliert und deren Anteil nach Chromosomenpräparation 

zwischen 30 und 70 Stunden bestimmt. 

Der Mitoseindex war in den bestrahlten Zellen immer niedriger als in den Kontrollen, 

es gelangen also nach Bestrahlung weniger Zellen in die Mitose. Daneben 

zeigte der Mitoseindex auch eine Dosisabhängigkeit, mit steigender Dosis wurden in 

den Präparaten weniger Metaphasen gefunden (Abbildung III 1.6, S. 51). Dabei gab 

es Unterschiede zwischen den Strahlenarten: Während der Mitoseindex nach 4 Gy 

Kohlenstoff-Ionen über den gesamten Untersuchungszeitraum beinahe null war, war 

dies für Röntgenstrahlung erst nach 16 Gy der Fall. 

Der Mitoseindex von bestrahlten Proben blieb auch zu späteren Zeitpunkten immer 

unter dem Index der Kontrollen. Dies weist ebenfalls auf einen Anteil permanent 

arretierter Zellen hin. Daneben deutet die Aufweitung des Maximums des Mitoseindex 

in die Breite wahrscheinlich auf Zellen hin, die nach einem transienten Arrest 

erst später in die Mitose eintreten. Ein Unterschied in der Breite dieser Aufweitung 

nach Bestrahlung mit Kohlenstoff-Ionen oder Röntgenstrahlung konnte nicht festgestellt 

werden. Diese Ergebnisse decken sich mit den Beobachtungen anderer Autoren 

(Füssel 1997, Berger 2001). 

67



1.1.4 Vorzeitige Chromosomenkondensation 

Neben dem Mitoseindex wurde auch der Anteil an mit Calyculin A kondensierbaren 

Zellen nach 30, 54 und 70 Stunden bestimmt, wobei nur zu den ersten beiden 

Zeitpunkten verwertbare Ergebnisse vorliegen (Tabellen III 1.1 und III 1.2). Da die 

Zellen in der G 0 /G 1 -Phase nicht kondensierbar sind, lässt sich ein Arrest in dieser 

Phase indirekt über den Anteil an kondensierbaren Zellen nachweisen. Strahlenbedingte 

Zellzyklus-Verzögerungen konnten ebenfalls anhand der PCC-Präparate nachgewiesen 

werden, da die nach 30 Stunden bestimmten Kondensationsindizes in den 

bestrahlten Proben gegenüber den Kontrollen deutlich verringert waren. Ein niedriger 

Kondensationsindex bedeutet, dass sich weniger Zellen in der S-, G 2 - und M-Phase 

befanden, da nur diese Phasen mit der Methode darstellbar sind (Durante u. a. 1998). 

Es muss also ein größerer Anteil an Zellen in der ersten G 0 /G 1 -Phase des Zellzyklus 

arretiert worden sein. Ob dieser Arrest transienter oder permanenter Natur ist, lässt 

sich aus der geringen Zahl von Proben nicht schließen. 

Der Kondensationsindex zeigte eine Dosisabhängigkeit, wobei er nach Bestrahlung 

mit Kohlenstoff-Ionen stärker mit der Dosis abfiel als nach Röntgenbestrahlung. Nach 

30 Stunden und 2 Gy Kohlenstoff-Bestrahlung fiel er um das Neunfache, nach 2 Gy 

Röntgenstrahlung dagegen nur um das Zweifache. 

54 Stunden nach Beginn des Experiments waren die Unterschiede zwischen Kontrollen 

und bestrahlten Zellen hinsichtlich des Kondensationsindex nur noch gering. Der 

Grund dafür könnte ein Arrest der Kontrollen in einer späteren G 1 -Phase sein. Eine 

Erklärungsmöglichkeit wäre, dass Zellen zwar auch in anderen Phasen des Zellzyklus 

(S-, G 2 - und M-Phase) arretiert werden, aber ihre Fähigkeit zur Kondensation unter 

Einfluss von Calyculin A blockiert wird. Die Wirkung von Calyculin A beruht auf 

einer Hemmung von Phosphatasen, die im Normalzustand hemmend auf das Protein 

MPF wirken. Werden die Phosphatasen von Calyculin A gehemmt, kann ungehemmtes 

MPF die Kondensation auslösen (Gotoh u. a. 1995). Würde MPF in Folge des 

Zellzyklus-Arrestes jedoch durch einen anderen Prozess zusätzlich gehemmt, könnte 

das Calyculin A in sonst kondensierbaren Zellzyklus-Phasen seine Wirkung verlieren, 

da seine Hemmung der Phosphatasen nicht mehr die Aktivität des MPF ändern kann. 

1.1.5 Zusammenfassung – Zellzyklus-Verzögerungen 

Die Messung der Markierungsraten nach kontinuierlicher BrdU-Markierung, der Phasenverteilung 

mit Hoechst-BrdU-Quenching und des Mitose- und Kondensationsindex 

zeigen, dass sich die Fibroblastenpopulation als Folge der Bestrahlung in Subpopulationen 

aufteilt: Zellen, die ohne Zellzyklus-Verzögerung weiter proliferieren, Zellen, 

die nach einem transienten Arrest wieder in den Zellzyklus eintreten und Zellen, die 

sich nach einem permanenten Zellzyklus-Arrest nicht mehr teilen. 

Es hat sich gezeigt, dass die strahlenbedingten Zellzyklus-Verzögerungen in menschlichen 

Fibroblasten von der Dosis und dem LET der verwendeten Strahlung abhän- 

68


gen. Dabei erzeugt Schwerionenbestrahlung mit Kohlenstoff-Ionen bei gleicher Dosis 

durchgehend einen höheren Anteil permanent arretierter Zellen in der G 0 /G 1 -Phase 

als Röntgenstrahlung. Dies deckt sich mit den Beobachtungen von Azzam u. a. (2000), 

der berichtet, dass der Anteil an Fibroblasten, die permanent in der G 0 /G 1 -Phase 

arretiert werden nach Bestrahlung mit α-Teilchen mindestens so hoch ist, wie nach 

γ-Bestrahlung und bei dem die Fibroblasten nach der Bestrahlung mit α-Teilchen eine 

geringere klonogene Aktivität besitzen, also wahrscheinlich vermehrt ausdifferenzieren. 

Die in dieser Arbeit und bei Azzam u. a. (2000) gezeigten Ergebnisse stimmen 

nicht mit Ergebnissen von Gadbois u. a. (1996) überein, wonach nach Bestrahlung 

mit α-Teilchen ein geringerer Anteil an Zellen in der G 0 /G 1 -Phase arretiert als nach 

γ-Bestrahlung. 

Es konnte gezeigt werden, dass nach Bestrahlung mit Kohlenstoff-Ionen und Röntgenstrahlung 

und nach anschließender Lösung der Kontaktinhibition der permanente 

Zellzyklus-Arrest wahrscheinlich überwiegend in der G 0 /G 1 -Phase auftritt, aber auch 

Zellen in der ersten G 2 - und zweiten G 1 -Phase arretiert werden. Die Ergebnisse von 

Azzam u. a. (2000) zeigen ebenfalls, dass in der G 0 /G 1 -Phase bestrahlte Fibroblasten 

in der G 0 /G 1 -Phase arretiert werden. In der Arbeit von Gadbois u. a. (1996) werden 

hingegen asynchrone Populationen bestrahlt und Arreste auch in der ersten G 2 -Phase 

und zweiten G 1 -Phase beobachtet. Bei Azzam u. a. (2000) wird nicht über spätere 

Zellzyklus-Phasen berichtet. 

Der Anteil an vermutlich transient arretierten Zellen war nach Röntgenbestrahlung 

größer als nach Bestrahlung mit Kohlenstoff-Ionen. Auf Grund des nach Röntgenbestrahlung 

durchgeführten Mediumwechsels lässt sich dies nicht eindeutig auf 

die Strahlenart zurückführen. Die vermutlich transient arretierten Zellen ließen sich 

mit den verwendeten Methoden nicht auf eine einzelne Zellzyklus-Phase eingrenzen. 

Transiente Zellzyklus-Arreste nach Bestrahlung von Fibroblasten werden auch von 

anderen Autoren berichtet (Azzam u. a. 2000, DeSimone u. a. 2000, Di Leonardo u. a. 

1994). Bei Gadbois u. a. (1996) wird beschrieben, dass nach α-Bestrahlung mehr 

Zellen transient in G 0 /G 1 arretiert sind, als nach γ-Bestrahlung. Azzam u. a. (2000) 

dagegen schreibt, dass weniger Zellen nach α-Bestrahlung einen transienten Arrest 

in G 0 /G 1 erfahren, als nach γ-Bestrahlung. Dieser Widerspruch lässt sich mit den Ergebnissen 

dieser Arbeit nicht aufklären, solange der Einfluss des Mediumwechsels auf 

die Art und Dauer des Zellzyklus-Arrestes nicht bekannt ist. 

Die gezeigten Zellzyklus-Effekte müssen bei Chromosomen-Untersuchungen beachtet 

werden, da es sonst bei der Beurteilung einer Gesamtpopulation zu Fehleinschätzungen 

kommen kann: Zu verschiedenen Zeiten können unterschiedlich starke Effekte 

gemessen werden, da die Subpopulationen eines Messpunktes verschiedene Anteile 

ausmachen können. 

69



1.2 Erzeugung von Chromosomenschäden 

Die Erzeugung von Schäden an der DNA ist der Auslöser für Chromsomenaberrationen 

und ein Hauptgrund für die biologische Wirkung ionisierender Strahlen. Chromsomenaberrationen 

führen zum Verlust der genetischen Integrität und können zu 

Spätschäden im Organismus führen, ein Aspekt, der bei der Analyse von Chromosomenschäden 

beleuchtet werden kann. Da die Chromosomenanalyse üblicherweise an 

Metaphasen durchgeführt wird, sind bis zur Analyse bereits zelluläre Prozesse abgelaufen, 

die bei der Bewertung der Ergebnisse berücksichtigt werden müssen. In dieser 

Arbeit wurden deshalb Chromosomenpräparate analysiert, die aus der G 2 - und der 

Metaphase stammten. An ihnen sollte der Einfluss von Dosis und Strahlenart und 

die Veränderungen von Chromosomenaberrationen zwischen der G 2 - und Metaphase 

untersucht werden. 

Der Anteil an aberranten Zellen stieg nach Bestrahlung mit Kohlenstoff-Ionen zuerst 

mit der Dosis an, fiel aber nach Erreichen eines Maximums bei etwa 1 Gy wieder 

ab. Nach Röntgenbestrahlung stieg die Anzahl ebenfalls an, es wurde aber im 

untersuchten Dosisbereich kein Maximum erreicht (Abbildung III 1.7, S. 53). Das 

beobachtete Absinken der Zahl aberranter Zellen liegt vermutlich daran, dass nach 

höheren Dosen bei großen Teilen der Zellpopulation starke Schädigungen auftreten 

und diese zu sehr langen Verzögerungen des Zellzyklus führen, wodurch nur noch 

die Zellen mit einer geringeren Schädigung den Untersuchungszeitpunkt erreichen 

(Nasonova u. a. 2001). Nach Röntgenstrahlung wurde dieser Effekt nicht beobachtet, 

vermutlich weil die Zahl der aberranten Zellen nur bis zu 4 Gy gemessen wurden. 

Die durch die Bestrahlung induzierten Störungen der Zellzyklus-Progression müssen 

deshalb bei der Analyse von Chromosomenschäden beachtet werden, da ein einfacher 

Rückschluss von der Zahl an aberranten Zellen auf den Ausgangsschaden zu einer 

Fehleinschätzung des tatsächlich in der Zellpopulation erzeugten Schadens führen 

kann (Nasonova u. a. 2001). 

Neben der Anzahl der aberranten Zellen wurde auch die in ihnen vorkommende 

Anzahl von Fragmenten und deren Verteilung ermittelt. Aus ihnen können Rückschlüsse 

auf die Prozesse der Schadenserzeugung nach unterschiedlicher Strahlung 

gezogen werden, sie wurde daher für die G 2 - und Metaphase nach Bestrahlung mit 

Kohlenstoff-Ionen und Röntgenstrahlung ausgewertet. Die absolute Menge von Aberrationen 

pro Zelle stieg im untersuchten Dosisbereich und in den Zellzyklus-Phasen 

linear mit der applizierten Dosis an (Abbildung III 1.8, S. 54). Die Steigung war nach 

der Bestrahlung mit Kohlenstoff-Ionen um das etwa Dreifache höher als nach Röntgenbestrahlung. 

Für die Verteilung der Aberrationen nach Kohlenstoffbestrahlung 

war die Anzahl der Aberrationen pro Zelle mit bis zu sechs höher als nach Röntgenbestrahlung, 

wo sie selten über drei lag (Abbildung III 1.9, S. 55). Bei anderen 

Autoren wurde eine linear-quadratische Abhängigkeit der Anzahl der Aberrationen 

von der Dosis beobachtet (Berger 2001, Füssel 1997). Bei diesen Autoren wurden 

jedoch zusätzlich andere Aberrationsarten (Chromatidbrüche, Ringbildungen, etc.) 

70

1.3 RBE von Kohlenstoff-Ionen 

berücksichtigt, wodurch der Unterschied in der Dosisabhängigkeit erklärbar ist. Die 

nach Kohlenstoff-Ionen gegenüber Röntgenstrahlung erhöhte Zahl an Aberrationen 

lässt sich durch die unterschiedliche Art der Dosisdeposition beider Strahlenarten 

erklären. Die Kohlenstoff-Ionen geben ihre Dosis in einem engen Bereich um ihre 

Flugbahn ab, was zu einer hohen Dichte an Ionisationsereignissen führt, die in getroffenen 

Chromosomen eine hohe Anzahl an Fragmenten erzeugen (Nasonova u. a. 2001). 

Bei Röntgenstrahlung sind die Ionisationsereignisse homogen verteilt, wodurch in den 

Chromosomen eine geringere Zahl von Aberrationen ausgelöst wird. Die von schweren 

Ionen erzeugten Chromosomenschäden sind von der Zelle schlechter reparierbar also 

die Chromosomenschäden, die von Röntgenstrahlung erzeugt werden. Die schlechtere 

Reparierbarkeit führt zu einer erhöhten Zahl an Aberrationen in den Zellen (Löbrich 

u. a. 1998). 

Ein Vergleich zwischen den Chromosomenschäden in der G 2 - und in der Metaphase 

könnte Hinweise auf Reparaturprozesse geben, die zwischen diesen beiden Phasen 

ablaufen. In dieser Arbeit war sowohl der Anteil an aberranten Zellen als auch die 

Anzahl an Aberrationen in den AG-Zellen leicht erhöht (Abbildung III 1.7, S. 53 

und Abbildung III 1.8, S. 54). Die Verteilung der Zahl der Aberrationen änderte sich 

im Vergleich zwischen G 2 - und M-Phase nicht signifikant (Abbildung III 1.9, S. 55). 

Es wurde von Gotoh u. a. (1999) an G 2 -synchronisierten AG-Zellen gezeigt, dass 

nach Bestrahlung die Anzahl an Aberrationen in der G 2 -Phase höher ist als in der 

Metaphase. Für die Verringerung der Aberrationen von der G 2 -Phase zur Metaphase 

werden Reparaturprozesse verantwortlich gemacht (Kawata u. a. 2001). Das könnte 

auch die Ursache für die in dieser Arbeit gemessenen Unterschiede sein. Infolge der 

niedrigen Zahl an Messwerten können hier aber keine gesicherten Aussagen gemacht 

werden. 

Durch die Untersuchung der Chromosomenaberrationen wurde die Einschätzung 

von Berger (2001) und Nasonova u. a. (2001) bestätigt, dass beim Rückschluss von 

der Analyse von Chromosomenschäden auf den in einer Zellpopulation erzeugten 

Schaden die Rolle von Zellzyklus-Verzögerungen beachtet werden muss. Zudem wurde 

bestätigt, dass sich die Ausprägung der Chromosomenaberrationen nach Bestrahlung 

mit Kohlenstoff-Ionen von deren Ausprägung nach Röntgenbestrahlung unterscheidet. 

Außerdem wurden Hinweise darauf gefunden, dass sich die Zahl der aberranten Zellen 

und die Zahl der Aberrationen von der G 2 -Phase zur Metaphase verändern kann, was 

möglicherweise auf Reparaturprozesse zurückzuführen ist. 


Schwere Ionen haben im Vergleich zu Röntgenstrahlung eine erhöhte Wirkung auf 

die Ausprägung biologischer Effekte (Überblick in: Blakely und Kronenberg 1998). 

In dieser Arbeit waren die untersuchten Effekte von der Art der Strahlen abhängig, 

bei schweren Ionen führt eine im Vergleich zu Röntgenstrahlen deutlich niedrigere 

71



Dosis zum gleichen Effektniveau. Dies wird im Folgenden durch die jeweiligen RBE- 

Werte, die für verschiedene Endpunkte berechnet wurden, belegt (Tabelle IV 1.1). 

Da die Dosis-Effekt Beziehung in diesem Fall linear ist, ist die RBE im Gegensatz 

zur Inaktivierung und anderen Effekten (Weyrather u. a. 1999) unabhängig von der 

Dosis. 

Die frühe Zellzyklus-Progression wird nach Bestrahlung mit Kohlenstoff-Ionen 

deutlich stärker beeinflusst als nach Röntgenbestrahlung. So liegt die RBE für den 

Anteil nicht-markierter Zellen und damit das Verbleiben in der G 0 /G 1 -Phase nach 

kontinuierlicher BrdU-Markierung und nach 72 Stunden Inkubation gegenüber Röntgenstrahlung 

bei 2,5. Nach Hoechst-BrdU-Quenching liegt die RBE für den Anteil an 

Zellen in der G 0 /G 1 -Phase bei 2,1. Bei der Bestimmung der Anteile in der G 0 /G 1 - und 

G 2 -Phase mit Hoechst-BrdU-Quenching wurde der Anteil der Zellen in der S-Phase 

aus methodischen Gründen zu gleichen Teilen auf die G 0 /G 1 - und G 2 -Anteile verteilt, 

wodurch die RBE für Hoechst-BrdU-Quenching gegenüber dem RBE der kontinuierlichen 

BrdU-Markierung nach unten skaliert wird. 

Auch die Anzahl gemessener Chromosomenschäden ist nach Bestrahlung mit 

Kohlenstoff-Ionen größer als nach Röntgenstrahlung. Für die Anzahl der Aberrationen 

pro Zelle ergab sich eine RBE von 2,7 bis 3,7, abhängig davon, ob die Chromosomen 

in G 2 - oder M-Phase kondensiert vorlagen. 

Im Vergleich dazu wurde bei den gleichen Zellen nach Bestrahlung mit 11 MeV 

u 

Kohlenstoff-Ionen für die Zellinaktivierung eine RBE von 2,1 bei 10 % Überleben 

gefunden (Berger 2001). 

Die erhöhte RBE bei der Erzeugung von Zellzyklus-Verzögerungen und Chromosomenschäden 

mit Kohlenstoff-Ionen kann durch die physikalischen Eigenschaften die- 

Tabelle IV 1.1: Übersicht über die nach Schwerionenbestrahlung ( 12 C, 11 MeV 

u 

) gegenüber 

Röntgenbestrahlung (250 kV)ermittelten RBE-Werte. 

Endpunkt 

RBE 

kontinuierliche BrdU-Markierung 12 2,5 

Hoechst-BrdU-Quenching 13 2,1 

Aberrationsrate in der G 2 -Phase 145 2,7 

Aberrationsrate in der Metaphase 146 3,3 

1 Aus linearen Dosis-Effekt-Beziehung berechnet, daher unabhängig von der betrachteten Dosis. 

2 Anteil an Zellen in der G 0 /G 1 -Phase, 72 h nach der Bestrahlung. 

3 Anteil an Zellen in der G 0 /G 1 -Phase, 72 h nach der Bestrahlung. 

4 Anteil an Aberrationen pro Zelle, 54 h nach der Bestrahlung 

5 Ermittelt aus G 2 -PCC-Präparaten. 

6 Ermittelt aus Metaphase-Präparaten. 

72


ser Strahlen und deren besondere Wirkung erklärt werden. Durch die radial zur Teilchenspur 

sehr hohe lokale Dosis (Scholz und Kraft 1996) an dem Ort, an dem das Teilchen 

das Chromosom durchquert, werden viele DNA-Schäden produziert (Taucher- 

Scholz u. a. 1996). Es wird diskutiert, dass dabei „clustered lesions“ enstehen, d. h 

mehrere, im Bereich von wenigen helikalen Windungen liegende Veränderungen der 

DNA (Boei u. a. 2001), die eine schlechtere Reparierbarkeit zeigen (Löbrich u. a. 1998) 

und auf welche die Zelle mit Zellzyklus-Arresten reagiert (Blakely und Kronenberg 

1998). Die DNA-Schäden zeigen sich schließlich auch auf der chromosomalen Ebene 

(Nasonova u. a. 1998). Bei Röntgenstrahlung kommt es durch die homogene Dosisverteilung 

nicht zu einer derartigen lokalen Häufung von DNA-Schäden, die damit 

für die Zelle bei gleicher Dosis einfacher zu reparieren sind. Daraus erklärt sich die 

erhöhte RBE von Kohlenstoff-Ionen. 

73



74

2 Einfluss von BrdU 

Bei der Untersuchung der Zellzyklus-Progression ist es häufig wichtig, die Zellzyklus- 

Phase und die Anzahl der Zellzyklus-Durchläufe einer Zellpopulation zu bestimmen. 

Auch bei der Analyse von Chromosomenschäden ist eine klare Zuordnung der Zellen 

essentiell, da die Anzahl an Aberrationen nach jeder Zellteilung abnimmt (z. B. Boei 

u. a. 1996). Da der Zellzyklus wiederholt durchlaufen wird, lassen sich diese Parameter 

der Zelle nicht anhand einfach beobachtbarer Zellcharakteristika erkennen. Statt 

dessen werden zu ihrer Bestimmung zellfremde Chemikalien, z. B. Tritium oder BrdU, 

eingesetzt, die mit jedem Zyklusdurchlauf in der Zelle angereichert werden und deren 

Menge während der Untersuchung indirekt erfassbar ist (Perry und Wolff 1974, Latt 

u. a. 1977). 

Tritium, ein radioaktives Isotop des Wasserstoffs, wird als Teil des Nukleosides 

Thymidin in die DNA inkorporiert und kann durch Autoradiographie nachgewiesen 

werden. Die Sensitivität dieser Methode ist höher als die der alternativen Methode, 

bei der die der DNA mit dem Thymidin-Analogon BrdU markiert wird (Perry und 

Wolff 1974, Latt u. a. 1977). Sie wird jedoch aus Gründen des Strahlenschutzes nur 

noch selten angewendet. 

Mit BrdU wird aber ebenfalls ein Fremdstoff in die Zelle und in die DNA eingeführt, 

der möglicherweise Einfluss auf die biologischen Reaktionen des Modellsystems hat. 

Im Verlauf dieser Arbeit und auch bei Berger (2001) hat sich gezeigt, das dies für 

die verwendeten Fibroblasten der Fall ist und bei der Bewertung der gefundenen 

Resultate berücksichtigt werden muss. 

2.1 Zytotoxische Wirkung von BrdU 

BrdU besitzt eine andere Struktur als das Thymidin, für das es in die DNA inkorporiert 

wird und sein Einbau führt demnach zu Strukturveränderungen der DNA. Da 

die Erkennung spezifischer Oberflächenstrukturen der DNA bei der Regulation vieler 

biochemischer Prozesse eine große Rolle spielt, kann die Interkalation von BrdU 

zu Störungen führen. Außerdem wird die DNA durch die Strukturveränderungen 

des Chromatins zugänglich für Mutagene. BrdU selbst kann Fehlpaarungen auslösen, 

wenn es sich in der Enolform mit Guanosin statt Adenosin verbindet. Insgesamt 

führen diese Gründe zu Störungen in der Replikation und Genexpression, was die 

Viabilität der Zelle herabsetzt und sich in Zellzyklus-Verzögerungen äußern kann 

(Überblick in: Morris 1991). 

Um das BrdU auf seine zytotoxische Wirkung zu überprüfen, wurde das Wachstum 

75



der Zellen und der Mitoseindex mit und ohne BrdU über die Zeit verfolgt. Parallel 

dazu wurde der Kondensationsindex mit und ohne BrdU bestimmt und die Kontrollen 

der Bestrahlungsexperimente auf Effekte untersucht, die von BrdU ausgelöst werden 

könnten. 

Die Präsenz von BrdU im Nährmedium führte zu einer deutlichen Reduktion des 

Wachstums der Zellpopulation (Abbildung III 2.1, S. 58). Die ohne BrdU kultivierten 

Zellen erreichten nach sieben Tagen Konfluenz und stellten ihr Wachstum nach 

etwa drei Verdoppelungen ein. Die mit BrdU kultivierten Zellen stellten dagegen 

ihr Wachstum nach 120 Stunden und 1,5 Verdoppelungen ein. Diese Veränderungen 

wurden zwar von anderen Verfassern beobachtet (Smellie und Parsons 1979, Berger 

2001), sind aber über einen langen Zeitraum nicht in Publikationen beschrieben 

worden. Die Verminderung des Wachstums wird vermutlich durch Zellzyklus-Arreste 

ausgelöst. Die genaue Bestimmung der Zellzyklus-Phasen, in denen diese auftreten, 

soll hier mit der Kombination mehrerer Methoden versucht werden. 

Der Mitoseindex war in den mit BrdU kultivierten Zellen immer niedriger als in 

den Kontrollen (Abbildung III 2.2, S. 59). Das Maximum des Mitoseindex war nach 

Kultivierung mit BrdU um den Faktor drei kleiner als ohne BrdU, was darauf hin 

deutet, dass ein Teil der Zellen vor der ersten Mitose arretiert. Nach differentieller 

Färbung der Metaphasen wurden mehr Zellen im ersten Zellzyklus detektiert als 

im zweiten, was dafür spricht, dass auch ein Teil der Zellen nach der ersten Mitose 

arretiert (Abbildung III 2.3, S. 60). Die Ergebnisse der Messung des Mitoseindex 

stimmen mit den Ergebnissen von Berger (2001) überein. 

Der Kondensationsindex der Zellpopulation, die 30 Stunden mit BrdU kultiviert 

wurde war nach der Zugabe von BrdU um ein Drittel niedriger als der Kondensationsindex 

in der Zellpopulation, die 30 Stunden ohne BrdU kultiviert wurde (Tabelle 

III 1.2), woraus folgt, dass die toxische Wirkung von BrdU schon vor dem Einbau 

in die DNA auftritt. 

Die Ergebnisse des Hoechst-BrdU-Quenchings und der kontinuierlichen BrdU- 

Markierung zeigen, dass 10–20 % der Kontrollzellen nicht die G 0 /G 1 -Phase verließen 

(Abbildung III 1.3, S. 45) und wahrscheinlich dort arretiert wurden, dies war auch 

bei Berger (2001) der Fall. 

Bei den unbestrahlten Zellen gab es 72 Stunden nach dem Lösen der Kontaktinhibition 

weder bei der kontinuierlichen BrdU-Markierung noch beim Hoechst-BrdU- 

Quenching eine weitere Veränderung der Zellzyklus-Verteilung. Zu diesem Zeitpunkt 

waren beim Hoechst-BrdU-Quenching 20 % der Zellen in der ersten G 2 -Phase und 

60 % der Zellen in der zweiten G 1 -Phase arretiert (Abbildung III 1.4(a) und (b), 

S. 46). 

76

2.2 Einfluss auf den Zellzyklus 

2.2 Einfluss auf den Zellzyklus 

Die Ergebnisse der verschiedenen Methoden zeigen, dass bei der Kultivierung der 

in der G 0 /G 1 -Phase synchronisierten Fibroblasten mit BrdU Zellzyklus-Arreste vor 

allem in der ersten G 0 /G 1 - und zweiten G 1 -Phase nach Beginn der Kultivierung 

auftreten. 

Für die zytotoxische Wirkung wird zum einen der Einbau von BrdU in die DNA verantwortlich 

gemacht (Iliakis u. a. 1989). Der große Anteil an arretierten Zellen in der 

zweiten G 1 -Phase lässt sich dadurch erklären, dass mit jedem Zellzyklus-Durchlauf 

mehr BrdU in die DNA aufgenommen wird und stärkere Funktionsstörungen der 

DNA die Folge sind. 

Zum anderen hat wahrscheinlich bereits die Anwesenheit von BrdU eine zytotoxische 

Wirkung, ohne das es in die DNA eingebaut wird: Die unter Kultivierung mit 

BrdU verminderte Fähigkeit zur Kondensation mit Calyculin A zeigt, dass ein Teil 

der Zellen nicht aus der ersten G 0 /G 1 -Phase herausläuft, obwohl noch kein BrdU 

in die DNA eingebaut wurde. Dies wird auch durch die Beobachtungen von Berger 

(2001) unterstützt, wo die Präsenz von BrdU ausreichte, um die Anheftungseffizienz 

der Fibroblasten herabzusetzen. 

Zusammenfassend hat die Untersuchung der BrdU-Wirkung in Übereinstimmung 

mit den Ergebnissen von Berger (2001) gezeigt, dass BrdU eine zytotoxische Wirkung 

auf die verwendeten Fibroblasten hat, die dazu führt, dass Zellzyklus-Verzögerungen 

ausgelöst werden. Die Zellpopulation wird also schon durch die Messmethode in Subpopulationen 

untergliedert, was bei der Anwendung der Methoden bei dieser und 

möglicherweise auch bei anderen Zelllinien besonders berücksichtigt werden muss. 

77



78

3 Zusammenfassung und Ausblick 

In dieser Arbeit wurde das Auftreten strahleninduzierter Zellzyklus-Verzögerungen, 

deren Auswirkung auf die Analyse von Chromosomenschäden und die zytotoxische 

Wirkung von 5-Brom-2’-desoxyuridin mit in der G 0 /G 1 -Phase des Zellzyklus 

synchronisierten normalen humanen Hautfibroblasten untersucht. Dabei wurde die 

unterschiedliche Wirkung von niederenergetischen 11 MeV Kohlenstoff-Schwerionenu 

Strahlen und von 250 kV Röntgenstrahlung verglichen. 

Zellzyklus-Verzögerungen werden als Reaktion der Zelle diskutiert, welche die zur 

Verfügung stehende Zeit zur Reparatur von strahleninduzierten DNA- und Chromosomenschäden 

verlängern. Zwischen der Analyse von Chromosomenschäden und ihrer 

Entstehung durch DNA-Schädigungen ergibt sich durch Zellzyklus-Verzögerungen 

ein Zeitraum, in dem biologische Prozesse ablaufen, die bei einem Rückschluss auf 

den Ausgangsschaden berücksichtigt werden müssen. Die Analyse von Zellzyklus- 

Verzögerungen wird hauptsächlich mit BrdU durchgeführt, die Kenntnis der von 

BrdU ausgelösten Effekte ist daher für eine aussagekräftige Zellzyklus-Analyse essentiell. 

Die Zellzyklus-Verzögerungen wurden mittels kontinuierlicher BrdU-Markierung, 

flusszytometrischem Hoechst-BrdU-Quenching, Bestimmung des Mitoseindex und 

vorzeitiger Chromosomenkondensation (PCC) mit Calyculin A im Zeitraum von 

144 Stunden nach der Bestrahlung gemessen. Parallel dazu wurden Chromosomenschäden 

an Chromosomenpräparaten aus der Metaphase und nach PCC durch Bestimmung 

des Anteils an aberranten Zellen und der Zahl der Chromosomenfragmente 

analysiert. Daneben wurde der Einfluss von BrdU durch Messung der Wachstumskinetik 

und der Bestimmung des Mitoseindex mit und ohne BrdU-Zugabe verglichen. 

Durch die Kombination der vier Messmethoden konnte gezeigt werden, dass permanente 

und transiente Zellzyklus-Verzögerungen auftraten, die nach Bestrahlung mit 

Kohlenstoff-Ionen deutlich stärker ausgeprägt waren als nach Röntgenbestrahlung 

gleicher Dosis und die sich vor allem in der ersten G 0 /G 1 -Phase äußerten. Die transienten 

Zellzyklus-Verzögerungen waren bei geringer Nährstoffversorgung nach Bestrahlung 

mit Kohlenstoff-Ionen schwächer ausgeprägt als nach Röntgenbestrahlung mit 

besserer Nährstoffversorgung. Als Folge der Zellzyklus-Verzögerungen änderte sich 

die Detektierbarkeit der Chromosomenschäden, wobei zum Untersuchten Zeitpunkt 

nach Bestrahlung mit Kohlenstoff-Ionen mehr Chromosomenschäden im Vergleich zu 

den unbestrahlten Zellen gemessen wurden als nach Röntgenbestrahlung. Die Anwendung 

von BrdU führte bereits ohne Bestrahlung zu Zellzyklus-Verzögerungen eines 

Teils der Population, wobei die Zellen vornehmlich in der G 0 /G 1 -Phase arretierten. 

79


Kapitel 3 – Zusammenfassung und Ausblick 

Sie treten entweder gar nicht aus der G 0 /G 1 -Phase heraus oder arretieren in der 

zweiten G 0 /G 1 -Phase. 

Die Ergebnisse zeigen, dass durch die Bestrahlung ein Teil der Fibroblasten permanent 

arretiert wird, während ein anderer Teil nach einem transienten Zellzyklusarrest, 

vermutlich nach der Reparatur von DNA-Schäden, weiter proliferiert. Kohlenstoff- 

Ionen erzeugen mehr schwer reparierbare DNA-Schäden als Röntgenstrahlung. Dies 

könnte der Grund dafür sein, dass die Bestrahlung mit Kohlenstoff-Ionen vermehrt zu 

einem permanenten Arrest führt, der bei in der G 0 /G 1 -Phase bestrahlten Fibroblasten 

in dosisabhängiger Weise teilweise oder vollständig in der ersten G 0 /G 1 -Phase 

ausgelöst wird. Der nach Röntgenbestrahlung größere Anteil an transient arretierten 

Zellen kann sowohl auf die leichtere Reparierbarkeit der erzeugten DNA-Schäden 

zurückgeführt werden als auch auf eine die Proliferation fördernde Wirkung der Nährstoffversorgung. 

Da sich die Zellzyklus-Verzögerungen auf die Detektierbarkeit von 

Chromosomenschäden auswirken, können aussagekräftige Ergebnisse über die Höhe 

des Ausgangsschadens nur erhalten werden, wenn die Chromosomenschäden über 

einen längeren Zeitraum nach der Bestrahlung untersucht werden. Die im Rahmen dieser 

Arbeit festgestellte stärkere Ausprägung der Chromsomenschäden durch Bildung 

von mehr Fragmenten stimmt mit der bestehenden Modellvorstellung, dass schwere 

Ionen zu mehr Chromsomenschäden führen als Röntgenstrahlung überein. Die zytotoxische 

Wirkung von BrdU setzt vermutlich vor dem Einbau in die DNA ein, die 

Wirkung wird aber wahrscheinlich durch die Akkumulation in der DNA während der 

folgenden Zellzyklen verstärkt, was zum Auftreten starker Zellzyklus-Verzögerungen 

führt. 

In zukünftigen Experimenten sollte die Ausprägung transienter Verzögerungen der 

Zellzyklus-Progression nach Schwerionen-Bestrahlung weiter untersucht werden, wobei 

die Auswirkung der Nährstoffversorgung besonders berücksichtigt werden sollte. 

Solange keine alternative, nicht-toxische Methode zur Untersuchung der Zellzyklus- 

Verzögerungen entwickelt wird, ist die zytotoxische Wirkung von BrdU bei dessen 

Anwendung zur Analyse von Zellzyklus-Verzögerungen in die Diskussion mit einzubeziehen. 

Abschließend sei betont, dass die genaue Kenntnis der Zellzyklus-Kontrolle, 

der Prozesse der DNA- und Chromosomen-Schädigung und -Reparatur und deren 

Abhängigkeit von der Art der Strahlung für zukünftige Antworten auf viele wichtige 

strahlenbiologische Fragestellungen von grundlegender Bedeutung ist, wie z. B. 

der Einschätzung des individuellen Strahlenrisikos, der bemannten Luft- und Raumfahrt, 

der Strahlentherapie und der Entstehung von Krebs und daher durch weitere 

Arbeiten kontinuierlich erweitert werden muss. 

80

Anhang 

81

A Verwendete Materialien 

A.1 Chemikalien 

Tabelle A.1.1: Verwendete Chemikalien und ihre Bezugsquellen 

Bezeichnung 

Bezugsquelle 

5-Brom-2’-desoxyuridin BrdU 

5-Bromo-2’-deoxyuridine Labeling and Detection Kit II 

Roche Diagnostics, Mannheim 


Calyculin A 10 µg in Ethanol Sigma, Deisenhofen 

µl 

Colcemid 10 µg 

ml in H 2O 


Deconex 11 universal 

Dinatriumhydrogenphosphat Dodecahydrat 

Borer Chemie, Zuchwil, Schweiz 

Merck, Darmstadt 

EDTA-Trypsin-Lösung (1 g l EDTA, 0,5 g l Trypsin) PAN Systems, Aidenbach 

Eisessig 

EMEM mit EBSS 

Ethanol p.a. 

Ethidiumbromid 10 mg 

ml 

Eukitt 

Fötales Kälberserum (FCS) 

Giemsa (Azur-Eosin-Methylenblaulösung) 

L-Glutamin 

Glycerin 

Glycin 

Helipur H plus N 

Hoechst 33258 Bisbenzimid 

Isoton (Casyton) 

Kaliumchlorid 

Kaliumdihydrogenphosphat 

Magnesiumchlorid 

Methanol p.a. 

Natriumchlorid 

Natriumhydroxid 

Neomycin 10 000 U, Bacitracin 10 000 U 

Fortsetzung auf der nächsten Seite 


PAN Systems, Aidenbach 

LS Labor Service, Darmstadt und Merck, 

Darmstadt 

Sigma, Deisenhofen 

O.Kindler, Freiburg 





Serva, Heidelberg 

Serva, Heidelberg 


Schärfe, Reutlingen 





Darmstadt 




83

Anhang A – Verwendete Materialien 

Fortsetzung von Tabelle A.1.1 

Bezeichnung 

PBS, Pulver ohne Calcium und Magnesium 

PBS, sterile Lösung ohne Calcium und Magnesium 

Penicillin 10 000 U, Salzsäure 

Streptomycin 10 000 U 

tri-Natriumcitrat Dihydrat 

Tris(hydroxymethyl)aminomethan 

Wasser 

Zitronensäure 

Bezugsquelle 




Darmstadt 




Ultrareines Wasser aus Milli-Q Plus Filteranlage, 

Millipore, Eschborn 


A.2 Lösungen 

Zellkultur 

Tabelle A.2.1: Kulturmedium für AG-Zellen 

Menge Einheit Chemikalie 

500 ml EMEM Basis Medium mit EBSS 

50 ml (10 %) FCS 

5 ml (1 %) L-Glutamin 

5 ml (1 %) Neomycin/Bacitracin oder Penicillin/Streptomycin 

Tabelle A.2.2: Einfriermedium für AG-Zellen 


68,5 % (v/v) EMEM Basis Medium mit EBSS 

20 % (v/v) FCS 

10 % (v/v) Glycerin 

1 % (v/v) L-Glutamin 

0,5 % (v/v) Neomycin/Bacitracin oder Penicillin/Streptomycin 

Tabelle A.2.3: BrdU Stammlösung 1 mg 

ml 


20 mg BrdU 

20 ml Wasser 

Lösung sterilfiltrieren (⌀ 25 mm) 

84

A.2 Lösungen 

Chromosomenpräparation 

Tabelle A.2.4: Bestrahlungspuffer für die Chromosomenpräparation 


19,45 ml 0,2 M Dinatriumhydrogenphosphat 

0,55 ml 0,1 M Zitronensäure 

Tabelle A.2.5: 20× SSC 


175,3 g Natriumchlorid (3 M) 

88,4 g Natriumcitrat·2 H 2 O (0,3 M) 

ad 1000 ml Wasser 

Tabelle A.2.6: Giemsa Färbelösung für die Chromosomenpräparation und die kontinuierliche 

BrdU-Markierung, pH 6,8 


1 Teil 0,067 M Dinatriumhydrogenphosphat 

1 Teil 0,067 M Kaliumdihydrogenphosphat 

3–7 % Giemsa 

5 Tropfen 5 N Natronlauge bis pH 7,5, nur bei Gegenfärbung für kontinierliche 

BrdU-Markierung 

Kontinuierliche BrdU-Markierung 

Tabelle A.2.7: 500 mM Glycin, pH 2,0 


3,76 g Glycin 

50 ml Wasser 

tropfenweise 

Salzsäure bis pH 2.0 

ad 100 ml Wasser 

Tabelle A.2.8: Fixativ für die kontinuierliche BrdU-Markierung 


70 ml Ethanol p.a. 

10 ml 500 mM Glycin-Lösung 

20 ml Wasser 

85


Tabelle A.2.9: Substratlösung für S-Phasen-Markierung 


13 µl Nitroblautetrazoliumsalz (NBT) in Dimethylformamid, 70 % (v/v), 75 mg 

ml , 

1,5 ml, verbrauchsfertig BrdU Kit II 

10 µl 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat Toluidinsalz (BCIP), in 

Dimethylformamid, 70 % (v/v), 50 mg , 1,2 ml, verbrauchsfertig BrdU Kit II 

ml 

3 ml Substratpuffer, pH 9,5 

Flusszytometrie 

Tabelle A.2.10: Hoechst Färbelösung für Einparametermessung 


4 Teile PBS w / o 

1 Teile Ethanol p.a. 

µg 

16 

ml Hoechst 33258 

Tabelle A.2.11: Hoechst Färbelösung für Hoechst-BrdU-Quenching 


4 Teile PBS w / o 

1 Teile Ethanol p.a. 

µg 

16 Hoechst 33258 

ml 

µg 

1,6 Ethidiumbromid 

ml 

A.3 Verbrauchsmaterialien 

Tabelle A.3.1: Verbrauchsmaterialien und ihre Bezugsquellen 

Bezeichnung 

Deckgläser (60 mm × 24 mm) 

Deckgläser (rund, ⌀ 30 mm) 

Einwegpipetten (1 ml, 2 ml, 5 ml) 

Einwegpipetten (10 ml, 25 ml) 

Kryoröhrchen (1,8 ml) 

Objektträger (76 mm × 24 mm) 

Sterilfilter (⌀ 25 mm, 0,2 µm Porengröße, Spritzenaufsatz) 

Zellkulturflaschen (12,5 cm 2 , 25 cm 2 , 75 cm 2 ) 

Zellkulturschalen (⌀ 35 mm, ⌀ 60 mm) 

Zellzählgefäße (10 ml) 

Zentrifugenröhrchen (10 ml, 12 ml, 50 ml) 

Bezugsquelle 

IDL, Nidderau 

IDL, Nidderau 

Greiner, Frickenhausen 

Corning Costar, Wiesbaden 


IDL, Nidderau 

Schleicher+Schuell, Einbeck 

BD Falcon, Lincoln Park, USA 

Nunc, Wiesbaden 

Schärfe, Reutlingen 


86

A.4 Geräte 

A.4 Geräte 

Tabelle A.4.1: Verwendete Geräte und ihre Hersteller 

Gerät Bezeichnung Hersteller 

Autoklaven Varioklav-Dampfsterilisator H+P Labortechnik, München 

Vertikalautoklav 5075ELV Tuttnauer, Hauppauge, USA 

Durchflusszytometer PAS II Partec, Münster 

Multicycle (Software) 

Phoenix Flow Systems, San Diego, USA 

WinMDI (Software) 

The Scripps Research Institute, La Jolla, USA 

Kamera Nikon Coolpix 990 Nikon Instruments, Melville, USA 

Hybridisator HB-2D Techne, Princeton, USA 

Inkubatoren BBD 6220 Kendro/Heraeus Instruments, Hanau 

Mikroskope Leica DMIL (invers) Leica, Wetzlar 

Leica DMRB 

Leica, Wetzlar 

Leitz Aristoplan 

Leica, Wetzlar 

Pipetten Eppendorf Research Eppendorf, Hamburg 

Pipettierhilfe Pipetus-akku Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt 

Röntgenröhre IV-320-12 Seifert, Bridge Port, USA 

Sterilisator SUT 6200 Kendro/Heraeus Instruments, Hanau 

Stickstoffbehälter GT80 Air Liquide, Düsseldorf 

Trockenschrank T 6200 Kendro/Heraeus Instruments, Hanau 

UV-Lampen L1 (λ = 360 nm) Novodirekt, Karlsruhe 

VL-115L 

Illkirch, Frankreich 

Wasser Milli-Q Plus Millipore, Eschborn 

Werkbänke Filtair 804N Captair, Köln 

Herasafe HSP 12 

Kendro/Heraeus Instruments, Hanau 

LaminAir HLB 2448 

Kendro/Heraeus Instruments, Hanau 

Zellzählung Casy 1 Modell TT Schärfe, Reutlingen 

Zentrifugen Megafuge 1.0 Kendro/Heraeus Instruments, Hanau 

87


88

B Messergebnisse 

B.1 Kontinuierliche BrdU-Markierung 

Markierung nach Schwerionenbestrahlung ( 12 C, 11 MeV 

u ) 

Tabelle B.1.1: Kontinuierliche BrdU-Markierung, 0 Gy, Schwerionenbestrahlung ( 12 C, 11 MeV 

u ) 

Zeit [h] Markierung Markierungsrate Standardabweichung Felder 

− + ⌀ der Summe ⌀ der Gesichtsfelder 

4 1 188 56 0,05 0,03 0,03 6 

16 1 136 121 0,10 0,09 0,03 10 

24 2 943 1 712 0,37 0,42 0,15 12 

36 515 823 0,62 0,64 0,03 10 

48 385 866 0,69 0,71 0,08 10 

60 542 1 776 0,77 0,77 0,06 2 

70 554 1 551 0,74 0,74 0,07 9 

120 260 794 0,75 0,75 0,07 10 

144 588 1729 0,75 0,75 0,03 2 


u ) 



2 900 22 0,02 0,02 0,02 4 

16 1 160 33 0,03 0,03 0,01 8 

24 1 306 159 0,11 0,11 0,02 10 

36 3 132 656 0,17 0,20 0,09 10 

48 1 370 558 0,29 0,29 0,08 10 

60 1 489 716 0,32 0,33 0,02 2 

70 801 443 0,36 0,37 0,04 10 

120 3 287 963 0,23 0,29 0,12 20 

144 2 219 1172 0,35 0,31 0,09 9 

89

Anhang B – Messergebnisse 


u ) 



16 877 19 0,02 0,02 0,02 10 

24 806 48 0,06 0,06 0,03 10 

36 1 135 191 0,14 0,14 0,03 10 

48 827 226 0,21 0,22 0,06 10 

60 1 812 623 0,26 0,26 0,04 2 

70 1 885 525 0,22 0,21 0,07 10 

120 641 369 0,37 0,37 0,06 10 

144 2 514 1 442 0,36 0,36 0,03 10 


u ) 



2 476 3 0,01 0,01 0,01 4 

16 1 102 17 0,02 0,02 0,01 10 

24 1 278 50 0,04 0,04 0,01 10 

36 1 066 70 0,06 0,06 0,02 10 

48 1 108 81 0,07 0,07 0,03 10 

60 2 006 174 0,08 0,08 0,01 2 

70 2 722 266 0,09 0,09 0,03 12 

120 3 473 343 0,09 0,09 0,01 15 

144 1 905 201 0,10 0,10 0,02 2 

Markierung nach Röntgenbestrahlung (250 kV) 

Tabelle B.1.5: Kontinuierliche BrdU-Markierung, 0 Gy, Röntgenbestrahlung (250 kV) 



6 1 829 39 0,02 0,02 0,02 20 

12 1 706 33 0,02 0,02 0,02 20 

24 858 724 0,46 0,46 0,06 20 

30 576 874 0,60 0,61 0,09 20 

36 532 1 505 0,74 0,74 0,06 20 

48 532 2 343 0,81 0,83 0,06 20 

60 521 2 504 0,83 0,85 0,07 20 

72 438 2 224 0,84 0,84 0,04 20 

120 188 1 445 0,88 0,89 0,03 20 

144 146 1 099 0,88 0,89 0,04 20 

90

B.1 Kontinuierliche BrdU-Markierung 




12 1 600 23 0,01 0,01 0,02 20 

24 675 176 0,21 0,20 0,07 10 

30 845 478 0,36 0,37 0,09 20 

36 593 541 0,48 0,48 0,08 20 

48 856 1 221 0,59 0,59 0,07 20 

60 511 855 0,63 0,63 0,10 20 

72 599 979 0,62 0,62 0,09 20 

120 471 1 227 0,72 0,72 0,06 20 

144 501 1 300 0,72 0,73 0,08 10 




12 1 900 34 0,02 0,02 0,01 20 

24 1 768 130 0,07 0,07 0,02 20 

30 1 146 228 0,17 0,17 0,05 20 

36 1 620 353 0,18 0,19 0,04 20 

48 1 163 560 0,33 0,32 0,07 20 

60 942 524 0,36 0,35 0,06 20 

72 1 285 769 0,37 0,37 0,05 20 

120 782 809 0,51 0,51 0,06 20 

144 812 931 0,53 0,54 0,05 20 




12 2 351 38 0,02 0,02 0,02 20 

24 1 714 66 0,04 0,04 0,02 20 

30 1 645 77 0,04 0,05 0,03 20 

36 2 544 155 0,06 0,07 0,03 20 

48 2 400 224 0,09 0,09 0,04 20 

60 1 038 153 0,13 0,13 0,07 20 

72 2 509 252 0,09 0,11 0,05 20 

120 1 142 366 0,24 0,25 0,06 20 

144 890 455 0,34 0,34 0,07 20 

91





12 1 649 24 0,01 0,01 0,01 20 

24 1 626 46 0,03 0,03 0,02 20 

30 1 468 35 0,02 0,02 0,02 20 

36 1 440 39 0,03 0,03 0,02 20 

48 1 540 66 0,04 0,04 0,03 20 

60 1 463 74 0,05 0,05 0,03 20 

72 1 626 68 0,04 0,04 0,02 20 

120 1 472 123 0,08 0,08 0,03 20 

144 1 196 144 0,11 0,11 0,06 20 

B.2 Zellzyklus-Phasenverteilung nach 

Flussyztometrie 

Verteilung nach Schwerionenbestrahlung ( 12 C, 11 MeV 

u ) 

Tabelle B.2.1: Flusszytometrie, 0 Gy, Schwerionenbestrahlung ( 12 C, 11 MeV 

u ) 

Zeit [h] Erster Zellzyklus Zweiter Zellzyklus Dritter Zellzyklus 

G 0 /G 1 G 2 G 1 G 2 G 1 G 2 

30 0,40 0,49 0,02 

42 0,24 0,30 0,29 0,01 

54 0,20 0,27 0,42 

70 0,21 0,20 0,40 0,02 


u ) 


G 0 /G 1 G 2 G 1 G 2 G 1 G 2 

30 0,78 0,12 0,01 0,09 

42 0,67 0,15 0,09 0,09 

54 0,63 0,09 0,19 0,09 

70 0,52 0,13 0,21 0,01 0,13 

120 0,47 0,12 0,24 0,01 0,16 

92

B.2 Zellzyklus-Phasenverteilung nach Flussyztometrie 


u ) 


G 0 /G 1 G 2 G 1 G 2 G 1 G 2 

30 0,80 0,08 0,01 0,10 

42 0,72 0,09 0,08 0,10 

54 0,69 0,08 0,14 0,09 

70 0,64 0,11 0,14 0,11 

120 0,55 0,13 0,15 0,01 0,17 


u ) 


G 0 /G 1 G 2 G 1 G 2 G 1 G 2 

30 0,82 0,05 0,01 0,12 

42 0,88 0,05 0,01 0,06 

54 0,85 0,05 0,02 0,01 0,06 

70 0,83 0,05 0,02 0,10 

120 0,79 0,06 0,03 0,01 0,10 

Verteilung nach Röntgenbestrahlung (250 kV) 

Tabelle B.2.5: Flusszytometrie, 0 Gy, Röntgenbestrahlung (250 kV) 


G 0 /G 1 G 2 G 1 G 2 G 1 G 2 

6 0,89 0,01 

12 0,87 0,01 0,01 

16 0,87 0,01 0,01 

24 0,66 0,21 0,02 

30 0,40 0,36 0,11 

42 0,40 0,38 0,11 

54 0,14 0,09 0,61 0,03 0,04 

70 0,11 0,07 0,57 0,02 0,11 

120 0,10 0,10 0,60 0,03 0,10 

144 0,11 0,10 0,58 0,03 0,08 

93




G 0 /G 1 G 2 G 1 G 2 G 1 G 2 

6 0,85 0,01 

12 0,82 0,01 0,01 

24 0,77 0,04 0,01 

30 0,62 0,22 0,01 

42 0,39 0,18 0,22 

54 0,44 0,13 0,33 

70 0,41 0,12 0,34 

120 0,32 0,22 0,27 

144 0,29 0,10 0,32 0,05 0,09 



G 0 /G 1 G 2 G 1 G 2 G 1 G 2 

6 0,87 0,01 

12 0,85 0,02 0,01 

24 0,86 0,00 

30 0,81 0,04 

42 0,60 0,10 0,10 

54 0,63 0,07 0,16 

70 0,59 0,06 0,18 

120 0,47 0,10 0,18 

144 0,32 0,15 0,26 



G 0 /G 1 G 2 G 1 G 2 G 1 G 2 

12 0,80 0,01 0,01 

24 0,76 0,02 0,01 

30 0,71 0,03 0,01 

42 0,66 0,06 0,03 

54 0,74 0,07 0,04 

70 0,69 0,05 0,03 

120 0,66 0,04 0,03 

144 0,58 0,10 0,10 

94

B.3 Zellzyklus-Verteilung in PCC Präparaten 



G 0 /G 1 G 2 G 1 G 2 G 1 G 2 

12 0,84 0,01 0,01 

24 0,84 0,01 0,01 

30 0,75 0,01 0,01 

42 0,80 0,03 0,08 

54 0,84 0,03 0,01 

70 0,81 0,07 

120 0,83 0,07 0,01 

144 0,80 0,06 0,02 

B.3 Zellzyklus-Verteilung in PCC Präparaten 

Verteilung nach Schwerionenbestrahlung ( 12 C, 11 MeV 

u ) 

Tabelle B.3.1: 0 Gy, Schwerionenbestrahlung ( 12 C, 11 MeV 

u ) 

Zeit [h] Zellkerne S Erster Zellzyklus Zweiter Zellzyklus Kondensationsindex 

G 2 M G 2 M 

30 1 525 671 9 3 0,31 

54 2 404 67 8 3 1 0,03 

70 1 288 12 1 0,01 


u ) 


G 2 M G 2 M 

30 1 554 82 1 0,05 

54 2 127 46 7 2 0,03 

70 2 298 12 3 1 3 0,01 


u ) 


G 2 M G 2 M 

30 1 566 52 3 1 0,03 

54 2 482 40 6 1 3 0,02 

70 1 726 8 3 1 0,01 

95



u ) 


G 2 M G 2 M 

30 1 710 19 0,01 

54 1 642 6 2 0 

70 1 822 0 

Verteilung nach Röntgenbestrahlung (250 kV) 

Tabelle B.3.5: 0 Gy, Röntgenbestrahlung (250 kV) 


G 2 M G 2 M 

30 1 793 386 172 4 0,41 

30 1 018 348 29 0,27 

54 2 097 34 2 4 0,02 

70 1 000 3 0 

1 Kontrolle ohne BrdU-Zugabe 



G 2 M G 2 M 

30 1 013 159 6 0,14 

54 2 010 19 3 1 2 1 0,01 

70 1 000 0 



G 2 M G 2 M 

30 1 000 59 3 0,06 

54 1 185 8 1 0,01 

70 1 500 2 0 

96

B.4 Mitoseindex 


Zur Bestimmung des Mitoseindex wurden Mitosen und Kerne gezählt (linker Tabellenteil). 

Zur Bestimmung des Verhältnisses an Mitosen im ersten, zweiten und dritten 

Zellzyklus wurden nur Mitosen gezählt (rechter Tabellenteil). 

Metaphasen nach Schwerionenbestrahlung ( 12 C, 11 MeV 

u ) 


u ) 

Zeit [h] Interphasezellen Metaphasen Mitoseindex [%] Mitosen in im Zellzyklus Anteil [%] 

1. 2. 3. 1. 2. 3. 

24 1 061 0 

30 1 323 0 

34 1 636 10 0,61 10 100 

38 1 516 41 2,63 41 100 

42 3 137 100 3,09 100 100 

46 2 310 40 1,70 139 4 97 3 

50 1 553 10 0,64 85 15 85 15 

54 1 821 10 0,55 41 9 82 18 

58 1 831 6 0,33 17 26 40 60 

62 1 482 5 0,34 22 20 52 48 

66 2 041 10 0,49 40 27 5 56 38 7 

70 2 100 8 0,38 15 19 1 43 54 3 


u ) 


1. 2. 3. 1. 2. 3. 

24 1 192 0 

30 1 110 0 

34 2 000 1 0,05 1 100 

38 2 207 10 0,45 10 100 

42 1 890 30 1,56 30 100 

46 1 957 15 0,76 122 1 99 1 

50 2 825 22 0,77 121 100 

54 2 011 6 0,30 46 5 90 10 

58 1 700 2 0,12 34 6 85 15 

62 1 613 3 0,19 39 2 95 5 

66 1 500 1 0,07 17 3 85 15 

70 2 000 2 0,10 8 2 80 20 

97



u ) 


1. 2. 3. 1. 2. 3. 

24 1 019 0 

30 1 126 1 0,09 1 100 

34 2 753 4 0,15 4 100 

38 1 971 10 0,51 10 100 

42 1 653 14 0,84 14 100 

46 2 022 10 0,49 28 100 

50 2 183 16 0,73 66 8 89 11 

54 1 500 4 0,27 21 6 78 22 

58 2 008 8 0,40 11 4 4 58 21 21 

62 1 500 6 0,40 22 14 5 54 34 12 

66 1 021 1 0,10 9 5 3 53 29 18 

70 1 041 3 0,29 10 10 1 48 48 5 


u ) 


1. 2. 3. 1. 2. 3. 

24 1 560 0 

30 1 071 0 

34 2 000 0 

38 1 134 0 

42 1 284 1 0,08 1 100 

46 1 269 0 

50 1 500 1 0,07 1 100 

54 1 001 1 0,10 1 100 

58 1 050 0 

62 1 000 1 0,10 1 100 

66 1 059 0 

70 1 000 0 

98


Metaphasen nach Röntgenbestrahlung (250 kV) 

Tabelle B.4.5: 0 Gy ohne BrdU,Röntgenbestrahlung (250 kV) 

Zeit [h] Interphasezellen Metaphasen Mitoseindex [%] 

30 4 788 72 1,48 

34 2 000 136 6,37 

38 2 022 141 6,52 

42 

46 2 000 23 1,14 

50 1 000 17 1,67 

54 2 000 25 1,23 

58 1 000 12 1,19 

62 2 000 13 0,65 

66 2 000 15 0,74 

70 2 516 10 0,40 

Tabelle B.4.6: 0 Gy mit BrdU,Röntgenbestrahlung (250 kV) 


1. 2. 3. 1. 2. 3. 

30 2 051 2 0,10 2 100 

34 2 000 15 0,74 15 100 

38 2 220 40 1,77 40 100 

42 1 000 30 2,72 136 6 96 4 

46 3 602 41 0,74 72 46 61 39 

50 3 001 24 0,43 56 47 54 46 

54 3 818 30 0,16 19 61 24 76 

58 0 

62 2 000 15 0,05 1 34 3 97 

66 0 

70 2 000 3 0,00 3 12 3 17 67 17 

99


Tabelle B.4.7: 2 Gy,Röntgenbestrahlung (250 kV) 


1. 2. 3. 1. 2. 3. 

30 2 025 

34 3 425 12 0,35 12 100 

38 4 267 68 1,57 68 100 

42 1 637 30 1,80 140 100 

46 2 790 50 1,76 147 100 

50 2 127 17 0,79 115 100 

54 2 000 6 0,30 34 1 97 3 

58 2 000 2 0,10 58 2 97 3 

62 2 000 3 0,10 49 13 79 21 

66 2 000 3 0,10 44 15 75 25 

70 1 000 1 0,10 12 4 75 25 



1. 2. 3. 1. 2. 3. 

30 1 000 1 0,10 1 100 

34 1 000 

38 1 367 10 0,73 10 100 

42 3 553 43 1,20 43 100 

46 3 647 31 0,84 31 100 

50 2 782 12 0,43 12 100 

54 2 000 2 0,10 2 100 

58 2 000 2 0,10 2 100 

62 2 000 4 0,20 4 100 

66 2 000 3 0,10 5 2 71 29 

70 1 000 



1. 2. 3. 1. 2. 3. 

30 2 001 

34 1 000 

38 2 000 1 0,05 1 

42 1 000 2 0,20 2 100 

46 1 000 

50 1 000 

54 1 000 

58 1 000 

62 1 000 

66 1 000 1 0,10 1 100 

70 1 000 

100

B.5 Aberrationsdaten 



30 2 000 0 

34 1 000 0 

38 2 000 0 

42 1 000 0 

46 1 000 0 

50 1 000 0 

54 1 000 0 

58 1 000 0 

62 1 000 0 

66 1 000 0 

70 1 000 0 

1. 2. 3. 1. 2. 3. 

B.5 Aberrationsdaten 

Aberrationen nach Schwerionenbestrahlung ( 12 C, 11 MeV 

u ) 

Tabelle B.5.1: 54 h, Metaphasen, Schwerionenbestrahlung ( 12 C, 11 MeV 

u ) 

Dosis [Gy] Metaphasen mit n Aberrationen Aberrationsrate 

Aberrationen 

pro Metaphase 

0 1 2 3 4 5 ≥ 6 

0 47 1 2 0,06 0,10 

1 28 17 13 9 1 0,59 1,09 

2 23 5 3 4 3 3 3 0,48 1,61 

Tabelle B.5.2: 54 h, G 2 -Zellen (PCC), Schwerionenbestrahlung ( 12 C, 11 MeV 

u ) 

Dosis [Gy] G 2 -Zellen mit n Aberrationen Aberrationsrate 

Aberrationen 

pro Metaphase 

0 1 2 3 4 5 ≥ 6 

0 46 4 0,08 0,08 

1 25 18 16 3 5 1 0,63 1,26 

2 21 11 6 5 7 1 2 0,60 1,64 

101


Aberrationen nach Röntgenbestrahlung (250 kV) 

Tabelle B.5.3: 54 h, Metaphasen, Röntgenbestrahlung (250 kV) 

Dosis [Gy] Metaphasen mit n Aberrationen Aberrationsrate 

Aberrationen 

pro Metaphase 

0 1 2 3 4 5 ≥ 6 

0 57 0 0 

2 44 9 1 3 0,23 0,35 

4 29 17 15 3 0,55 0,92 

Tabelle B.5.4: 54 h, G 2 -Zellen (PCC), Röntgenbestrahlung (250 kV) 

Dosis [Gy] G 2 -Zellen mit n Aberrationen Aberrationsrate 

Aberrationen 

pro Metaphase 

0 1 2 3 4 5 ≥ 6 

0 49 1 0,02 0,04 

2 31 11 6 5 2 0,44 0,84 

4 29 10 13 4 5 1 0,53 1,21 

B.6 Wachstumskinetik 

Einfluss von Mediumwechsel (MW) und BrdU 

Tabelle B.6.1: Wachstum 

Zeit [h] ohne BrdU, ohne MW ohne BrdU, mit MW mit BrdU, mit MW 

Zellzahl Verdoppelungen Zellzahl Verdoppelungen Zellzahl Verdoppelungen 

0 83 300 0 62 000 0 62 000 0 

22 87 100 0,1 

24 65 000 0,1 59 400 0,1 

93 162 400 1,0 

104 216 900 1,8 136 000 1,1 

117 218 100 1,4 

128 354 200 2,5 149 300 1,3 

141 236 200 1,5 

150 605 600 3,3 144 100 1,2 

164 294 600 1,8 

102

Abbildungsverzeichnis 

I Einleitung 3 

I 1.1 Schematischer Überblick über den Zellzyklus . . . . . . . . . . . 5 

I 1.2 Simulation der Ionisationsereignisse an einer Teilchenspur . . . . 9 

I 1.3 Dosisprofil verschiedener Strahlenarten . . . . . . . . . . . . . . . 12 

II Material und Methoden 17 

II 3.1 Allgemeine Übersicht über die Experimentabschnitte . . . . . . . 25 

II 3.2 Untersuchungsbereich der Experimente . . . . . . . . . . . . . . 26 

II 3.3 Ablauf der kontinuierliche BrdU-Markierung . . . . . . . . . . . 26 

II 3.4 AG-Zellen nach kontinuierlicher BrdU-Markierung (Fotografie) . 27 

II 3.5 Ablauf der flusszytometrischen Messungen . . . . . . . . . . . . . 28 

II 3.6 Strahlengang des Partec PAS II Flusszytometers . . . . . . . . . 29 

II 3.7 Spektren nach eindimensionaler flusszytometrischer Messung . . 30 

II 3.8 Spektren nach Hoechst-BrdU-Quenching unbestrahlter Zellen . . 31 

II 3.9 Ablauf der Chromosomenpräparation . . . . . . . . . . . . . . . 32 

II 3.10 Illustration des Mechanismus der FpG-Färbung . . . . . . . . . . 34 

II 3.11 Ablauf der Fluoreszenz-plus-Giemsa Färbung . . . . . . . . . . . 35 

II 3.12 Metaphasen mit Colcemid (Fotografien) . . . . . . . . . . . . . . 36 

II 3.13 PCC mit Calyculin A (Fotografien) . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 

III Ergebnisse 41 

III 1.1 Kontinuierliche BrdU-Markierung, über die Zeit . . . . . . . . . . 42 

III 1.2 Kontinuierliche BrdU-Markierung nach 72 h über die Dosis . . . 43 

III 1.3 Hoechst-BrdU: G 0 /G 1 -Phasenanteile nach Bestrahlung . . . . . . 45 

III 1.4 Hoechst-BrdU: Zellzyklus-Progression nach Bestrahlung . . . . . 46 

III 1.5 Hoechst-BrdU: Anteile in G 0 /G 1 72 Stunden, über die Dosis . . . 48 

III 1.6 Mitoseindex nach Bestrahlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 

III 1.7 Anteil aberranter Zellen über die Dosis . . . . . . . . . . . . . . 53 

III 1.8 Aberrationen pro Zelle über die Dosis . . . . . . . . . . . . . . . 54 

103

Abbildungsverzeichnis 

III 1.9 Aberrationenverteilung, 2 Gy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 

III 2.1 Wachstum nach Kultivierung mit 10 µmol 

ml 

BrdU . . . . . . . . . . 58 

III 2.2 Mitoseindex nach Kultivierung mit und ohne BrdU . . . . . . . . 59 

III 2.3 Anteile 1., 2. und späteren Mitosen, Kontrolle . . . . . . . . . . . 60 

104

Abkürzungsverzeichnis 

AP 

BCIP 

BER 

BiBA 

BrdU 

CASY 

DNA 

EMEM 

FCS 

FpG 

G 1 -Phase 

G 2 -Phase 

Alkalische Phosphatase 

5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat Toluidinsalz 

Basenexzisionsreparatur 

Biologische Bestrahlungsanlage 

5-Brom-2’-desoxyuridin 

Zellzähl- und Analyse-System (cell counter and analyser system) 

Desoxyribonukleinsäure (deoxyribonuclein acid) 

Basismedium (Eagle’s minimal essential medium) 

Fötales Kälberserum (fetal calf serum) 

Fluoreszenz plus Giemsa 

Ruhephase der Zelle nach der Zellteilung (gap-Phase) 

Ruhephase der Zelle vor der Zellteilung (gap-Phase) 

G 0 /G 1 -Phase Ruhephase der Zelle (gap-Phase) 

GSI 

HR 

LET 

M-Phase 

MPF 

NBT 

NHEJ 

PBS 

Gesellschaft für Schwerionenforschung mbH 

Homologe Rekombination 

Linearer Energietransfer 

Metaphase 

Mitosefördernder Faktor (mitosis promoting factor) 

Nitroblautetrazoliumsalz 

non-homologous end joining 

Phosphatgepufferte Saline (phosphate buffered saline) 

105

Abkürzungsverzeichnis 

PBS w / o 

PCC 

RBE 

RCF 

S-Phase 

SEM 

UNILAC 

UV 

PBS ohne Calcium und Magnesium 

Vorzeitige Chromosomenkondensation (premature chromosome condensation) 

Relative Biologische Wirksamkeit (relative biological effectiveness) 

Relative Zentrifugalkraft (relative centrifugal force) 

Synthesephase 

Sekundärelektronen-Monitor (secondary electron monitor) 

Universaler Linearbeschleuniger (universal linear accelerator) 

Ultraviolett 

106

Literaturverzeichnis 

[Alberts u. a. 1994] Alberts, B. ; Bray, D. ; Lewis, J. ; Raff, M. ; Roberts, 

K. ; D., Watson. J.: Molecular Biology of the Cell. 3. Ausgabe. Garland Publishing 

Inc., New York, 1994 

[Azzam u. a. 2000] Azzam, E. I. ; Toledo, S. M. de ; Waker, A. J. ; Little, 

J. B.: High and Low Fluences of α-Particles Induce a G 1 Checkpoint in Human 

Diploid Fibroblasts. In: Cancer Res. 60 (2000), S. 2623–2631 

[Bartek und Lukas 2001] Bartek, J. ; Lukas, J.: Cell cycle. Order from destruction. 

In: Science 294 (2001), Nr. 5540, S. 66–67 

[Bayreuther u. a. 1988] Bayreuther, K. ; Rodemann, H. P. ; Francz, P. I. ; 

Maier, K.: Differentiation of Fibroblast Stem Cells. In: J. Cell Sci. Suppl. 10 

(1988), S. 115–130 

[Becher u. a. 2001] Becher, W. ; Konradt, M. ; Lenz, G. ; Lotz, D. ; Ragaller, 

I. ; Schaub, H. ; Scholz, M. ; Voss, B. ; Kraft, G.: A New Irradiation 

Facility for Biological Samples at the UNILAC / Gesellschaft für Schwerionenforschung. 

2001. – Jahresbericht 

[Bender u. a. 1988] Bender, M. A. ; Awa, A. A. ; Brooks, A. L. ; Evans, H. J. ; 

Groer, P. G. ; Littlefield, L. G. ; Pereira, C. ; Preston, R. J. ; Wachholz, 

B. W.: Current Status of Cytogenetic Procedures to Detect and Quantify Previous 

Exposures to Radiation. In: Mutat. Res. 196 (1988), S. 103–159 

[Benton und Benton 2001] Benton, E. R. ; Benton, E. V.: Space Radiation 

Dosimetry in Low-Earth Orbit and Beyond. In: Nucl. Instrum. Methods Phys. Res. 

B. 184 (2001), Nr. 1 

[Berger 2001] Berger, S.: Untersuchung der Wirkung von Schwerionenstrahlen 

auf menschliche Hautfibroblasten unter besonderer Berücksichtigung chromosomaler 

Veränderungen, Johannes Gutenberg-Universität Mainz, Dissertation, Dezember 

2001 

[Blakely und Kronenberg 1998] Blakely, E. A. ; Kronenberg, A.: Heavy-Ion 

Radiobiology: New Approaches to delineate Mechanisms underlying Enhanced Biological 

Effectiveness. In: Radiat. Res. 150 (1998), Nr. 5, S. S126–S145 

107


[Boei u. a. 1996] Boei, J. ; Vermeulen, S. ; Natarajan, A.: Detection of Chromosomal 

Aberrations by Fluorescence in Situ Hybridization in the First Three 

Postirradiation Divisions of Human Lymphocytes. In: Mutat. Res. 349 (1996), 

S. 127–135 

[Boei u. a. 2001] Boei, J. J. ; Vermeulen, S. ; Mullenders, L. H. ; Natarajan, 

A. T.: Impact of radiation quality on the spectrum of induced chromosome 

exchange aberrations. In: Int. J. Radiat. Biol. 77 (2001), Nr. 8, S. 847–857 

[Böhmer und Ellwart 1981] Böhmer, R.M. ; Ellwart, J.: Combination of BUdR- 

Quenched Hoechst Fluorescence with DNA-Specific Ethidium Bromide Fluorescence 

for Cell Cycle Analysis with a Two-Parameter Flow Cytometer. In: Cell 

Tissue Kinet. 14 (1981), S. 653–658 

[Burger u. a. 1998] Burger, A. ; Löffler, H. ; Bamberg, M. ; Rodemann, 

H. P.: Molecular and cellular basis of radiation fibrosis. In: Int. J. Radiat. Biol. 

73 (1998), Nr. 4, S. 401–408 

[Caldecott 2001] Caldecott, K. W.: Mammalian DNA Single-Strand Break Repair: 

An X-Ra(y)ted Affair. In: Bioessays 23 (2001), Nr. 5, S. 447–455 

[Carson und Lois 1995] Carson, D. A. ; Lois, A.: Cancer Progression and p53. 

In: Lancet 346 (1995), Nr. 8981, S. 1009–1011 

[Coulter 1956] Coulter, W. H.: High Speed Automatic Blood Cell Counter and 

Cell Size Analyser. In: Proc. Natl. Electr. Conf. Chicago, 1956, S. 1034–1040 

[Debus u. a. 1998] Debus, J. ; Wannenmacher, M. ; zur Hause, H. ; Specht, 

H. J. ; Pobell, F.: Proposal for a Dedicated Ion Beam Facility for Cancer Therapy, 

Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg, Proposal, September 1998 

[DeSimone u. a. 2000] DeSimone, J. N. ; Dolezalova, H. ; Redpath, J. L. ; 

Stanbridge, E. J.: Prolonged Cell Cycle Arrest in Irradiated Human Diploid 

Skin Fibroblasts: The Role of Nutrient Deprivation. In: Radiat. Res. 153 (2000), 

Nr. 2, S. 131–143 

[Di Leonardo u. a. 1994] Di Leonardo, A. ; Linke, S. P. ; Clarkin, K. ; Wahl, 

G. M.: DNA Damage Triggers a Prolonged p53-Dependent G 1 Arrest and Long- 

Term Induction of Cip1 in Normal Human Fibroblasts. In: Genes Dev. 8 (1994), 

S. 2540–2551 

[Durante u. a. 1998] Durante, M. ; Furusawa, Y. ; Gotoh, E.: A Simple Method 

for Simultaneous Interphase-Metaphase Chromosome Analysis in Biodosimetry. In: 

Int. J. Radiat. Biol. 74 (1998), Nr. 4, S. 457–462 

108


[Eickhoff u. a. 1999] Eickhoff, H. ; Haberer, T. ; Kraft, G. ; Krause, U. ; 

Richter, M. ; Steiner, R. ; Debus, J.: The GSI Cancer Therapy Project. In: 

Strahlenther. Onkol. 175 (1999), S. 21–24 

[Enns u. a. 1998] Enns, L. ; Barley, R. ; Paterson, M. ; Mirzayans, R.: Radiosensitivity 

in Ataxia Telangiectasia Fibroblasts is Not Associated with Deregulated 

Apoptosis. In: Radiat. Res. 150 (1998), S. 11–16 

[Fournier u. a. 1998] Fournier, C. ; Kraft-Weyrather, W. ; Kraft, G.: Survival, 

Differentiation and Collagen Secretion of Human Fibroblasts after Irradiation 

with Carbon Ions and X-Rays. In: Phys. Med. 14 (1998), S. 44–47 

[Fournier u. a. 2001] Fournier, C. ; Scholz, M. ; Weyrather, W. K. ; Rodemann, 

H. P. ; Kraft, G.: Changes of Fibrosis-Related Parameters after Highand 

Low-LET Irradiation of Fibroblasts. In: Int. J. Radiat. Biol. 77 (2001), Nr. 6, 

S. 713–722 

[Fournier 1999] Fournier, Claudia: Zelluläre und molekularbiologische Grundlagen 

der Fibrose nach Ionenbestrahlung, Technische Universität Darmstadt, Dissertation, 

1999 

[Fricke und Hart 1966] Fricke, H. ; Hart, E. J.: Radiation Dosimetry. Bd. 2. 

Academic Press, New York, 1966 

[Fujiki und Suganuma 1993] Fujiki, H. ; Suganuma, M.: Tumor Promotion by Inhibitors 

of Protein Phosphatases 1 and 2A: The Okadaic Acid Class of Compounds. 

In: Advances in Cancer Res. 61 (1993), S. 143–194 

[Füssel 1997] Füssel, K.: Chromosomenaberrationen in humanen Fibroblasten 

nach Bestrahlung mit hochenergetischen Kohlenstoff ionen und Röntgenstrahlung, 

Technische Hochschule Darmstadt, Dissertation, 1997 

[Gadbois u. a. 1996] Gadbois, D. M. ; Crissman, H. A. ; Nastasi, A. ; Habbersett, 

R. ; Wang, S. ; Chen, D. ; Lehnert, B. E.: Alterations in the Progression 

of Cells Through the Cell Cycle after Exposure to Alpha Particles or Gamma Rays. 

In: Radiat. Res. 146 (1996), S. 414–424 

[Gotoh u. a. 1995] Gotoh, E. ; Asakawa, Y. ; Kosaka, H.: Inhibition of Protein 

Serine/Threonine Phosphatases directly induces Premature Chromosome Condensation 

in Mammalian Somatic Cells. In: Biomed. Res. 16 (1995), S. 63–68 

[Gotoh u. a. 1999] Gotoh, E. ; Kawata, T. ; Durante, M.: Chromatid Break 

Rejoining and Exchange Aberration Formation following Gamma-Ray Exposure: 

Analysis in G 2 Human Fibroblasts by Chemically Induced Premature Chromosome 

Condensation. In: Int. J. Radiat. Biol. 75 (1999), Nr. 9, S. 1129–1135 

109


[Größer 1998] Größer, T.: Untersuchung strahleninduzierter Chromosomenaberrationen 

mittels Fluoreszenz in Situ Hybridisierung, Technische Universität Darmstadt, 

Diplomarbeit, 1998 

[Gupta u. a. 1996] Gupta, N. ; Vij, R. ; Haas-Kogan, D. A. ; Israel, M. A. ; 

Deen, D. F. ; Morgan, W. F.: Cytogenetic Damage and the Radiation-Induced 

G 1 -Phase Checkpoint. In: Radiat. Res. 145 (1996), S. 289–298 

[Hartwell und Kastan 1994] Hartwell, L. H. ; Kastan, M. B.: Cell Cycle Control 

and Cancer. In: Science 266 (1994), S. 1821–1828 

[Heilmann u. a. 1993] Heilmann, J. ; Rink, H. ; Taucher-Scholz, G. ; Kraft, 

G.: DNA Strand Break Induction and Rejoining and Cellular Recovery in Mammalian 

Cells after Heavy-Ion Irradiation. In: Radiat. Res. 135 (1993), Nr. 1, S. 46–55 

[Heilmann u. a. 1996] Heilmann, J. ; Taucher-Scholz, G. ; Haberer, T. ; 

Scholz, M. ; Kraft, G.: Measurement of Intracellular DNA Double-Strand Break 

Induction and Rejoining along the Track of Carbon and Neon Particle Beams in 

Water. In: Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 34 (1996), Nr. 3, S. 599–608 

[Heilmann u. a. 1995] Heilmann, J. ; Taucher-Scholz, G. ; Kraft, G.: Induction 

of DNA Double-Strand Breaks in CHO-K1 Cells by Carbon Ions. In: Int. J. 

Radiat. Biol. 68 (1995), Nr. 2, S. 153–162 

[Herskind u. a. 1998] Herskind, C. ; Bentzen, S. M. ; Overgaard, J. ; Overgaard, 

M. ; Bamberg, M. ; Rodemann, H. P.: Differentiation State of Skin 

Fibroblast Cultures versus Risk of Subcutaneous Fibrosis after Radiotherapy. In: 

Radiother. Oncol. 47 (1998), S. 263–269 

[Herskind und Rodemann 2000] Herskind, C. ; Rodemann, H. P.: Spontaneous 

and Radiation-Induced Differentiation of Fibroblasts. In: Exp. Gerontol. 35 (2000), 

S. 747–755 

[Hertveldt u. a. 1997] Hertveldt, K. ; Philippe, J. ; Thierens, H. ; Cornelissen, 

M. ; Vral, A. ; De, A.: Flow Cytometry as a Quantitative and Sensitive 

Method to Evaluate Low Dose Radiation Induced Apoptosis in vitro in Human Peripheral 

Blood Lymphocytes. In: Int. J. Radiat. Biol. 71 (1997), Nr. 4, S. 429–433 

[Hoeijmakers 2001] Hoeijmakers, J. H.: Genome Maintenance Mechanisms for 

Preventing Cancer. In: Nature 411 (2001), Nr. 6835, S. 366–374 

[IAEA Report Nr. 260 1986] IAEA Report Nr. 260: Biological Dosimetry: Chromosomal 

Aberration Analysis for Dose Assessment / International Atomic Energy 

Agency (IAEA). Vienna, 1986 (260). – Technical Report 

110


[ICRU Report Nr. 60 1998] ICRU Report Nr. 60: Fundamental Quantities and 

Units for Ionizing Radiation / International Commission on Radiation Units and 

Measurements (ICRU). Dezember 1998 (60). – Report 

[Ikushima und Wolff 1974] Ikushima, T. ; Wolff, S.: UV-Induced Chromatid 

Aberrations in Cultured Chinese Hamster Cells after One, Two, or Three Rounds 

of DNA Replication. In: Mutat. Res. 22 (1974), S. 193–201 

[Iliakis u. a. 1989] Iliakis, G. ; Wang, Y. ; Pantelias, G. E. ; Metzger, L.: 

Mechanism of Radiosensitization by Halogenated Pyrimidines: Effect of BrdU on 

Repair of DNA Breaks, Interphase Chromatin Breaks, and Potentially Lethal Damage 

in Plateau-Phase CHO Cells. In: Radiat. Res. 119 (1989), S. 286–304 

[Jha u. a. 2002] Jha, M. N. ; Bamburg, J. R. ; Bernstein, B. W. ; Bedford, 

J. S.: Caffeine Eliminates Gamma-Ray-Induced G 2 -Phase Delay in Human Tumor 

Cells But Not in Normal Cells. In: Radiat. Res. 157 (2002), S. 26–31 

[Johnson und Jasin 2000] Johnson, R. D. ; Jasin, M.: Sister Chromatid Gene 

Conversion is a Prominent Double-Strand Break Repair Pathway in Mammalian 

Cells. In: EMBO J. 19 (2000), Nr. 13, S. 3398–3407 

[Junkert u. a. 2002] Junkert, A. ; Vicek, G. ; Dymke, N.: Strahlung und Strahlenschutz. 

Bundesamt für Strahlenschutz, Salzgitter, 2002 

[Kawata u. a. 2001] Kawata, T. ; Durante, M. ; Furusawa, Y. ; George, K. ; 

Ito, H. ; Wu, H. ; Cucinotta, F. A.: Rejoining of Isochromatid Breaks Induced 

by Heavy Ions in G 2 -Phase Normal Human Fibroblasts. In: Radiat. Res. 156 

(2001), S. 598–602 

[Kiefer 1989] Kiefer, J.: Biologische Strahlenwirkung. 2. Auflage. Birkhäuser 

Verlag, Basel, Boston, Berlin, 1989 

[Kilthau 1996] Kilthau, G. F.: Cancer Risk in Relation to Radioactivity in Tobacco. 

In: Radiol. Technol. 67 (1996), Nr. 3, S. 217–222 

[Kirchner 1996] Kirchner, F.: Anwendungen der flußzytometrischen Auswertung 

des BrdU-Hoechst-Quenching-Effektes zur Untersuchung schwerioneninduzierter 

Proliferationsstörungen von Säugetierzellen, Universität Kassel, Diplomarbeit, 

1996 

[Kohn 1999] Kohn, K. W.: Molecular Interaction Map of the Mammalian Cell 

Cycle Control and DNA Repair Systems. In: Mol. Biol. Cell. 10 (1999), Nr. 8, 

S. 2703–2734 

111


[Kraft 1987] Kraft, G.: Radiobiological Effects of Very Heavy Ions: Inactivation, 

Induction of Chromosome Aberrations and Strand Breaks. In: Nucl. Sci. Appl. 3 

(1987), S. 1–28 

[Kraft 1990] Kraft, G.: The Radiobiological and Physical Basis for Radiotherapy 

with Protons and Heavier Ions. In: Strahlenther. Onkol. 166 (1990), Nr. 1, S. 10–13 

[Kraft 1998] Kraft, G.: Radiotherapy with Heavy Ions: Radiobiology, Clinical 

Indications and Experience at GSI, Darmstadt. In: Tumori. 84 (1998), Nr. 2, 

S. 200–204 

[Kraft 2001] Kraft, G.: What we can learn from Heavy Ion Therapy for Radioprotection 

in Space. In: Phys. Med. (2001), S. 13–20 

[Kraft-Weyrather u. a. 1989] Kraft-Weyrather, W. ; Kraft, G. ; Ritter, S. ; 

Scholz, M. ; Stanton, J.A.: The Preparation of Biological Targets for Heavy-Ion 

Experiments Up to 20 MeV/u. In: Nucl. Instrum. Methods. Phys. Res. 282 (1989), 

S. 22–27 

[Krämer und Kraft 1994] Krämer, M. ; Kraft, G.: Track Structure and DNA 

Damage. In: Adv. Space Res. 14 (1994), S. 151–159 

[Latt u. a. 1977] Latt, S. A. ; George, Y. S. ; Gray, J. W.: Flow Cytometric 

Analysis of Bromodeoxyuridine-Substituted Cells stained with 33258 Hoechst. In: 

J. Histochem. Cytochem. 25 (1977), Nr. 7, S. 927–934 

[Latt und Stetten 1976] Latt, S. A. ; Stetten, G.: Spectral Studies on 33258 

Hoechst and related Bisbenzimidazole Dyes useful for Fluorescent Detection of 

Deoxyribonucleic Acid Synthesis. In: J. Histochem. Cytochem. (1976), S. 24–33 

[Latt und Wohlleb 1975] Latt, S. A. ; Wohlleb, J. C.: Optical Studies of the 

Interaction of 33258 Hoechst with DNA, Chromatin and Metaphase Chromosomes. 

In: Chromosoma 52 (1975), S. 297–316 

[Linke u. a. 1997] Linke, S. P. ; Clarkin, K. C. ; Wahl, G. M.: p53 Mediates Permanent 

Arrest over Multiple Cell Cycles in Response to γ-Irradiation. In: Cancer 

Res. 57 (1997), S. 1171–1179 

[Little und Nagasawa 1985] Little, J. B. ; Nagasawa, H.: Effect of Confluent 

Holding on Potentially Lethal Damage Repair, Cell Cycle Progression, and Chromosomal 

Aberrations in Human Normal and Ataxia-Telangiectasia Fibroblasts. In: 

Radiat. Res. 101 (1985), Nr. 1, S. 81–93 

[Löbrich u. a. 1998] Löbrich, M. ; Cooper, P. K. ; Rydberg, B.: Joining of 

correct and incorrect DNA Ends at Double-Strand Breaks produced by High-Linear 

112


Energy Transfer Radiation in Human Fibroblasts. In: Radiat. Res. 150 (1998), 

Nr. 6, S. 619–626 

[Lücke-Huhle u. a. 1979] Lücke-Huhle, C. ; Blakely, E. A. ; Chang, P. Y. ; 

Tobias, C. A.: Drastic G 2 Arrest in Mammalian Cells after Irradiation with 

Heavy-Ion Beams. In: Radiat. Res. 79 (1979), S. 97–112 

[Morris 1991] Morris, S. M.: The Genetic Toxicology of 5-Bromodeoxyuridine in 

Mammalian Cells. In: Mutat. Res. 258 (1991), S. 161–188 

[Munro 1970] Munro, T.: The Relative Radiosensitivity of the Nucleus and Cytoplasm 

of the Chinese Hamster Fibroblast. In: Radiat. Res. 42 (1970), S. 451–470 

[Nasonova u. a. 2001] Nasonova, E. ; Gudowska-Nowak, E. ; Ritter, S. ; 

Kraft, G.: Analysis of Ar-Ion and X-Ray-Induced Chromatin Breakage and 

Repair in V79 Plateau-Phase Cells by the Premature Chromosome Condensation 

Technique. In: Int. J. Radiat. Biol. 77 (2001), Nr. 1, S. 59–70 

[Nasonova u. a. 1998] Nasonova, E. ; Ritter, S. ; Fomenkova, T. ; Kraft, G.: 

Induction of Chromosomal Damage in CHO-K1 Cells and their Repair-Deficient 

Mutant XRS5 by X-Ray and Particle Irradiation. In: Adv. Space Res. 22 (1998), 

Nr. 4, S. 569–578 

[Paul 1980] Paul, J.: Zell- und Gewebekulturen. deGruyter, Berlin, 1980 

[Perry und Wolff 1974] Perry, P. ; Wolff, S.: New Giemsa Method for the 

Differential Staining of Sister Chromatids. In: Nature 251 (1974), Nr. 5471, S. 156– 

158 

[Poot 1990] Poot, M.: Flow Cytometry. Kap. Cell Kinetic Analysis Using Continuous 

BrdU Labelling and Bivariate 33258/Ethidium Bromide Flow Cytometry, 

M. Ormerod (Hrsg.), IRL Press, Oxford, 1990 

[Rabinovitch u. a. 1988] Rabinovitch, P. S. ; Kubbies, M. ; Chen, Y. C. ; 

Schindler, D. ; Hoehn, H.: BrdU-Hoechst Flow Cytometry: A Unique Tool 

for Quantitative Cell Cycle Analysis. In: Exp. Cell Res. 174 (1988), S. 309–318 

[Rodemann u. a. 1991] Rodemann, H. P. ; Peterson, H.-P. ; Schwenke, K. ; 

Von Wangenheim, K.-H.: Terminal Differentiation of Human Fibroblasts is 

Induced by Radiation. In: Scanning Microsc. 5 (1991), Nr. 4, S. 1135–1143 

[Roots u. a. 1989] Roots, R. ; Holley, W. ; Chatterjee, A. ; Rachal, E. ; 

Kraft, G.: The Influence of Radiation Quality on the Formation of DNA Breaks. 

In: Adv. Space Res. 9 (1989), Nr. 10, S. 45–55 

113


[Ross 1999] Ross, G. M.: Induction of Cell Death by Radiotherapy. In: Endocr. 

Relat. Cancer 6 (1999), Nr. 1, S. 41–44 

[Sager 1989] Sager, R.: Tumor Suppressor Genes: The Puzzle and the Promise. 

In: Science 246 (1989), Nr. 4936, S. 1406–1412 

[Scholz und Kraft 1996] Scholz, M. ; Kraft, G.: Track Structure and the Calculation 

of Biological Effects of Heavy Charged Particles. In: Adv. Space Res. 18 

(1996), Nr. 1-2, S. 5–14 

[Scholz u. a. 1994] Scholz, M. ; Kraft-Weyrather, W. ; Ritter, S. ; Kraft, 

G.: Cell Cycle Delays induced by Heavy Ion Irradiation of Synchronous Mammalian 

Cells. In: Int. J. Radiat. Biol. 66 (1994), Nr. 1, S. 59–75 

[Scholz u. a. 1998] Scholz, M. ; Ritter, S. ; Kraft, G.: Analysis of Chromosome 

Damage based on the Time Course of Aberrations. In: Int. J. Radiat. Biol. 74 

(1998), Nr. 3, S. 325–331 

[Sinclair 1968] Sinclair, W. K.: Cyclic X-Ray Responses in Mammalian Cells in 

Vitro. In: Radiat. Res. 33 (1968), Nr. 3, S. 620–643 

[Smellie und Parsons 1979] Smellie, S. G. ; Parsons, P. G.: Effects of Thymidine 

Analogues on Murine and Human Cells. In: Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 57 (1979), 

Nr. 6, S. 563–573 

[Stein u. a. 1999] Stein, G. H. ; Drullinger, L. F. ; Soulard, A. ; Dulic, 

V.: Differential Roles for Cyclin-Dependent Kinase Inhibitors p21 and p16 in the 

Mechanisms of Senescence and Differentiation in Human Fibroblasts. In: Mol. Cell 

Biol. 19 (1999), Nr. 3, S. 2109–2117 

[Taucher-Scholz u. a. 1996] Taucher-Scholz, G. ; Heilmann, J. ; Kraft, G.: 

Induction and Rejoining of DNA Double-Strand Breaks in CHO Cells after Heavy 

Ion Irradiation. In: Adv. Space Res. 18 (1996), Nr. 1-2, S. 83–92 

[Virsik-Peuckert u. a. 1997] Virsik-Peuckert, P. ; Rave-Fränk, M ; Langebrake, 

U. ; Schmidberger, H.: Differences in the Yields of Dicentrics and Reciprocal 

Translocations Observed in the Chromosomes of Irradiated Human Skin 

Fibroblasts from the Same Healthy Individuals. In: Radiat. Res. 148 (1997), S. 209– 

215 

[Vogelstein u. a. 2000] Vogelstein, B. ; Lane, D. ; Levine, A. J.: Surfing the 

p53 Network. In: Nature 408 (2000), Nr. 6810, S. 307–310 

[Weber 1996] Weber, U.: Volumenkonforme Bestrahlung mit Kohlenstoff-Ionen 

zur Vorbereitung einer Strahlentherapie, Gesamthochschule Kassel, Dissertation, 

1996 

114


dE 

[Weinrich u. a. 1991] Weinrich, W. ; Wiegel, B. ; Kraft, G.: β, Z eff , , dx 

Range and Restricted Energy Loss of Heavy Ions in the Region 1 ≤ E ≤ 1 000 MeV 

u 

/ Gesellschaft für Schwerionenforschung. 1991. – Technischer Bericht 

[Weyrather u. a. 1999] Weyrather, W. K. ; Ritter, S. ; Scholz, M. ; Kraft, 

G.: RBE for Carbon Track-Segment Irradiation in Cell Lines of Differing Repair 

Capacity. In: Int. J. Radiat. Biol. 75 (1999), Nr. 11, S. 1357–1364 

[Williams u. a. 1997] Williams, K. J. ; Boyle, J. M. ; Birch, J. M. ; Norton, 

J. D. ; Scott, D.: Cell Cycle Arrest Defect in Li-Fraumeni Syndrome: A 

Mechanism of Cancer Predisposition. In: Oncogene 14 (1997), Nr. 3, S. 277–282 

[Yang u. a. 1997] Yang, T. C. ; George, K. ; Johnson, A. S. ; Durante, M. ; 

Fedorenko, B. S.: Biodosimetry Results from Space Flight Mir-18. In: Radiat. 

Res. 148 (1997), S. S17–S23 

115


116

Danksagung 

Der allererste Dank geht an Prof. Dr. Gerhard Kraft, zum einen für die Aufnahme in 

die Abteilung Biophysik und die Möglichkeit in dieser unter den besten Bedingungen 

arbeiten zu können, zum anderen für die Überlassung des Themas, den Freiraum 

bei seiner Bearbeitung und die gute Laune, mit der er andere immer anzustecken 

versteht. 

Mein besonderer Dank gilt auch Prof. Dr. P. Layer vom Institut für Zoologie der 

TU Darmstadt, für seine Bereitschaft, diese externe Diplomarbeit zu betreuen und 

für die Freiheit, die er mir bei deren Anfertigung ließ. 

Sehr großer Dank muss an Dr. Sylvia Ritter gehen. Sie hat mit ihrer Betreuung 

die Meilensteine für das Anfertigen dieser Arbeit gesetzt und mit ihrer ungeheuer 

kompetenten Unterstützung, ihrer immer konstruktiven Kritik und Lob entscheidend 

dazu beigetragen, mich zum Erreichen der selben zu motivieren. 

Danken will ich auch Petra Hessel, die mich mit Geduld und Humor in viele der 

Arbeitsmethoden und -abläufe einführte, bei Experimenten half und irgendwie immer 

an alles Wichtige dachte. 

Vielen Dank auch an Dr. Claudia Fournier, die mir mit fruchtbaren Diskussionen 

und guten Tipps besonders in der Endphase der Arbeit eine unverzichtbare Hilfe war. 

Allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe Biophysik sei an dieser Stelle für die tolle 

Arbeitsatmosphäre und Hilfe gedankt, besonders auch meinen Bürokollegen Wolfgang 

Becher, Sven Grözinger, Dr. Jakob Naumann und den anderen Mitgliedern des Tee- 

Kolloquiums, Dank auch an Dr. Elena Nasonova für die experimentelle Mithilfe. 

Vielen Dank an Timo Dick für das lektorieren des Manuskriptes, dabei auch Dank 

an alle anderen Freunde, die verständnisvoll auf meinen Zeitmangel in den vergangenen 

acht Monaten reagierten. 

Dankbar bin ich besonders meiner Freundin Kirsten, für ihre liebevolle Unterstützung 

und für ihre unverzagten Versuche meine Gedanken auch mal auf andere Dinge 

zu lenken. 

Mein größter Dank gebührt jedoch nicht zuletzt meinen Eltern und meinem Bruder 

Christoph, die mir immer mit Rat und Tat zur Seite standen und durch ihren immer 

währenden Beistand und Rückhalt dieses Studium ermöglichten. 

117

Einfluss von Strahlung auf die Zellzyklus-Progression und die ...

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