G. Taucher-Scholz - PTKA - KIT
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02NUK001<br />
02.2008 – 09.2013<br />
Projektleitung: G. <strong>Taucher</strong>-<strong>Scholz</strong><br />
Wechselwirkung verschiedener Reparaturwege<br />
bei der Prozessierung von DNA Strahlenschäden<br />
Projektstatusgespräch Nukleare Sicherheitsforschung<br />
<strong>KIT</strong> 6.-7. März 2013
Motivation: Das Ergebnis der DNA Reparatur<br />
bestimmt die Folgen einer Bestrahlung<br />
korrekt repariert<br />
Zelle<br />
Ionisierende<br />
Strahlung Zelle mit<br />
DNA-Schaden<br />
falsch repariert<br />
Überleben<br />
Schwerwiegendste<br />
DNA Schädigung:<br />
Doppelstrangbruch<br />
(DSB)<br />
nicht<br />
repariert<br />
Mutation<br />
Chromosomen-<br />
Schäden<br />
unkontrollierte<br />
Zellteilung<br />
Zelltod<br />
Krebsinduktion<br />
G.<strong>Taucher</strong>-<strong>Scholz</strong>
02NUK001A-C/E<br />
M. Löbrich<br />
TU Darmstadt<br />
Zellzyklus<br />
Kinetik der<br />
Reparaturwege<br />
G. <strong>Taucher</strong>-<strong>Scholz</strong><br />
GSI Biophysik, Darmstadt<br />
Schadenskomplexität<br />
Schwerionenstrahl<br />
Reparatur DNA<br />
Verbundprojekte<br />
Schwerpunkte<br />
G. Iliakis<br />
Universität Essen<br />
Backup-Reparaturwege<br />
J. Dahm-Daphi<br />
Universität Hamburg<br />
Struktur der Doppelstrangbrüche<br />
Reporter Assay<br />
Doppelstrangbrüche<br />
.<br />
H. Zitzelsberger<br />
HMGU München<br />
Definierte Mutanten in DT40<br />
G.<strong>Taucher</strong>-<strong>Scholz</strong>
Beitrag zum Kompetenzerhalt<br />
Ausbildung: 9 Doktoranden in Strahlenbiologie promoviert Postdocs<br />
Master- und Bachelorarbeiten<br />
spezielle Techniken: Mikrostrahlen, Laserquelle, dichtionisierende<br />
Strahlung<br />
Lehre: - Graduiertenkollegs : Vorträge / Soft Skill Kurse<br />
- Schwerpunkt Strahlenbiologie TUD Master (neue<br />
Lehrstühle); Verleihung Professur GSI<br />
- Vorlesungen / Module<br />
Vernetzung:<br />
HGF + Unis: Darmstadt, Essen, Hamburg<br />
internationale Vernetzung /ESA radiation lab. GSI<br />
-Treffen: Vorträge und intensiver Informationsaustausch<br />
- gemeinsame Publikationen<br />
- Austausch von Zellen/ Materialen/ Methoden<br />
- Zugang zu verschiedenen Bestrahlungsmodalitäten –<br />
Schwerionen GSI<br />
G.<strong>Taucher</strong>-<strong>Scholz</strong>
Wissenschaftliche Erfolge<br />
Tagungen:<br />
- Beiträge zu nationalen und internationalen Tagungen, Vorträge<br />
- Ausrichtung GBS in Essen (2009), Hamburg (2010) und Darmstadt (2013)<br />
- Doktoranden: Posterpreise / Reisestipendien /Auswahl NASA Summer<br />
School / Teilnahme Nobelpreisträgertreffen<br />
Folgeprojekte: Förderung gemeinsamer Projekte/ESA radiation lab<br />
Veröffentlichungen:<br />
- über 20 Publikationen in renommierten („peer reviewed“) Fachzeitschriften<br />
+ zusätzliche „under revision“ – auch gemeinsame Co-Authorenschaft<br />
G.<strong>Taucher</strong>-<strong>Scholz</strong>
Reparatur von DNA Doppelstrangbrüchen (DSB)<br />
Frühe Schadensantwort<br />
Wichtigste Reparaturwege<br />
Nicht Homologes<br />
End Joining NHEJ<br />
HR Homologe<br />
Rekombination<br />
DSB<br />
Histon<br />
H2AX<br />
mod. Kinner al al., NAR 2008<br />
H2AX/DNA<br />
schnell<br />
teils ungenau<br />
Foci<br />
DSB<br />
Zellkerne humaner Bindegewebszellen.<br />
Immunfärbung 30 min<br />
nach 0.5 Gy Röntgen<br />
(B. Meyer, GSI)<br />
G.<strong>Taucher</strong>-<strong>Scholz</strong><br />
Chromatiden<br />
DSB<br />
DNA-Stränge<br />
G2-Phase des Zellzyklus<br />
Auswahl des Reparaturweges?<br />
korrekt / fehlerbehaftet?<br />
Korrekt (Kopie der<br />
verdoppelten DNA)<br />
in G2
Alternative “Backup” Mechanismen der DSB Reparatur<br />
NHEJ von<br />
strahleninduzierten DSBs<br />
Schnelle<br />
Komponente<br />
(10-30 min)<br />
ohne DNA-PK<br />
Langsame<br />
Komponente<br />
(2-20 h)<br />
Mutanten der<br />
verschiedenen Ligasen<br />
in unterschiedlichen<br />
Kombinationen<br />
Ligase III Schlüsselprotein<br />
D-NHEJ<br />
G.<strong>Taucher</strong>-<strong>Scholz</strong><br />
?<br />
B-NHEJ<br />
- Backup NHEJ<br />
- ersetzt Ligase I (DNA Replikation)<br />
Arakawa H, et al., Nucl. Acids Res. (2012)<br />
- Funktion in HR?<br />
Paul K, et al. (2013)<br />
(MS under revision)
Zellüberleben: Rolle von Ligase III<br />
Ligase III: Beteiligung an B-NHEJ Reparatur im<br />
Zellüberleben bestätigt Uni Essen @ HMGU Paul K, et al. &(2013)<br />
(MS under revision).<br />
Komplexe Schäden: Ligase III kann Verknüpfung übernehmen<br />
Teilchen<br />
Wildtyp LIG1 -/- LIG4 -/-<br />
nur LIG III<br />
X-ray<br />
Teilchen<br />
X-ray<br />
kein Einfluss auf<br />
Überleben nach<br />
Ionenbestrahlung<br />
wenn nur Ligase III<br />
vorhanden ist<br />
G.<strong>Taucher</strong>-<strong>Scholz</strong><br />
Singh et al. BMC Radiat. Oncol. (2013) MS under revision
Hauptwege der Reparatur von Strahlenschäden (DSB)<br />
DNA-PK<br />
Die meisten DSB<br />
werden schnell über<br />
NHEJ in allen<br />
Zellzyklusphasen<br />
G2<br />
BRCA2<br />
HR<br />
Vortrag<br />
Ch. Reul<br />
Ein Teil der DSB wird langsam<br />
repariert und benötigt ATM<br />
UKE<br />
Köcher S, et al. Nucl. Acids. Res. (2012) Reporter: ATM/ Artemis in HR/G2<br />
ATM bei Replikation<br />
G.<strong>Taucher</strong>-<strong>Scholz</strong><br />
Beucher et al. EMBO J. (2009)<br />
Jeggo et al., Radiother. Oncol. (2011)
Chromatinstruktur beeinflusst die DSB Reparatur<br />
Chemikalien<br />
Euchr.<br />
(EC)<br />
HC<br />
X-rays<br />
X-rays<br />
mcb.illinois.edu/faculty/profile/cmizzen<br />
Euchromatin: aktive Gene, DNA Sequenzen<br />
einmalig vorhanden – aufgelockert<br />
Heterochromatin: inaktive Gene, sich<br />
wiederholende (repetitive) DNA Sequenzen –<br />
stark kompaktiert: geschlossene Struktur<br />
radonc.wustl.edu/.../researchprograms.aspx<br />
G.<strong>Taucher</strong>-<strong>Scholz</strong><br />
Schnelle Reparatur<br />
NHEJ<br />
Langsame Reparatur<br />
HR<br />
G2<br />
Jeggo et al, Radiother. Oncol. (2011)<br />
Goodarzi et al., DNA Repair (2010)<br />
DSB im Heterochromatin<br />
ATM-abhängig<br />
Öffnung des HC
Einfluss der Schadens-Komplexität auf den Reparaturweg:<br />
dicht ionisierende Teilchenstrahlen<br />
<br />
Zellkern<br />
Ion<br />
C-Ion<br />
Zellkern<br />
Viele DNA Schäden in räumlicher Nähe<br />
DNA<br />
nm scale<br />
geclusterte Schäden<br />
Photonen:<br />
Zufällig verteilte Energiedeposition<br />
Homogene Dosisverteilung<br />
(Röntgen, -Strahlen)<br />
locker ionisierend<br />
G.<strong>Taucher</strong>-<strong>Scholz</strong><br />
SSB<br />
Basenschaden<br />
DSB<br />
Hohe lokale Energiedeposition<br />
Inhomogen verteilt (-Strahlen; Ionen<br />
Schadens-Anhäufung: komplexe DSB<br />
dicht ionisierend
Akkumulation von Reparaturproteinen<br />
an lokalisierten DNA Schäden: Strahlplatzmikroskop<br />
Lebendzellmikroskopie: Echtzeit Proteinrekrutierung Auflösung 1 sec<br />
10 min<br />
SSB Reparatur (XRCC1)<br />
rel. fluorescence signal<br />
1.2<br />
1<br />
0.8<br />
0.6<br />
0.4<br />
0.2<br />
Kinetiken<br />
53BP1<br />
MDC1<br />
Untersuchung:<br />
- Zeitverläufe<br />
- Hierarchien<br />
-Abhängigkeit<br />
0<br />
0<br />
100<br />
200<br />
300<br />
400<br />
500<br />
600<br />
time [s]<br />
Strahl<br />
GFP-Reparatur<br />
Protein<br />
DSB wandern nicht weiträumig im<br />
Kern herum weniger mögliche<br />
Wechselwirkungen zwischen<br />
Chromosomen stabileres Erbgut<br />
Jakob et al., PNAS (2009)<br />
G.<strong>Taucher</strong>-<strong>Scholz</strong><br />
Quantitative Unterschiede aufgrund<br />
höherer Anzahl an lokalisierten Schäden<br />
Schwerionen DSB: gleiche Reparatur<br />
Mechanismen wie Photonen<br />
Tobias et al. PLOS One in press (2013)<br />
Tobias et al. Mutat. Res. (2010)
Einfluss der Komplexität der Schäden ( nach Ionenbestrahlung)<br />
H2AX<br />
DNA<br />
Meyer et al., Nucl. Acids Res. 2013 in rev.<br />
Kernweite H2AX Strahlenreaktion an ungeschädigter DNA<br />
Messbar auch nach Bestrahlung mit einem Kohlenstoff Ion<br />
Entsteht durch Aktivierung der gleichen Kinasen (DNA-PK und ATM)<br />
wie H2AX an DSB - keinen Einfluss auf Folgen der Bestrahlung
Schadenskomplexität beeinflusst Auswahl des Reparaturwegs<br />
HC<br />
X-rays<br />
C 12 Ionen<br />
Chemikalien<br />
(Etoposid)<br />
X-rays<br />
EC<br />
komplexe<br />
Brüche<br />
Reparaturzeit (h)<br />
X-rays<br />
C 12<br />
Verknüpfung der DNA Enden<br />
über Microhomologien<br />
Schnelle Reparatur<br />
G1<br />
und<br />
G2<br />
NHEJ<br />
Langsame Reparatur<br />
G2<br />
HR<br />
Prozessierung der DSB<br />
Enden: Resektion<br />
N. Averbeck: Komplexe DSB generell Resektion<br />
Fehlerbehaftet!<br />
Verlust<br />
von DNA<br />
Shibata et al., Embo J. (2011)<br />
Jeggo et al, Radiother. Oncol. (2011)<br />
G.<strong>Taucher</strong>-<strong>Scholz</strong>
Strahlenreaktion an heterochromatischen (HC) DSB<br />
Langsame Reparatur HC-DSB: erschwerte Zugänglichkeit?<br />
H2AX Foci immer an Peripherie von HC Bereichen!<br />
H2AX<br />
DNA<br />
30 min<br />
Zellkern (Maus) mit<br />
kompaktiertem<br />
Heterochromatin<br />
100s<br />
merged<br />
2µm<br />
rel. Fluorescence Signal<br />
GFP Fluoreszenz<br />
0<br />
-100<br />
Lebendzellmikroskop: MEF<br />
tim e [s]<br />
Zeit (sec)<br />
GFP-Reparaturprotein<br />
ROT Heterochromatin HC im Vergleich zu EC<br />
‣ vergleichbare Akkumulation HC<br />
zugänglich!<br />
1<br />
0.8<br />
0.6<br />
0.4<br />
0.2<br />
0<br />
100<br />
Euchromatin<br />
Heterochrom atin<br />
200<br />
EC<br />
300<br />
400<br />
HC<br />
‣ verzögerte Ablösung<br />
Prozessierung /Rekombination innerhalb der repetitiven DNA Sequenzen im HC<br />
erhöhtes Risiko für falsche Verknüpfungen und fehlerhafte Reparatur<br />
500<br />
600<br />
B. Jakob et al, Nucl. Acids Res (2011)<br />
G.<strong>Taucher</strong>-<strong>Scholz</strong>
Relokalisierung heterochromatischer (HC) DSBs<br />
Zentraler Focus<br />
central intermediate peripheral<br />
100%<br />
DNA<br />
XRCC1 1<br />
-H2AX<br />
2<br />
x<br />
Peripherer Focus<br />
z<br />
3D image<br />
rel. occurrence<br />
Häufigkeit<br />
80%<br />
60%<br />
40%<br />
20%<br />
0%<br />
3 - 8 min 9 - 13 min 14 - 20 min<br />
x<br />
post irradiation time<br />
Zeit nach Bestrahlung<br />
3D image<br />
DSB zentral im HC induziert durch Ionen-Mikrostrahl<br />
‣ DSB innerhalb max. 20 min an die Peripherie umgelagert<br />
Reparatur findet in aufgelockerten Chromatinbereichen statt!<br />
Ziel: Fehlverknüpfungen verhindern – beteiligte Faktoren????<br />
G.<strong>Taucher</strong>-<strong>Scholz</strong><br />
B. Jakob et al., Nucl. Acids Res (2011)
Limitierend: Zellzykluskontrolle und DSB Reparatur<br />
Zellen, die in die nächste Zellzyklusphase eintreten zu bestimmter Zeit nach Bestrahlung<br />
G1/S-<br />
Kontrollpunkt<br />
verzögert<br />
G2/M-<br />
Kontrollpunkt<br />
setzt schnell ein<br />
Zellzyklus<br />
Kontrollpunkte<br />
H2AX DAPI<br />
H2AX DAPI<br />
Reparaturzeit<br />
Zellen teilen sich<br />
vor Abschluss der<br />
Reparatur (mit DSB)<br />
Diese Limitierungen der Zellzykluskontrollpunkte<br />
führen zu einer Erhöhung an chromosomalen<br />
Brüchen unerwünschten Strahlenfolgen<br />
G.<strong>Taucher</strong>-<strong>Scholz</strong><br />
Deckbar et al., Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol.(2011)<br />
Deckbar et al., Cancer Res. (2010)
Bezug zur BMBF Förderung<br />
Ausbildung von Nachwuchswissenschaftlern in der Strahlenforschung,<br />
Umgang mit verschiedenen Strahlenquellen<br />
Mechanismen der DSB Reparatur für verschiedene Strahlenarten<br />
(Schäden unterschiedlicher Komplexität) aufgezeigt<br />
gezielte Eingriffe in spezifische Reparaturschritte und<br />
Strahlenwirkung Entwicklungen in der Strahlentherapie<br />
Auf molekularer Ebene Risiken (Prozessierung/ Zellzykluslimitierung)<br />
aber auch Mechanismen zur Erhaltung der<br />
Erbgut Information präzisiert (Stabilität DSB, HC-DSB<br />
Umlagerung).<br />
wichtig zur Beurteilung dieser Balance – wie wird sie gesteuert?<br />
Vorhersagen zur Risikoabschätzung im Strahlenschutz<br />
G.<strong>Taucher</strong>-<strong>Scholz</strong>
Projektträger<br />
<strong>PTKA</strong><br />
Danke!<br />
Verbundtreffen 02NUK001<br />
UKE<br />
G.<strong>Taucher</strong>-<strong>Scholz</strong>
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