von Herrn Reinhard Wilms - ICBM
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Molekularbiologische Erfassung und<br />
Charakterisierung der mikrobiellen Gemeinschaften<br />
im Rückseitenwatt der Insel Spiekeroog<br />
Von der Fakultät für Mathematik und Naturwissenschaften der Carl <strong>von</strong><br />
Ossietzky Universität Oldenburg zur Erlangung des Grades und Titels eines<br />
Doktors der Naturwissenschaften - Dr. rer. nat. -<br />
angenommene Dissertation<br />
<strong>von</strong> <strong>Herrn</strong> <strong>Reinhard</strong> <strong>Wilms</strong><br />
geboren am 24. März 1972 in Wilhelmshaven<br />
Oldenburg 2006
Die vorliegende Doktorarbeit wurde in der Zeit <strong>von</strong> September 2001 bis<br />
September 2006 am Institut für Chemie und Biologie des Meeres in der<br />
Arbeitsgruppe Paläomikrobiologie angefertigt.<br />
Gutachter:<br />
Zweitgutachter:<br />
Prof. Dr. Heribert Cypionka<br />
Prof. Dr. Ralf Rabus<br />
Tag der Disputation: 15. November 2006
“...to boldly go where no one has gone before” (Gene Roddenberry)
Für Jonas
ERKLÄRUNG<br />
Erklärung<br />
Teilergebnisse dieser Arbeit sind bereits bei den genannten Fachzeitschriften veröffentlicht<br />
bzw. eingereicht. Mein Beitrag an der Erstellung der verschiedenen Manuskripte wird im<br />
Folgenden erläutert:<br />
<strong>Wilms</strong>, R., Köpke, B., Sass, H., Chang, T. S., Cypionka, H., and Engelen, B. (2006) Deep<br />
biosphere-related bacteria within the subsurface of tidal flat sediments. Environ. Microbiol. 8:<br />
709-719.<br />
Konzeptentwicklung und Durchführung der molekularbiologischen Arbeiten durch R. <strong>Wilms</strong>.<br />
Die Zellzahlen wurden <strong>von</strong> B. Köpke erhoben. Die sedimentologischen Arbeiten wurden <strong>von</strong><br />
T.S. Chang und J. Köster durchgeführt. Erstellung der ersten Fassung des Manuskriptes durch<br />
R. <strong>Wilms</strong>, Überarbeitung durch B. Engelen, H. Sass und H. Cypionka.<br />
<strong>Wilms</strong>, R., Sass, H., Köpke, B., Köster, J., Cypionka, H., and Engelen, B. (2006) Specific<br />
bacterial, archaeal and eukaryotic communities in tidal-flat sediments along a vertical profile<br />
of several meters. Appl. Environ. Microbiol. 72: 2756-2764.<br />
Konzeptentwicklung und Durchführung der molekularbiologischen Arbeiten durch R. <strong>Wilms</strong>.<br />
Die sedimentologischen Arbeiten wurden <strong>von</strong> J. Köster und T. S. Chang durchgeführt. Das<br />
TOC- und DOC-Profil wurde <strong>von</strong> E. Freese erhoben. Das Ammoniumprofil wurde <strong>von</strong><br />
W. Martens-Habbena aufgenommen. Die Sulfat- und Chlorid-Profile (2002 - 2004) wurden<br />
<strong>von</strong> B. Köpke und H. Sass aufgenommen. Das Sulfat- und Methanprofil (2005) wurde <strong>von</strong><br />
R. <strong>Wilms</strong> erhoben. Erstellung der ersten Fassung des Manuskriptes durch R. <strong>Wilms</strong>,<br />
Überarbeitung durch B. Engelen, H. Sass, J. Köster und H. Cypionka.<br />
<strong>Wilms</strong>, R., Sass, H., Köpke, B., Cypionka, H., and Engelen, B. (2006) Methane and sulfate<br />
profiles within the subsurface of tidal flat are reflected by the distribution of sulfate-reducing<br />
bacteria and methanogenic archaea. FEMS Microbiol. Ecol. (in press).<br />
Konzeptentwicklung und Durchführung der praktischen Arbeiten durch R. <strong>Wilms</strong> mit<br />
Ausnahme der Sulfatmessungen <strong>von</strong> 2002 – 2004 und der Zellzahlbestimmungen, welche <strong>von</strong><br />
B. Köpke und H. Sass durchgeführt wurden. Erstellung der ersten Fassung des Manuskriptes<br />
durch R. <strong>Wilms</strong>, Überarbeitung durch B. Engelen, H. Sass und H. Cypionka.<br />
I
WEITERE VERÖFFENTLICHUNGEN<br />
Weitere Veröffentlichungen<br />
Köpke, B., <strong>Wilms</strong>, R., Engelen, B., Cypionka, H., and Sass, H. (2005). Reflecting microbial<br />
diversity in coastal subsurface sediments - A cultivation approach using various electron<br />
acceptors and substrate gradients. Appl. Environ. Microbiol. 71: 7819-7830.<br />
<strong>Wilms</strong>, R., Köpke B., Engelen B., Sass H., and Cypionka H. (2003). Microbial community<br />
composition of the "shallow biosphere" in Wadden Sea sediments. Ber. Forschungszentrum<br />
Terramare 12: 126-127.<br />
Köpke, B., <strong>Wilms</strong>, R., Engelen, B., Cypionka, H., Rullkötter, J., and Sass, H. (2003).<br />
Cultivation of bacteria from a six meter long core from an intertidal sediment. Ber.<br />
Forschungszentrum Terramare 12: 75-76.<br />
Engelen, B., Köpke B., <strong>Wilms</strong> R., Sass H., and Cypionka H. (2003). Exploring the "shallow<br />
biosphere" of Wadden Sea sediments by analyzing the microbial community composition.<br />
Terra Nostra, Schriften der Alfred-Wegener-Stiftung 03/3, p. 96<br />
II
INHALTSVERZEICHNIS<br />
Inhaltsverzeichnis<br />
Zusammenfassung 1<br />
Summary 2<br />
Abkürzungen 3<br />
1. Einleitung 4<br />
1.1 Ablagerungsprozesse im Wattenmeer 5<br />
1.2 Vergleich der Wattsedimente mit Sedimenten des offenen Ozeans 7<br />
1.3 Remineralisierungsprozesse in Sedimenten des Wattenmeeres 8<br />
1.4 Gezielte Detektion <strong>von</strong> sulfatreduzierenden Prokaryoten und<br />
methanogenen Archaeen 9<br />
1.5 Anaerobe Oxidation <strong>von</strong> Methan 10<br />
1.6 Diversität <strong>von</strong> Mikroorganismen 12<br />
1.7 Zielsetzung der Arbeit 14<br />
1.8 Literatur 15<br />
2. Publikationen 21<br />
2.1 Deep biosphere-related bacteria within the subsurface of tidal flat sediments 22<br />
2.2 Specific bacterial, archaeal and eukaryotic communities in tidal-flat sediments<br />
along a vertical profile of several meters 34<br />
2.3 Methane and sulfate profiles within the subsurface of a tidal flat are reflected<br />
by the distribution of sulfate-reducing bacteria and methanogenic archaea 46<br />
3. Diskussion 69<br />
3.1 Detektion <strong>von</strong> „deep biosphere“ Bakterien im Wattenmeer 70<br />
3.2 Vertikale Abfolge <strong>von</strong> Sulfatreduzierern und Methanogenen 71<br />
3.3 Detektion eines neuen Clusters innerhalb der Euryarchaeota 72<br />
3.4 Ausblick 74<br />
3.5 Literatur 75<br />
III
ZUSAMMENFASSUNG<br />
Zusammenfassung<br />
In der vorliegenden Arbeit wurden Sedimente des Rückseitenwatts der Insel Spiekeroog bis<br />
zu einer Tiefe <strong>von</strong> 5,5 Metern molekularbiologisch untersucht. Dabei wurden die mikrobiellen<br />
Gemeinschaften der Bakterien, Archaeen und Eukaryoten mit Domänen-spezifischen PCR-<br />
Primern analysiert. Die erhaltenen Amplifikate konnten mittels der DGGE aufgetrennt und<br />
anschließend sequenziert werden. Die Sequenzen lieferten einen umfangreichen Einblick über<br />
die Zusammensetzungen der mikrobiellen Gemeinschaften innerhalb der Sedimentsäulen<br />
verschiedener Standorte des Wattenmeeres. So zeigte sich, dass die Oberflächen der<br />
Sedimente <strong>von</strong> Proteobakterien dominiert werden, wohingegen in tieferen und älteren<br />
Sedimentschichten vornehmlich Vertreter der Chloroflexi detektiert wurden. Mit<br />
zunehmender Sedimenttiefe kommt es somit zu einer Verschiebung der dominierenden<br />
Bakterien zu Organismen, die bisher hauptsächlich in Habitaten der „Tiefen Biosphäre“ (deep<br />
biosphere) gefunden wurden. Methanogene Archaeen konnten über die gesamte<br />
Sedimentsäule detektiert werden, wobei Vertreter der Klasse Methanosarcina in sämtlichen<br />
Sedimentschichten detektierbar waren und somit eine Coexistenz mit sulfatreduzierenden<br />
Bakterien aufzeigen. Dies wurde auch durch das aufgenommene Methanprofil bestätigt, da in<br />
sämtlichen Sedimentschichten Methan zu detektieren war. Sequenzen <strong>von</strong> Eukaryoten wurden<br />
ebenfalls über die gesamte Länge der untersuchten Kerne gefunden. Überraschenderweise<br />
wurde bei dieser Analyse ab 160 cm Tiefe ein neues Cluster innerhalb der Euryarchaeota<br />
entdeckt (TF1-Cluster), obwohl ein Eukaryoten-spezifischer PCR-Primer verwendet wurde.<br />
Zusätzlich zu den Sequenzierungen wurden die zu verschiedenen Jahreszeiten<br />
gewonnenen Sedimentkerne mittels real-time PCR untersucht. Dabei wurden die Bakterien<br />
und Archaeen anhand ihrer 16S rRNA Gene quantifiziert. Die sulfatreduzierenden und<br />
methanogenen Prokaryoten wurden über die Schlüsselenzyme der Sulfatreduktion und<br />
Methanogenese, die dissimilatorische Sulfit Reduktase (dsr) bzw. die Methyl-Coenzyme M<br />
Reduktase (mcr), quantifiziert. In den lokalisierten Sulfat-Methan-Übergangszonen, wo<br />
möglicherweise eine anaerobe Oxidation <strong>von</strong> Methan (AOM) stattfinden könnte, wurden<br />
dabei nicht nur erhöhte Zellzahlen für die Domänen der Bakterien und Archaeen detektiert,<br />
sondern auch erhöhte Kopieanzahlen für dsr und mcr. Bei den Sequenzierungen <strong>von</strong><br />
entsprechenden DGGE-Banden wurden die für AOM postulierten Organismen (ANME) zwar<br />
nicht detektiert, aber die erhöhten Kopie- und Zellzahlen lassen dennoch auf diesen Prozess in<br />
den Sulfat-Methan-Übergangszonen schließen. Eine genaue Bestimmung der beteiligten<br />
Organismen war jedoch nicht möglich.<br />
1
SUMMARY<br />
Summary<br />
In the present work sediments of the backbarrier tidal flat of the island of Spiekeroog were<br />
investigated by molecular techniques down to a depth of 5.5 meters. The microbial<br />
communities of the bacteria, archaea and eukarya were analyzed using domain-specific PCRprimers.<br />
The obtained amplicons were separated by DGGE and sequenced afterwards. The<br />
sequences gave an extensive insight into the composition of microbial communities within the<br />
sediment columns of different sites of the tidal flat. It was shown, that the sediment surfaces<br />
were dominated by Proteobacteria, whereas in deeper and older layers Chloroflexi were<br />
detected primarily. Thus a shift was observed from the dominating bacteria to organisms that<br />
up to now have mainly been found within deep subsurface or deep biosphere habitats.<br />
Methanogenic archaea were found within the whole sediment column, while members of the<br />
Methanosarcina were detectable in all layers indicating a coexistence with sulfate-reducing<br />
bacteria. This has been confirmed by the methane profile as methane was also detected in all<br />
layers. Sequences of eukarya were also found over the complete length of the investigated<br />
cores. Unexpectedly, a new cluster within the Euryarchaeota (TF1-cluster) was discovered<br />
during this analysis from a depth of 160 cm downwards, although eukarya-specific PCRprimers<br />
have been used.<br />
The sediment cores which were recovered at different seasons were examined additionally<br />
to the sequence analysis by real-time PCR. Bacterial and archaeal cell numbers were<br />
calculated by quantifying their 16S rRNA-genes. The sulfate-reducing and methanogenic<br />
prokaryotes were quantified by means of key-enzymes for sulfate reduction (dissimilatory<br />
sulfite reductase; dsr) and methanogenesis (methyl coenzyme M reductase; mcr),<br />
respectively. Increasing cell numbers of bacteria and archaea, and also elevated copy numbers<br />
of dsr and mcr genes were detected at the sulfate-methane transition zones, where an anaerobe<br />
oxidation of methane (AOM) might take place. During sequencing of the corresponding<br />
DGGE-bands, the organisms postulated for AOM (ANME) were not detected. Nevertheless,<br />
the occurance of this process within the sulfate-methane transition zones can be concluded<br />
from the increased numbers of cells and gene copies. However, an exact determination of the<br />
corresponding organisms was not possible.<br />
2
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS<br />
Abkürzungsverzeichnis<br />
AAG<br />
Altertümliche Archaeen Gruppe (ancient archaeal group)<br />
ANME<br />
Anaerober Methan-Oxidierer<br />
AOM<br />
Anaerobe Oxidation <strong>von</strong> Methan<br />
ARC<br />
Archaeen (archaea)<br />
bp<br />
Basenpaare<br />
bzw.<br />
beziehungsweise<br />
C<br />
Kohlenstoff<br />
ca.<br />
circa<br />
CH 4<br />
Methan<br />
DFG<br />
Deutsche Forschungsgemeinschaft<br />
DGGE<br />
Denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese<br />
DHVE<br />
Hydrothermal Vent Euryarchaeota (deep-sea hydrothermal vent<br />
Euryarchaeota)<br />
DNA<br />
Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid)<br />
dsr<br />
Gen der Dissimilatorischen Sulfit-Reduktase<br />
et al.<br />
und andere<br />
FISH<br />
Fluoreszenz in-situ Hybridisierung<br />
GNSB<br />
Grüne nicht Schwefelbakterien<br />
mcr<br />
Methyl-Coenzyme M Reduktase<br />
NCBI<br />
National Center for Biotechnology Information<br />
PCR<br />
Polymerase Ketten Reaktion (polymerase chain reaction)<br />
RNA<br />
Ribonukleinsäure (ribonuclein acid)<br />
rRNA<br />
Ribosomale Ribonukleinsäure (ribosomale ribonuclein acid)<br />
S<br />
Svedberg<br />
SRP<br />
Sulfat-reduzierende Prokaryoten<br />
TF1-Cluster Tidal flat cluster 1<br />
z. B. zum Beispiel<br />
3
EINLEITUNG<br />
1. Einleitung<br />
4
EINLEITUNG<br />
1. Einleitung<br />
1.1 Ablagerungsprozesse im Wattenmeer<br />
Das Wattenmeer der südlichen Nordsee ist mit einer Fläche <strong>von</strong> circa 8.000 km 2 das größte<br />
zusammenhängende Wattenmeer der Erde und reicht <strong>von</strong> Den Helder (Niederlande) bis<br />
Esbjerg (Dänemark). Es entstand durch den Meerwasseranstieg nach der Weichsel-Eiszeit mit<br />
der Bildung der ersten Inseln vor circa 7.500 Jahren (Flemming, 1992). Dabei wurden Salz-<br />
Marschgebiete, die nach der Eiszeit entstanden sind, überflutet und bildeten so die basalen<br />
Schichten der Wattsedimente. Durch die Gezeiten kommt es zu einer regelmäßigen<br />
Entwässerung und Überschwemmung der Wattgebiete über die Seegats. Die<br />
unterschiedlichen Strömungsgeschwindigkeiten des auf- und ablaufenden Meerwassers<br />
innerhalb der Rückseitenwatten haben zur Folge, dass unterschiedliche Sedimentationsraten<br />
auf den verschiedenen Platen vorherrschen. Somit spiegeln die Sedimente in ihren<br />
horizontalen Verteilungsmustern und in ihren Eigenschaften vor allem die hydrodynamischen<br />
Bedingungen zum Zeitpunkt ihrer Ablagerung wieder (Dijkema et al., 1980). Aufgrund<br />
dessen finden sich im allgemeinen gröbere Sedimente als Ablagerungen in einem<br />
energiereicheren Milieu, während feinere Sedimente unter energetisch geringeren<br />
Bedingungen abgelagert werden (Abb. 1).<br />
Abb. 1: Die Sedimentverteilung im Watt zeigt eine küstenparallele Zonierung auf, wobei die<br />
Korngrößen zum Festland hin immer feiner werden und somit den landwärts abnehmenden<br />
Energiegradienten widerspiegeln (Flemming et al., 2002).<br />
5
EINLEITUNG<br />
In den Wattgebieten sind die Ablagerungsprozesse durch einen in Richtung auf das Festland<br />
abnehmenden Energieeintrag charakterisiert (Flemming & Nyandwi, 1994; Mai &<br />
Bartholomä, 2000). Dies führt tendenziell zu einer küstenparallelen Anordnung zunehmender<br />
schluff- und tonreicherer Sedimente, während sandige Sedimente in der Mitte des<br />
Rückseitenwatts und an den Rändern der Priele zu finden sind. Zusätzlich zu dem<br />
horizontalen Verteilungsmuster der Wattsedimente kommt es auch zu größeren Unterschieden<br />
in den vertikalen Schichtungen (Chang et al., 2003). Diese Variabilitäten der<br />
Sedimentverteilung sind Ausdruck der sich ständig ändernden Dynamik <strong>von</strong> Strömung und<br />
Seegang innerhalb der Rückseitenwatten, welche immer wieder zu Erosion und Sedimentation<br />
und damit zu kurzfristigen Sedimentablagerungen auf den Wattflächen führt. Diese vertikale<br />
Oszillation der Sedimente der Platen kann bis zu einem halben Meter pro Jahr betragen<br />
(Tilch, 2003). So wachsen einige Platen im Sommer auf, wohingegen sie im Winter durch<br />
eine im Durchschnitt erhöhte Strömungsgeschwindigkeit wieder erodiert werden (Flemming<br />
& Ziegler, 1995; Krögel, 1997). Zusätzlich erfolgen bei Starkwindereignissen immer wieder<br />
größere Umlagerungsprozesse innerhalb der Wattgebiete (Tilch, 2003). Pendelbewegungen<br />
der Priele führen zu starken lokalen Erosionen auf den Platen (Reineck, 1958) und ältere<br />
Sedimente können dabei auf jüngeren Sedimenten in anderen Bereichen des Watts zum<br />
Liegen kommen. Ein weiterer Einfluss auf die Sedimentationsbildung ist die<br />
Benthosbesiedlung. Die Röhrenbauten und Besiedlungen <strong>von</strong> Organismen beeinflussen die<br />
bodennahen Strömungseigenschaften auf den Platen und damit die<br />
Sedimentationsbedingungen (Eckman et al., 1981; Carey, 1983). Der Nettoanstieg im Jahr<br />
beläuft sich häufig auf nur wenige Zentimeter, wobei andere Bereiche im Watt sogar gänzlich<br />
erodieren. Im Zuge des globalen Meerwasseranstiegs beträgt der durchschnittliche Anstieg<br />
etwa ein bis zwei Millimeter pro Jahr (Oost & De Boer, 1994).<br />
Diese hohe Dynamik und Variabilität bei der Sedimentation und die Einlagerungen<br />
terrigener Pflanzenreste (z. B. Torf; [Wöstmann et al., 2003]) machen eine Altersbestimmung<br />
der Sedimente sehr schwierig. Durch eingelagerte Muscheln in den Sedimenten lässt sich<br />
zwar der Zeitpunkt der letzten Ablagerung bestimmen (Ziehe, 2005), aber Schichten, die<br />
wenige oder keine Muscheln enthalten, können nicht oder nur ungenügend datiert werden.<br />
Erste Altersbestimmungen eingelagerter Muscheln zeigten, dass Sedimentschichten in zwei<br />
Metern Tiefe seit über 800 Jahren vergraben sind (Ziehe, 2005), wobei bei dieser Art der<br />
Altersbestimmung nur ein genereller Trend über einen gesamten Sedimentkern möglich ist.<br />
Das kohlenstoffhaltige Material in solchen Tiefen muss nach dieser Zeitspanne dennoch sehr<br />
6
EINLEITUNG<br />
refraktär sein und stellt für die mikrobiellen Gemeinschaften einen schwer zugänglichen<br />
Elektronendonator dar.<br />
1.2 Vergleich der Wattsedimente mit Sedimenten des offenen Ozeans<br />
Während die Sedimentation in den Wattenmeeren nicht kontinuierlich erfolgt und immer<br />
wieder starken Veränderungen unterliegt, ist der Meeresboden der offenen Ozeane einer<br />
kontinuierlichen Sedimentation unterworfen. Das Fehlen <strong>von</strong> erosiven Prozessen im offenen<br />
Ozean führt zu einem stetigen Aufwuchs der Sedimente <strong>von</strong> 0,1 – 1,0 Zentimeter pro<br />
1.000 Jahre (Backman et al., 2006). Altersbestimmungen dieser Sedimente sind demnach sehr<br />
viel einfacher durchzuführen als für Wattenmeersedimente. Zusätzlich findet man im offenen<br />
Ozean feingeschichtete Sedimente, deren geologische Ablagerungsprozesse genau datiert<br />
werden können. Rückschlüsse auf das Klima und die Sedimentationsbedingungen zum<br />
Zeitpunkt der Ablagerung sind demnach möglich. Zusätzlich sind Umweltbedingungen wie<br />
Temperatur, Druck, Salinität ect. der Sedimente des offenen Ozeans nur geringen<br />
Schwankungen unterworfen.<br />
Die Temperatur der Ozeansedimente nimmt z. B. nur im Laufe <strong>von</strong> Jahrtausenden<br />
kontinuierlich zu und bleibt an der Wassergrenze mit 1-3 °C konstant (Stephens et al., 2002).<br />
Dies erfolgt durch konstante Wassertemperaturen der Tiefsee und der zunehmenden<br />
Temperatur <strong>von</strong> Sedimenten mit der Tiefe (Erdwärme). Im Gegensatz zu den Sedimenten des<br />
offenen Ozeans können die Oberflächensedimente des Wattenmeeres im Sommer an einem<br />
Tag bis zu 20 °C Temperaturunterschied aufzeigen (Harrison & Rhizacklea, 1987).<br />
Jahreszeitliche Schwankungen <strong>von</strong> 8 °C treten sogar noch in fünf Metern Tiefe auf (4 °C im<br />
Winter und 12 °C im Sommer).<br />
Der Nährstoffeintrag im offenen Ozean ist im Vergleich zu den küstennahen Wattgebieten<br />
sehr viel geringer, da jeglicher Sedimentationseintrag (Marine Snow) größere Strecken zurück<br />
legt und dabei schon diversen mikrobiellen Remineralisierungsprozessen unterworfen ist<br />
(Simon et al., 2002). Die Wattsedimente der Nordsee werden dagegen <strong>von</strong> hohen<br />
Nährstoffeinträgen aus den umliegenden Landmassen über Siele und Flüsse versorgt. Der<br />
geringe Nährstoffeintrag für die Sedimente des offenen Ozeans führt zu chemischen<br />
Gradienten, die sich über bis zu hunderten <strong>von</strong> Metern ausbilden können (D'Hondt et al.,<br />
2004; Parkes et al., 2005). Die Sedimente des Wattenmeeres zeigen ähnliche chemische<br />
Profile, allerdings über eine geringere Tiefenskala und sind somit sehr viel steiler (Böttcher<br />
7
EINLEITUNG<br />
et al., 2000; Llobet-Brossa et al., 2002). Das wird auch durch Aktivitätsmessungen deutlich,<br />
die im Watt viel höher sind als im offenen Ozean (Thomsen et al., 2001; D'Hondt et al., 2004;<br />
Köpke et al., 2005; Parkes et al., 2005). Dennoch sind die Bedingungen in mehreren Metern<br />
Tiefe des Watts auch über mehrere Jahrhunderte konstant, so dass die mikrobiellen<br />
Gemeinschaften Strategien entwickeln müssen, um längere Zeiten mit geringsten<br />
metabolischen Aktivitäten überleben zu können. So zeigen sich in beiden Habitaten hohe<br />
Zellzahlen <strong>von</strong> über 10 7 Zellen pro gram Sediment (Köpke et al., 2005; Parkes et al., 2005),<br />
was vermuten lässt, dass in der „deep biosphere“ der Ozeane und in der „subsurface“ des<br />
Watts metabolisch aktive Mikroorganismen vorhanden sind. Man geht sogar da<strong>von</strong> aus, dass<br />
ein Großteil der Mikroorganismen der Welt im tiefen Untergrund zu finden sind (Whitman<br />
et al., 1998). Trotz ihrer eher geringen Aktivität haben sie aber durch ihre enorme Anzahl<br />
einen entscheidenden Einfluss auf den Gesamthaushalt an den Remineralisierungsprozessen<br />
der Welt.<br />
1.3 Remineralisierungsprozesse in Sedimenten des Wattenmeeres<br />
Die Wattenmeergebiete gehören zu den produktivsten Flächen der Erde. Dabei wird<br />
Sauerstoff als Elektronenakzeptor für die Remineralisierung organischen Materials schon in<br />
den ersten Millimetern durch aerobe Atmungsprozesse verbraucht (Böttcher et al., 2000).<br />
Eisen und Nitrat werden ebenfalls in den obersten Zentimetern des Sedimentes reduziert,<br />
wodurch Sulfat zum wichtigsten Elektronenakzeptor für die anaeroben Atmungsprozesse bis<br />
in mehreren Metern Tiefe wird. Unterhalb der sulfathaltigen Sedimente kommt es zur Bildung<br />
<strong>von</strong> nicht unbedeutenden Mengen an Methan durch die Methanogenese. Da das Sediment in<br />
mehreren Metern Tiefe schon vor einigen hundert Jahren abgelagert worden ist (Flemming &<br />
Nyandwi, 1994), stehen unter anderem Elektronendonatoren wie Einfachzucker, Acetat,<br />
Wasserstoff und Kohlendioxid für sulfatreduzierende Prokaryoten und methanogene<br />
Archaeen nicht in ausreichender Menge zur Verfügung (Volkman et al., 2000). Die<br />
verfügbaren Elektronendonatoren, die in diesen Tiefen vorkommen, sind meist sehr refraktär<br />
und schwer abbaubar (Freese & Rullkötter, 2003). Sie dienen fermentativen Bakterien, die mit<br />
ihren Gärprodukten Sulfatreduzierern und auch methanogenen Archaeen die<br />
Elektronendonatoren zur Sulfatreduktion und Methanogenese zur Verfügung stellen, als<br />
Substratgrundlage (Madigan et al., 2003). Diese mikrobiellen Aktivitäten laufen unter den<br />
beschriebenen Bedingungen aber dennoch so schnell ab, dass sich konstante chemische<br />
8
EINLEITUNG<br />
Profile über mehrere Jahrzehnte und über mehreren Metern Tiefe aufbauen können (Böttcher<br />
et al., 2000).<br />
Da die sulfatreduzierenden Prokaryoten und die methanogenen Archaeen zum Großteil<br />
dieselben Elektronendonatoren nutzen (Schimel, 2004), haben Sulfatreduzierer einen<br />
energetischen Vorteil gegenüber den Methanogenen und können diese auskonkurrieren.<br />
Dadurch kommt es zu einer Schichtung der Sulfatreduzierer oberhalb der methanogenen<br />
Archaeen. Diverse Arbeiten konnten aber zeigen, dass beide Prozesse auch simultan auftreten<br />
können (Oremland & Taylor, 1977; Oremland & Polcin, 1982). Diese Koexistenz beider<br />
physiologischer Gruppen ist aber eher untergeordnet zu sehen, wenn es um eine Bilanzierung<br />
der Stoffwechselaktivitäten geht. So sind z. B. größere Mengen an Methan nur dort zu<br />
detektieren, wo Sulfat verbraucht worden ist und somit zum limitierenden Faktor für die<br />
Sulfatreduzierer wird. Erste nähere Untersuchungen dieser physiologischen Gruppen ergaben,<br />
dass Sulfatreduzierer in den ersten 20 cm des Wattenmeersedimentes nur einen Anteil <strong>von</strong><br />
20 Prozent an der Gesamtanzahl der Bakterien haben (Llobet-Brossa et al., 2002). Somit ist<br />
der weitaus größere Teil der Bakteriengemeinschaft <strong>von</strong> fermentativ lebenden Bakterien<br />
geprägt, deren Vielfalt noch nicht weiter untersucht wurde (Schink, 2002). Thomsen et al.<br />
konnten in einem nahegelegenen marinen Küstenhabitat der Aarhus Bay mit<br />
molekularbiologischen Methoden zeigen, dass Sulfatreduzierer und auch methanogene<br />
Archaeen noch in mehreren Metern Tiefe vorkommen (Thomsen et al., 2001). Dabei sind<br />
Methanogene molekularbiologisch sehr viel einfacher nachzuweisen als sulfatreduzierende<br />
Bakterien, da die physiologische Diversität der Archaeen gegenüber der der Bakterien<br />
deutlich geringer ist (Madigan et al., 2003). Dennoch sind sämtliche Untersuchungen der<br />
„subsurface“ des Wattenmeeres noch auf molekularbiologische Untersuchungen angewiesen,<br />
da zwar erste Kultivierungsansätze erfolgreich waren (Köpke et al., 2005), sich aber z. B.<br />
bisher keine Archaeen kultivieren ließen.<br />
1.4 Gezielte Detektion <strong>von</strong> sulfatreduzierenden Prokaryoten und<br />
methanogenen Archaeen<br />
Für eine molekularbiologische Quantifizierung sulfatreduzierender Prokaryoten und<br />
methanogener Archaeen versucht man, Gene <strong>von</strong> Schlüsselenzymen der jeweiligen<br />
physiologischen Prozesse zu detektieren. Für die Sulfatreduktion ist das die dissimilatorische<br />
Sulfit Reduktase (dsr) und für die Methanogenese die Methyl Coenzym M Reduktase (mcr).<br />
9
EINLEITUNG<br />
Beide Enzyme katalysieren jeweils die letzten Schritte in der Sulfatreduktion<br />
beziehungsweise in der Methanogenese (Hallam et al., 2003; Zverlov et al., 2005). Für die<br />
Untersuchung wird dabei nicht das gesamte Operon beider Prozesse betrachtet, sondern<br />
lediglich die Untereinheit A des jeweiligen Operons. Diese wird verwendet, weil sie bei allen<br />
bislang untersuchten Vertretern beider physiologischer Gruppen vorhanden ist, wohingegen<br />
andere Untereinheiten bei einigen Organismen fehlen und deshalb nicht unbedingt essentiell<br />
zu sein scheinen (Zverlov et al., 2005). Zudem ist mittels der Denaturierenden Gradienten Gel<br />
Elektrophorese (DGGE) auch eine Aussage über die Diversität der physiologischen Gruppen<br />
möglich. Zusätzlich erlaubt die Sequenzierung der Amplifikate und der Vergleich mit<br />
abgelegten Sequenzen in Datenbanken wie der des National Center for Biotechnology<br />
Information (NCBI; http://ncbi.nih.gov) eine Identifizierung der Mikroorganismen.<br />
Rückschlüsse über die Diversität der vorhanden Mikroorganismen sind dadurch zulässig. Mit<br />
Hilfe der quantitativen real-time PCR ist es zusätzlich möglich, die genaue Menge an<br />
Sulfatreduzierern und Methanogenen zu bestimmen. Mit dieser Methode lassen sich<br />
theoretisch geringste Kopieanzahlen im Versuchsansatz quantifizieren. Dies ist wichtig, da<br />
die Anzahl an sulfatreduzierenden Prokaryoten und methanogenen Archaeen in marinen<br />
Sedimenten mit durchschnittlich zehn und ein Prozent der Gesamtzellzahl (Ishii et al., 2004;<br />
Mußmann et al., 2005) nur geringe Abundanzen aufweisen und somit sehr sensitiv<br />
nachgewiesen werden müssen. Mittels dieser Quantifizierung kann eine Veränderung der<br />
Zellzahlen über die Tiefe ermittelt werden, was im Einklang mit den chemischen Profilen zu<br />
wichtigen Aussagen führen kann. Auch können Übergangszonen zwischen Sulfat und Methan<br />
näher untersucht werden, um hier eventuell genauere Aussagen über eine anaerobe Oxidation<br />
<strong>von</strong> Methan (AOM) zu treffen.<br />
1.5 Anaerobe Oxidation <strong>von</strong> Methan<br />
Methan gehört zu der Gruppe der Kohlenwasserstoffe und gilt bei der globalen<br />
Klimabetrachtung als Treibhausgas. Da das Wattenmeer als ein potentieller Produzent <strong>von</strong><br />
Methan anzusehen ist (Grunwald, persönliche Kommunikation), sind die biologischen<br />
Stoffkreisläufe zur Methanbildung und auch dessen Abbau in den wissenschaftlichen Fokus<br />
geraten. In den Sedimenten des Wattenmeeres, wie auch in anderen anaeroben marinen<br />
Habitaten, wird Methan unterhalb der sulfathaltigen Schichten in größeren Mengen durch den<br />
anaeroben mikrobiellen Abbau organischer Substanzen <strong>von</strong> methanogenen Archaeen gebildet<br />
10
EINLEITUNG<br />
(Valentine, 2002). Aerob kann es dabei durch methanothrophe Bakterien abgebaut werden<br />
(Hanson & Hanson, 1996). Erste Untersuchungen zeigten auf, dass ein Abbau des Methans<br />
auch anaerob gekoppelt mit einer Sulfatreduktion erfolgen müsste (Iversen & Jorgensen,<br />
1985; Höhler et al., 1994). Dies wurde anhand gegenläufiger Profile des Sulfats und des<br />
Methans postuliert. Man nimmt heute an, dass bis zu 90 Prozent des gebildeten Methans in<br />
marinen Habitaten anaerob wieder abgebaut wird (Barnes & Goldberg, 1976; Hinrichs &<br />
Boetius, 2002). Boetius et al. konnten im Jahr 2000 mittels Fluoreszenz in-situ<br />
Hybridisierung (FISH) Konsortien <strong>von</strong> Sulfatreduzierern und Methanogenen (ANME)<br />
detektieren, die bis heute für den anaeroben Abbau des Methans verantwortlich gemacht<br />
werden (Boetius et al., 2000). Solche Konsortien sind in der Folgezeit in vielen marinen<br />
Habitaten detektiert worden (Orphan et al., 2001; Ishii et al., 2004). Dennoch konnte bis jetzt<br />
kein eindeutiger Beweis erbracht werden, dass es zu einem Austausch <strong>von</strong><br />
Elektronendonatoren zwischen den einzelnen Vertretern der Konsortien gekommen ist. Der<br />
einzige Beweis zur Feststellung einer Beteiligung <strong>von</strong> methanogenen Archaeen an der<br />
anaeroben Oxidation <strong>von</strong> Methan wurde indirekt geführt. So geht die biologische Oxidation<br />
<strong>von</strong> Methan mit einer Isotopenfraktionierung einher. Dabei wird das leichtere Isotop 12 CH 4<br />
gegenüber dem schwereren 13 CH 4 bevorzugt oxidiert. Die <strong>von</strong> den methanoxidierenden<br />
Prokaryoten gebildete Biomasse weist demzufolge niedrigere 13 C- zu 12 C-Verhältnisse auf als<br />
das im umgebenden Medium gelöste Methan (Burns, 1998). Solche erniedrigten delta 13 C-<br />
Werte ließen sich nun auch in für Archaeen charakteristischen Lipid-Biomarkern<br />
(Archaeolen) an den entsprechenden Standorten nachweisen (Elvert et al., 2000; Pancost et<br />
al., 2000). Die gleichzeitig auftretende starke Dominanz spezieller Archaeen (ANME 1-3) in<br />
den aktiven Sediment-Horizonten machte diese zu wahrscheinlichen Kandidaten für den<br />
methanoxidierenden Part in einer syntrophen Gemeinschaft (Hinrichs et al., 1999; Michaelis<br />
et al., 2002; Teske et al., 2002). Ähnliche niedrige delta 13 C-Werte in charakteristischen Lipid-<br />
Biomarkern der assoziierten sulfatreduzierenden Bakterien sprechen für das Vorhandensein<br />
eines in der reversen Methanogenese entstehenden Intermediates. Dies dient wahrscheinlich<br />
in der Folge den syntrophen Sulfatreduzierern als Elektronendonator. Aktuelle Modelle<br />
favorisieren in diesem Zusammenhang eine Reaktion, bei der die Übertragung des Methan-<br />
Kohlenstoffes auf Acetat bei gleichzeitiger Bildung <strong>von</strong> molekularem Wasserstoff erfolgt<br />
(Boetius et al., 2000; DeLong, 2000). Durch Laborversuche mit Konsortien in Sedimenten<br />
<strong>von</strong> Hydrate Ridge konnte 2001 gezeigt werden, dass diese unter anoxischen Bedingungen bei<br />
Oxidation definierter Mengen <strong>von</strong> Methan äquimolare Mengen an Sulfid produzieren<br />
(Nauhaus et al., 2002). Trotz all dieser Erkenntnisse ist der Sachverhalt, dass die anaerobe<br />
11
EINLEITUNG<br />
Oxidation <strong>von</strong> Methan auf die Konsortien beschränkt ist, umstritten. Erste Untersuchungen<br />
zeigen auf, dass die beteiligten Archaeen nicht nur auf Vertreter der ANME 1 bis 3<br />
beschränkt sind (Parkes et al., 2005). Zudem könnte man sich vorstellen, dass nicht nur in den<br />
Konsortien Methan anaerob oxidiert wird, sondern methanogene Vertreter durchaus in der<br />
Lage sind, die anaerobe Oxidation <strong>von</strong> Methan mit Sulfat auch ohne sulfatreduzierenden<br />
Partner durchzuführen. So liegen im sulfatreduzierenden Archaeon Archaeoglobus fulgidus<br />
fast alle Gene zur Methanogenese vor (Klenk et al., 1997). Weiter wird diese Hypothese<br />
dadurch unterstützt, dass ein Intermediat welches für ein Konsortium wichtig wäre, immer<br />
noch nicht eindeutig bestimmt werden konnte (Valentine & Reeburgh, 2000; Sørensen et al.,<br />
2001; Nauhaus et al., 2002).<br />
1.6 Diversität <strong>von</strong> Mikroorganismen<br />
Mit der Einführung des Stammbaumes des Lebens 1987 <strong>von</strong> Carl Woese (Woese, 1987), der<br />
nicht physiologische oder morphologische Merkmale als Grundlage hatte, sondern die<br />
ribosomale RNA speziell das 16S rRNA Gen, wurde eine neue Sichtweise der Arten<br />
eingeführt (Abb. 2).<br />
Abb. 2: Der grundlegende phylogenetische Baum des Lebens abgeleitet aus einer<br />
vergleichenden Analyse <strong>von</strong> 16S rRNA Gen Sequenzen. Der Baum verdeutlicht die<br />
Unterschiede zwischen Bakterien, Archaeen und Eukaryoten (Woese, 2000).<br />
12
EINLEITUNG<br />
Dieser neuen Sichtweise ist es auch zu verdanken, dass die Prokaryoten sich in die zwei<br />
Domänen der Bakterien und Archaeen unterteilen ließen. Zudem grenzten sich die<br />
Prokaryoten <strong>von</strong> den einzelligen Eukaryoten wie Pilze und Algen ab. Dieser neue Baum<br />
beruhte für die Domäne der Bakterien zunächst auf 12 Klassen, die als Grundlage jeweils<br />
mindestens einen kultivierten Vertreter besaßen. Dieser Stammbaum wurde bis ins Jahr 2005<br />
durch die molekularbiologischen Methoden auf 55 Klassen erweitert, wobei ein großer Teil<br />
der Klassen keinen kultivierten Vertreter mehr besaß (Backhed et al., 2005). Zudem belief<br />
sich im Jahre 2004 der Umfang an Sequenzen in der NCBI Datenbank auf über 32 Millionen,<br />
wobei da<strong>von</strong> lediglich 205.000 <strong>von</strong> benannten Organismen stammten (Benson et al., 2006).<br />
Die Spanne zwischen bekannten eindeutig benannten Sequenzen zu den nur<br />
molekularbiologisch gefunden Sequenzen wird somit täglich größer und ein Ende ist nicht<br />
abzusehen. Hierbei spielen die weiter entwickelten molekularbiologischen Methoden eine<br />
wichtige Rolle, da in wesentlich kürzerer Zeit immer mehr Sequenzen durch ein breites<br />
screening der Habitate detektiert werden. Somit nimmt die Anzahl an Sequenzen, zu denen<br />
keine kultivierten Vertreter existieren, immer weiter zu, während die Isolierung <strong>von</strong> Arten<br />
dieser Klassen häufig keine Erfolge aufweist (D'Hondt et al., 2004).<br />
Bei dieser Vielfalt an 16S rRNA Gen Sequenzen stellt sich schnell die Frage, ab wie viel<br />
Prozent Unterschied es sich eventuell um zwei verschiedene oder um ein und dieselbe Art<br />
handelt. Hagström et al. legten diese Grenze im Jahr 2000 auf 97 % Sequenzhomologie fest<br />
(Hagström et al., 2000). So sollten zwei Organismen, die mehr als drei Prozent Unterschied in<br />
ihren 16S rRNA Genen aufwiesen, als zwei Arten geführt werden. Stackebrandt und Goebel<br />
hatten aber schon 1994 in einer Studie über DNA-DNA Hybridisierung gezeigt, dass erst<br />
Organismen die bei dieser Hybridisierung weniger als 70 % erreichen, zu zwei<br />
unterschiedlichen Arten zu zählen sind. Das musste aber nicht unbedingt bedeuten, dass ihre<br />
16S rRNA Gene auch mehr als drei Prozent Abweichungen zeigten (Stackebrandt & Goebel,<br />
1994). Somit sollte das 16S rRNA Gen heute als Hinweis für zwei verschiedene Arten gelten,<br />
aber nicht zur Definition zweier Arten herangezogen werden.<br />
Analysen des ribosomalen Gens liefern zudem keine Aussagen über die physiologischen<br />
Eigenschaften der detektierten Mikroorganismen. Vergleiche mit den nächsten Verwandten in<br />
den Datenbanken können lediglich Hinweise liefern. Eine Aussage, welche physiologischen<br />
Eigenschaften ein Organismus hat und welche nicht, können eventuell Vollsequenzierungen<br />
des Genoms (Seshadri et al., 2005), aber auch Isolate liefern. Diese Isolate sind aber häufig<br />
nicht vorhanden, besonders wenn neue Habitate untersucht werden. Somit liefert die Analyse<br />
des ribosomalen Gens zumindest erste Hinweise auf die Zusammensetzung der mikrobiellen<br />
13
EINLEITUNG<br />
Gemeinschaften und auch dessen physiologischen Potentials, was durch die Messung <strong>von</strong><br />
chemischen Parametern unterstützt werden kann.<br />
1.7 Zielsetzung der Arbeit<br />
Ziel dieser Arbeit war es, die mikrobiellen Gemeinschaften in anoxischen Wattsedimenten bis<br />
hin zur sulfatfreien Zone mit Hilfe <strong>von</strong> molekularbiologischen Methoden zu charakterisieren.<br />
Veränderungen in der Zusammensetzung über die Tiefe sollten Rückschlüsse auf den<br />
Zusammenhang <strong>von</strong> Mikroorganismen und geochemischen Parametern ermöglichen.<br />
I. In diesem Teilprojekt der Arbeit stand die Diversität der Bakterien in drei<br />
verschiedenen Standorten des Spiekerooger Rückseitenwattes im Mittelpunkt. Bisherige<br />
Untersuchungen hatten sich nur mit den ersten 50 cm des Wattsedimentes befasst (Llobet-<br />
Brossa et al., 1998; Mußmann et al., 2003) und reichten dabei nicht in die sulfatfreien Zonen<br />
hinein. Ziel war es, Veränderungen in der Zusammensetzung der bakteriellen Gemeinschaften<br />
in anoxischen Wattsedimenten aufzuklären und Rückschlüsse auf Abhängigkeiten der<br />
Bakterien zur Sedimentabfolge oder dem wichtigen chemischen Parameter Sulfat<br />
aufzudecken. Dafür wurden Sedimentkerne <strong>von</strong> Sand- und Mischwattgebieten bis hin zur<br />
sulfatfreien Zone molekularbiologisch untersucht und in Beziehung mit aufgenommenen<br />
Sulfatprofilen und den einzelnen Sedimentschichten gestellt.<br />
II. Von den untersuchten anoxischen Wattsedimenten zeigte der Standort<br />
Neuharlingersieler Nacken ein zusätzliches Sulfatmaximum in 250 cm Tiefe. Da in dieser<br />
Tiefe die molekularbiologisch detektierten 16S rRNA Gen Sequenzen nicht eindeutig<br />
kultivierten Bakterien zugeordnet werden konnten, waren auch nur ungenügende Aussagen<br />
über deren Stoffwechselaktivitäten möglich. Deshalb sollten zusätzlich zu der Domäne der<br />
Bakterien die mikrobiellen Gemeinschaften der Archaeen und Eukaryoten<br />
molekularbiologisch untersucht werden. Da Archaeen durch molekularbiologische Methoden<br />
besser physiologisch zugeordnet werden können, lassen sich an den Übergangszonen<br />
zwischen Sulfat und Methan Interaktionen zwischen sulfatreduzierenden Prokaryoten, die nur<br />
etwa 20 Prozent der bakteriellen Gemeinschaften ausmachen (Llobet-Brossa et al., 2002), und<br />
methanogenen Archaeen ableiten. Ferner sollte untersucht werden, bis in welche Tiefe<br />
Eukaryoten zu finden sind und um welche Organismen es sich dabei handelt. Hinweise auf<br />
14
EINLEITUNG<br />
anaerob lebende Eukaryoten wurden bereits für Oberflächensedimente mariner<br />
Küstenhabitate beschrieben (Hamels et al., 1998; Moreira & Lopez-Garcia, 2002).<br />
III. Um quantitative Abschätzungen <strong>von</strong> sulfatreduzierenden Prokaryoten und<br />
methanogenen Archaeen zu treffen war ein weiteres Ziel der Arbeit, Untereinheiten der<br />
funktionellen Gene der Dissimilatorischen Sulfit-Reduktase, Alpha-Untereinheit (dsrA) und<br />
der Methyl-Coenzyme M Reduktase, Alpha-Untereinheit (mcrA), mittels quantitativer PCR<br />
zu bestimmen. Hierbei sollten Übergangszonen zwischen Sulfat und Methan mit größerer<br />
Tiefenauflösung näher untersucht werden, um Rückschlüsse auf eine anaerobe Oxidation <strong>von</strong><br />
Methan zu treffen, welche schon in nahen Küstensedimenten sowie benachbarten Watten<br />
beschrieben wurden (Thomsen et al., 2001; Ishii et al., 2004).<br />
1.8 Literatur<br />
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Diplomarbeit an der Carl <strong>von</strong> Ossietzky Universität Oldenburg,<br />
Fakultät V.<br />
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Lateral gene transfer of dissimilatory (Bi)sulfite reductase revisited. J. Bac. 187: 2203-<br />
2208.<br />
20
PUPLIKATIONEN<br />
2. Publikationen<br />
21
Publikation 1: Deep-biosphere bacteria in tidal flats<br />
2.1 Publikation 1<br />
Deep biosphere-related bacteria within the subsurface of tidal flat<br />
sediments<br />
<strong>Reinhard</strong> <strong>Wilms</strong>, Beate Köpke, Henrik Sass, Tae Soo Chang,<br />
Heribert Cypionka and Bert Engelen<br />
Environ. Microbiol. (2006) 8: 709-719<br />
22
Publikation 1: Deep-biosphere bacteria in tidal flats<br />
23
Publikation 1: Deep-biosphere bacteria in tidal flats<br />
24
Publikation 1: Deep-biosphere bacteria in tidal flats<br />
25
Publikation 1: Deep-biosphere bacteria in tidal flats<br />
26
Publikation 1: Deep-biosphere bacteria in tidal flats<br />
27
Publikation 1: Deep-biosphere bacteria in tidal flats<br />
28
Publikation 1: Deep-biosphere bacteria in tidal flats<br />
29
Publikation 1: Deep-biosphere bacteria in tidal flats<br />
30
Publikation 1: Deep-biosphere bacteria in tidal flats<br />
31
Publikation 1: Deep-biosphere bacteria in tidal flats<br />
32
Publikation 1: Deep-biosphere bacteria in tidal flats<br />
33
Publikation 2: Microbial communities in tidal-flat sediments<br />
2.2 Publikation 2<br />
Specific bacterial, archaeal and eukaryotic communities in tidal-flat<br />
sediments along a vertical profile of several meters<br />
<strong>Reinhard</strong> <strong>Wilms</strong>, Henrik Sass, Beate Köpke, Jürgen Köster,<br />
Heribert Cypionka and Bert Engelen<br />
Appl. Environ. Microbiol. (2006) 72: 2756-2764<br />
34
Publikation 2: Microbial communities in tidal-flat sediments<br />
35
Publikation 2: Microbial communities in tidal-flat sediments<br />
36
Publikation 2: Microbial communities in tidal-flat sediments<br />
37
Publikation 2: Microbial communities in tidal-flat sediments<br />
38
Publikation 2: Microbial communities in tidal-flat sediments<br />
39
Publikation 2: Microbial communities in tidal-flat sediments<br />
40
Publikation 2: Microbial communities in tidal-flat sediments<br />
41
Publikation 2: Microbial communities in tidal-flat sediments<br />
42
Publikation 2: Microbial communities in tidal-flat sediments<br />
43
Publikation 2: Microbial communities in tidal-flat sediments<br />
Supplemental material:<br />
44
Publikation 2: Microbial communities in tidal-flat sediments<br />
45
Publikation 3: Succession of sulfate-reducing Bacteria and methanogenic Archaea<br />
2.3 Publikation 3<br />
Methane and sulfate profiles within the subsurface of a tidal flat are<br />
reflected by the distribution of sulfate-reducing bacteria and<br />
methanogenic archaea<br />
<strong>Reinhard</strong> <strong>Wilms</strong>, Henrik Sass 1 , Beate Köpke,<br />
Heribert Cypionka and Bert Engelen *<br />
Running title<br />
Succession of sulfate-reducing bacteria and methanogenic archaea<br />
Eingereicht bei FEMS Microbiology Ecology<br />
Institut für Chemie und Biologie des Meeres, Carl-<strong>von</strong>-Ossietzky Universität Oldenburg,<br />
Carl-<strong>von</strong>-Ossietzky Straße 9-11, D-26129 Oldenburg, Germany<br />
1<br />
Present address: School of Earth, Ocean and Planetary Sciences, Cardiff University, Main<br />
Building, Park Place, Cardiff, CF10 3YE, Wales, UK<br />
*Corresponding author. Mailing address: Institut für Chemie und Biologie des Meeres, AG<br />
Paläomikrobiologie, Universität Oldenburg, Postfach 2503, D-26111 Oldenburg, Germany.<br />
Phone: +49-441-798-5376, FAX: +49-441-798-3583, email: engelen@icbm.de<br />
46
Publikation 3: Succession of sulfate-reducing Bacteria and methanogenic Archaea<br />
Abstract<br />
The anoxic layers of marine sediments are dominated by sulfate reduction and<br />
methanogenesis as the main terminal oxidation processes. The aim of the study was to analyse<br />
the vertical succession of microbial populations involved in these processes along the first<br />
4.5 m of a tidal-flat sediment. Therefore, a quantitative PCR approach was applied using<br />
primers targeting the domains of Bacteria, Archaea, and key functional genes for sulfate<br />
reduction (dsrA) and methanogenesis (mcrA). The sampling site was characterized by an<br />
unusual sulfate peak at 250 cm depth resulting in separate sulfate-methane transition zones.<br />
Methane and sulfate profiles were diametrically opposed with a methane maximum in the<br />
sulfate-depleted zone showing high numbers of archaea and methanogens. The methanesulfate<br />
interfaces were harboring elevated numbers of sulfate reducers and revealed a slight<br />
increase in mcrA and archaeal 16S rRNA genes suggesting sulfate-dependent anaerobic<br />
oxidation of methane. A diversity analysis of both functional genes by PCR-DGGE revealed a<br />
vertical succession of subpopulations that were governed by geochemical and<br />
sedimentological settings. Along the upper 200 cm sulfate-reducing populations appeared<br />
quite uniform and were dominated by Deltaproteobacteria. In the layers beneath an apparent<br />
increase in diversity and a shift to Firmicutes as the predominant group was observed.<br />
Keywords<br />
DGGE; Functional genes; Marine subsurface; Real-time PCR; Tidal flats<br />
47
Publikation 3: Succession of sulfate-reducing Bacteria and methanogenic Archaea<br />
1. Introduction<br />
Coastal marine environments like estuaries and tidal areas are an important link between<br />
land and the open sea. They receive nutrient input from both and as a result are characterized<br />
by intense primary production and heterotrophic activity [1-3]. As a consequence, pronounced<br />
microbial activities in the upper sediment layers are generating steep chemical gradients.<br />
Oxygen is depleted within the uppermost few millimeters and anoxic conditions prevail<br />
beneath this layer [4]. Sulfate reduction is considered to be the most important process of<br />
organic matter remineralisation [5, 6]. The dissimilatory reduction of sulfate can be linked to<br />
the oxidation of substrates difficult to degrade under anoxic conditions like alkanes and<br />
aromatic compounds [7] or even to the anaerobic oxidation of methane at sulfate-methane<br />
transition zones [8-10]. Generally, methanogenesis becomes the dominant terminal oxidation<br />
process when sulfate is depleted. In most sediments, the sulfate-depleted zone is located tens<br />
of centimeters to several meters in depth. These subsurface sediment layers came into focus of<br />
microbiological investigations only recently [10]. The community composition of subsurface<br />
tidal-flat sediments was studied by a cultivation-based approach [11] and by a phylogenetic<br />
survey using domain-specific primers [12, 13].<br />
A more directed strategy to study the distribution of physiological groups in the<br />
environment is the analysis of functional genes such as those that encode for the dissimilatory<br />
sulfate reductase (dsr) and the methyl-coenzyme M reductase (mcr) [14-19].<br />
In the present work, we provide a detailed analysis of the sulfate-reducing and<br />
methanogenic communities from the surface to five meters depth in a tidal-flat sediment. Two<br />
complementary approaches were applied. Quantitative PCR (qPCR) [20] was used to estimate<br />
the abundance of Bacteria and Archaea, as well as of dsrA and mcrA genes. The resulting<br />
depth profiles were correlated with those of porewater sulfate and methane. The quantitative<br />
approach was complemented by a qualitative diversity assessment of both metabolic groups<br />
using functional primers for PCR-DGGE.<br />
48
Publikation 3: Succession of sulfate-reducing Bacteria and methanogenic Archaea<br />
2. Materials and methods<br />
2.1. Sample collection<br />
The sampling site Neuharlingersieler Nacken (53°43´270 N and 07°43´718 E) is located<br />
in the back barrier tidal area of the island of Spiekeroog, which is part of the German Wadden<br />
Sea. The biogeochemical settings of this site have been described recently [11, 12]. Up to 5<br />
meter long sediment cores were collected by vibro-coring using aluminum tubes (Ø 8 cm) in<br />
June 2002 (core A), October 2003 (core B), February 2004 (core C) and September 2005<br />
(core D). The liners of core A to C were cut longitudinally, whereas core D was cut directly<br />
across to avoid degassing of methane during sampling. Subcores for further analyses were<br />
taken using cut-off 5-ml syringes from the innermost part of the cores every 20 cm, beginning<br />
at a depth of 40 cm. Additionally, shorter sediment cores were taken by hand at the same<br />
position to obtain undisturbed subsamples from the sediment surface and 20 cm depth. After<br />
sampling, all subcores taken for molecular analysis were stored at - 20 °C until further<br />
processing.<br />
2.2. Sulfate and methane measurements<br />
Porewater was gained from sediment samples by centrifugation and filtration through 0.2-<br />
µm membrane filters. Porewater sulfate concentrations were measured by ion<br />
chromatography with conductivity detection (Sykam, Gilching, Germany) as described<br />
previously [21].<br />
For measuring methane concentrations, 2 cm³ of sediment were added immediately after<br />
subsampling to 20 ml sodium hydroxide solution (2.5 %) in gastight tubes. Headspace<br />
samples (20 µl) were analyzed on a Varian CX 3400 gas chromatograph (Varian, Darmstadt,<br />
Germany) equipped with a Plot Fused Silica column (No. 7517; 25 m by 0,53 mm, Al 2 O 3 /KCl<br />
coated; Chromopack, Middleburg, The Netherlands) and a flame ionization detector.<br />
2.3. Total cell counts<br />
Sediment samples were fixed by the addition of glutaric dialdehyde (0.2 m filtered, 2 %<br />
final concentration) and stored at 4 °C in the dark. Prior to analysis, Tween 80 (0.2 m<br />
filtered, 0.01 % final concentration) was added to the fixed sediment slurries and the samples<br />
were ultrasonicated (3 x 10 s). An aliquot (5 – 10 l) was diluted 1000-fold in particle-free<br />
PBS buffer (0.9 g NaCl, sodium phosphate buffer 15 mM, pH 7.4, 0.2 m filtered),<br />
thoroughly shaken, and filtered through a white polycarbonate membrane (0.2 m pore size,<br />
49
Publikation 3: Succession of sulfate-reducing Bacteria and methanogenic Archaea<br />
25 mm diameter, Anodisc 25, Whatman, Maidstone, UK). Cell staining with DAPI (4,6-<br />
Diamidino-2-phenylindol) and counting was performed according to Süß et al. (2004) [22].<br />
2.4. DNA extraction and quantification<br />
Total genomic DNA was extracted from 0.5 g sediment of each subcore using the<br />
FastDNA SpinKit (Q-BIOgene, Carlsbad, Canada). DNA concentrations were quantified<br />
fluorometrically in a microtiterplate reader (FLUOstar Optima, BMG Labtechnologies,<br />
Offenburg, Germany) using a 1:200 diluted PicoGreen reagent according to a modified<br />
manufacturers protocol (Molecular Probes, Eugene, USA). In contrast to the original<br />
instructions, only the tenth part of each volume and 1 µl of the extracted DNA and Lambda-<br />
DNA in different concentrations from 100 ng·µl -1 to 1 ng·µl -1 were used.<br />
2.5. Quantitative PCR<br />
Primer sets specific for different phylogenetic domains and functional genes were used<br />
for the quantitative (real-time) PCR assay (Table 1) [14, 23-27]. Before quantification, serial<br />
dilutions of standard DNA had to be prepared. The standard organism for the bacterial<br />
16S rRNA gene and dsrA-gene approach was Desulfovibrio vulgaris T (DSM 644). A culture<br />
of Methanosarcina barkeri T (DSM 800) was used as a standard for archaeal 16S rRNA gene<br />
and mcrA-gene quantifications. Genomic DNA was extracted from liquid cultures using the<br />
FastDNA SpinKit (Q-BIOgene, Carlsbad, Canada). These DNA extracts were amplified by<br />
the use of the bacterial primer pair 8f and 1492r or the archaeal primer pair S-D-Arch-0025-a-<br />
S-17 and S-*-Univ-1517-a-A-21 (Table 1), respectively. Conditions for the eubacteriaspecific<br />
PCR were described by Süß et al. [22], and before those for the archaea-specific<br />
approach by Vertriani et al. [26]. The PCR amplicons were purified and adjusted to a volume<br />
of 50 µl using the PCR purification Kit in accordance with the manufacturer's instructions<br />
(Qiagen, Hilden, Germany) and served as a target for the qPCR standard curves. For this, they<br />
were diluted from 1:10 3 to 1:10 10 . As a standard for the functional genes, the total extracted<br />
genomic DNA of Desulfovibrio vulgaris T and Methanosarcina barkeri T were used in dilutions<br />
of 1:10 1 to 1:10 7 .<br />
Quantitative PCR-amplification was performed in 25 µl volume containing: 12.5 µl of the<br />
DyNAmo TM HS SYBR Green qPCR Kit (Finnzymes Oy, Espoo, Finland), 0.2 mM of each<br />
primer, 0.6 ng/µl BSA (only 0.2 ng/µl BSA were used for the bacterial approach) and 10 µl of<br />
the 1:10 diluted DNA templates. Thermal cycling was performed using a Rotor-Gene, RG-<br />
3000 four channel multiplexing system (Corbett Research, Sydney, Australia) with the<br />
50
Publikation 3: Succession of sulfate-reducing Bacteria and methanogenic Archaea<br />
following parameters: 95 °C initial hold for 15 minutes to activate the Taq polymerase,<br />
followed by 50 cycles of amplification, with each cycle consisting of denaturation at 94 °C for<br />
10 s, followed by 20 s annealing at primer specific temperatures (Table 1) and the extension<br />
step for 30 s at 72 °C. Fluorescence was measured at the end of each amplification cycle for<br />
20 s at 82 °C and 80 °C for the quantification of Archaea, respectively.<br />
To verify the results, every quantification was repeated three times at the same<br />
concentrations for all chemicals and templates. To convert the detected gene targets into cell<br />
numbers, an average of 3.8 and 2 copies of the 16S rRNA gene were estimated for Bacteria<br />
and Archaea, respectively [28].<br />
2.6. PCR-DGGE analysis<br />
Amplification of dsrA-gene fragments was performed via nested PCR. For this, a part of<br />
the dsrAB operon (app. 1.9 kb in size) was amplified by a first step using the modified<br />
primers dsr1F and dsr4R (Table 1). For the second PCR, primer GC-dsr500r and the dsr1F<br />
were used to amplify dsrA-gene fragments of suitable lengths for DGGE analysis (app.<br />
500 bp). The GC-clamp containing primer GC-dsr500r was originally published as the<br />
forward primer 1F1 by Dhillon et al. [14]. In our approach it was used as a reverse primer and<br />
therefore synthesised reverse complementary. The partial mcrA-gene (app. 500 bp) was<br />
amplified directly by the use of primer mcrA1f and the GC-clamp containing primer GCmcrA500r<br />
[29]. PCR mixtures (50 µl volume) were composed of 0.2 mM dNTPs, 1.5 mM<br />
MgCl 2 , 0.2 mM of each primer, 1 Red Taq Buffer (Sigma, Munich, Germany), 0.6 ng·µl -1<br />
BSA, 1 U Red Taq DNA polymerase (Sigma, Munich, Germany) and 1 µl of target DNA.<br />
Templates for the second step of the nested-PCR were 1 µl of 1 to 500 dilutions of amplicons<br />
obtained by the first PCR. For both amplification steps of the dsrA-gene PCR was set to 30<br />
cycles, while for the mcrA-gene 40 cycles were applied. PCR reactions were carried out in a<br />
thermal cycler (Mastercycler, Eppendorf, Hamburg, Germany) under the following<br />
conditions: a denaturation temperature of 96 °C for 30 s, the respective primer-specific<br />
annealing temperature (Table 1) for 45 s and an elongation temperature of 72 °C for 1 min,<br />
followed by a final elongation step at 72 °C for 10 min. PCR products were checked by<br />
agarose electrophoresis, purified and adjusted to a volume of 10 µl using the MinElute PCR<br />
purification Kit (Qiagen, Hilden, Germany). The amplicons were separated by denaturing<br />
gradient gel electrophoresis (DGGE) on an INGENYphorU-2 system (Ingeny, Goes, The<br />
Netherlands) using a denaturing gradient from 40 to 70 % (where 100 % denaturant contains<br />
51
Publikation 3: Succession of sulfate-reducing Bacteria and methanogenic Archaea<br />
7 M urea and 40 % formamide). Electrophoresis and DGGE pattern analysis was performed<br />
as described previously [12].<br />
TABLE 1. Oligonucleotide sequences used in the DGGE and qPCR approach.<br />
Target Primer DNA sequence Product size Annealing- / fluorescence Approach<br />
[Reference] [bp] measured temperature<br />
dsrA gene dsr-1F [27] 5´-ACSCACTGGAAGCACG-3´ ca. 1,900 58 °C DGGE<br />
dsr-4R [27]<br />
5´-GTGTAGCAGTTACCGCA-3´<br />
dsrA gene dsr-1F [27] 5´-ACSCACTGGAAGCACG-3´ ca. 500 60 °C DGGE<br />
GC- dsr-500r [14] a 5´-GC-clamp- CGGTGMAGYTCRTCCTG-3´<br />
mcrA gene mcrA1f [29] 5´-GGTGGTGTMGGATTCACA ca. 500 58 °C DGGE<br />
CARTAYGCWACAGC-3´<br />
GC-mcrA500r [29] 5´-GC-clamp-TTCATTGCRTAG<br />
TTWGGRTAGTT-5´<br />
Bacteria 8f [24] 5´-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´ ca. 1,500 54 °C qPCR<br />
1492r [24] 5´-GGTTACCTTGTTACGACTT-3´ Standard<br />
Archaea S-D-Arch-0025-a-S-17 [26] 5´-CTGGTTGATCCTGCCAG-3´ ca. 1,500 48 °C qPCR<br />
S-*-Univ-1517-a-A-21 [26] 5´-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3´<br />
Standard<br />
Bacteria 519f [24] 5´-GCCAGCAGCCGCGGTAAT-3´ ca. 390 50 °C / 82 °C qPCR<br />
907r [25]<br />
5´-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3´<br />
Archaea S-D-Arch-0025-a-S-17 [26] 5´-CTGGTTGATCCTGCCAG-3´ ca. 320 48 °C / 80 °C qPCR<br />
S-D-Arch-0344-a-S-20 [26] 5´-ACGGGGCGCAGCAGGCGCGA-3´<br />
dsrA gene dsr-1F [27] 5´-ACSCACTGGAAGCACG-3´ ca. 450 58 °C / 82 °C qPCR<br />
dsr-500r [14] a<br />
5´-CGGTGMAGYTCRTCCTG-3´<br />
mcrA gene ME1f [23] 5´-GCMATGCARATHGGWATGTC-3´ ca. 300 54 °C / 82 °C qPCR<br />
ME3r [23]<br />
5´-TGTGTGAASCCKACDCCACC-3´<br />
a reverse and complementary<br />
2.7. Sequencing and phylogenetic analysis<br />
DGGE bands obtained by the dsrA-gene approach were excised, treated and sequenced as<br />
described previously [30]. The PCR protocol was modified for reamplification: 96 °C for<br />
30 s, 60 °C for 45 s and 72 °C for 1 min (25 cycles) and a final elongation at 72 °C for<br />
10 min. The phylogenetic calculations were conducted by applying the phylogenetic analysis<br />
software ARB [31] using reference sequences. All partial dsrA-gene sequences obtained in<br />
this study have been deposited in the EMBL database under accession numbers AM234729 to<br />
AM234743.<br />
52
Publikation 3: Succession of sulfate-reducing Bacteria and methanogenic Archaea<br />
3. Results<br />
3.1. Sulfate and methane profiles<br />
Previous investigations of the sampling site (cores A to C) had revealed relatively<br />
uniform lithological profiles, with sand-dominated upper layers, mud at the bottom of the<br />
cores and an intermediate shell layer (approximately 170 to 240 cm depth) [13]. This shell<br />
layer corresponded to a subsurface sulfate maximum, indicating a possible influx of sulfaterich<br />
water from a nearby tidal creek. The porewater sulfate profiles taken at four sampling<br />
campaigns were also highly similar, with minor variations at the sediment surface and in the<br />
magnitude of the deep sulfate peak. Therefore, the methane profile that was measured in<br />
September 2005 (core D) can be assumed to reflect also the situation in the cores A to C.<br />
Sulfate concentrations at the surface were around 28 mM and rapidly decreased to values<br />
below 1 mM beneath 50 cm depth (Fig. 1A). Methane concentrations at the sediment surface<br />
did not exceed 0.5 µM, while in the sulfate minimum zone concentrations of up to 125 µM<br />
were measured. In the subsurface the sulfate peak between 200 and 380 cm depth methane<br />
concentrations declined again to values around 5 µM. Beneath 400 cm depth, sulfate was<br />
depleted to concentrations below 0.2 mM, whereas methane increased again to values of<br />
100 µM. These unusual profiles resulted in the presence of three sulfate-methane transition<br />
zones at around 100, 220 and 370 cm depth. Standard deviations between the investigated<br />
cores were in the range of about 0.04 mM for low sulfate concentrations and up to 4.26 mM<br />
for high values.<br />
3.2. Quantification of Prokarya and functional genes<br />
Similar to the relatively minor variations in geochemical gradients, epifluorescence<br />
microscopy revealed that total cell counts in the different cores differed only slightly as well.<br />
In surface sediment generally, 3 to 5 10 8 cells per cm 3 were found. Numbers declined to<br />
10 8 - 10 7 cells per cm 3 at 300 cm depth (data not shown).<br />
The ratio of archaeal to bacterial 16S rRNA gene copies as determined by qPCR generally<br />
increased from 1:100 at the surface to 1:3 at 450 cm depth. The calculated standard deviations<br />
for replicate quantifications of one core were mainly between 10 and 50 percent. Differences<br />
between corresponding layers of all cores were slightly higher. Estimated bacterial numbers<br />
were highest at the sediment surface, whereas Archaea peaked at a depth of 140 cm (Fig. 1B).<br />
Beneath 200 cm depth the estimated cumulative prokaryotic cell numbers decreased to 10 6<br />
cells per gram sediment. In the sulfate-depleted zone (140 to 180 cm) and the shell layer<br />
bacterial numbers were steadily low, but strongly decreased within the mud layers beneath.<br />
53
Publikation 3: Succession of sulfate-reducing Bacteria and methanogenic Archaea<br />
The highest numbers of archaeal targets were detected in the sulfate-depleted layers and<br />
constantly declined within the shell and mud layers.<br />
Fig. 1. Depth profiles of site Neuharlingersieler Nacken. Higher values of microorganisms and functional genes<br />
were determined at the sulfate-methane transition zones (100 and 200 cm). Values of core A are given in<br />
squares, core B in triangles, core C in circles, and core D in diamonds. The curves display average values. a)<br />
Sulfate (black symbols) and methane (grey symbol) profiles along the sediment core. b) Calculated numbers of<br />
Bacteria (black symbols) and Archaea (grey symbols) per gram sediment. c) Calculated numbers of dsrA genes<br />
(black symbols) and mcrA genes (grey symbols) per gram sediment.<br />
The depth profiles of the functional genes representative for sulfate-reducing prokaryotes<br />
and methanogenic archaea generally correlated well with those of the bacterial and archaeal<br />
16S rRNA genes (Fig. 1C). High values for the dsrA and the mcrA gene were obtained from<br />
near-surface sediments. The depth decrease in numbers of dsrA genes followed the general<br />
bacterial trend. The peak of archaeal 16S rRNA gene copies around 140 cm depth was well<br />
reflected by the profile obtained for the mcrA gene. At the upper two sulfate-methane<br />
transition zones elevated numbers of dsrA gene copies were detected, suggesting anaerobic<br />
methane oxidation coupled to sulfate reduction in these layers. These local maxima at<br />
approximately 100 and 200 cm depth coincided with a faint local maximum of mcrA as well<br />
as of bacterial and archaeal 16S rRNA gene copies. In the deep mud layers detected numbers<br />
were generally at least one order of magnitude lower that in the shell and sand layers, so that<br />
no clear maxima could be recognized.<br />
54
Publikation 3: Succession of sulfate-reducing Bacteria and methanogenic Archaea<br />
The ratio of dsrA genes to bacterial 16S rRNA gene numbers ranged from 1:50 to 1:20<br />
throughout the entire sediment column. Surprisingly, the ratio of mcrA genes to archaeal<br />
16S rRNA targets decreased from 1:3 to 1:7 in the sandy sediment layers to less than 1:100 at<br />
300 cm depth.<br />
3.3. DGGE analysis of mcrA and dsrA genes<br />
The diversity analysis of mcrA and dsrA genes by DGGE resulted in distinct clusters<br />
reflecting different compartments of the sediment column (Figs. 2 and 3). Those are<br />
characterized by geochemical settings. Samples obtained from corresponding depths of the<br />
different cores (A to C) revealed highly similar patterns, and generally showed less overlap to<br />
samples from other depths.<br />
Fig. 2. Cluster analysis of DGGE band patterns with specific primers for the mcrA gene. The zone from 220 to<br />
280 cm revealed a different community composition. The other depths were characterized by low sulfate<br />
concentrations, which reflects the competition between sulfate reducers and methanogens. The dendrogram was<br />
calculated by Pearson correlation and UPGMA. Spatial variations in community composition (marked by an<br />
asterisk) were reflected by the affiliation of single sediment layers of a given core to different layers of other<br />
cores.<br />
55
Publikation 3: Succession of sulfate-reducing Bacteria and methanogenic Archaea<br />
Fig. 3. Cluster analysis of DGGE band patterns with specific primers for the dsrA gene and position of bands<br />
sequenced. The depths of 280 and 320 cm showed a different sulfate-reducing community composition than<br />
other layers reflecting decreasing sulfate and low methane concentrations. Bands revealing sequences that are<br />
closely related to the same dsrA gene are marked by the same letter. Phylogenetic affiliation, sequence<br />
similarities and depth distribution are given in Table 2.<br />
One cluster of mcrA-gene patterns was detected at 220 and 280 cm depth, characterized<br />
by the deep sulfate peak and decreasing methane concentrations. The other patterns formed a<br />
second cluster. Due to outliers (marked by an asterisk in Fig. 2), subclusters of other<br />
compartments are not clearly visible. However, layers containing high and low methane<br />
concentrations seem to possess similar mcrA genes. While band patterns of dsrA amplicons<br />
yielded different clusters, they correlated with the sedimentological settings rather than with<br />
geochemical gradients (Fig. 3). The sand- and shell-dominated upper layers (down to 220 cm<br />
depth) revealed relatively uniform patterns with a single dominant and a few faint additional<br />
bands. A major shift was observed for the mud layers from 220 cm downwards. They were<br />
characterized by a higher variability and apparently increasing band numbers.<br />
56
Publikation 3: Succession of sulfate-reducing Bacteria and methanogenic Archaea<br />
TABLE 2. Overview of dsrA-gene phylotypes from sulfate-reducing prokaryotes detected by PCR-DGGE. The letters and numbers<br />
correspond to the appearance and position of different detected phylotypes given in Figure 3. The similarity of the phylotypes which was<br />
more than one time detected are given in percent. For each phylotype the most closely related sequence, the closest cultivated organism and<br />
its appearance with depth are given. Closely related sequences revealed the same closest relative were grouped and labeled with the same<br />
letter (A to C). The sequence variation (in percent) in this single groups is given in brackets.<br />
Appearance of Closest described relative Sim. Closest phylotype Sim. Distribution with<br />
depth [cm]<br />
dsrA sequences (%) (%) 0 160 - 180 220 -<br />
360<br />
A (99%) Unc. a sulfate-reducing bacterium mCR119 84 Desulforhopalus singaporensis T 75 + +<br />
B (98%) Unc. sulfate-reducing bacterium VHS057 82 Desulfonatronum lacustre T 73 + +<br />
C (91-100%) Unc. sulfate-reducing bacterium UI-DSR43 77 Desulfotomaculum thermosapovorans T 77 + +<br />
D Unc. sulfate-reducing bacterium KA064 85 Desulfobacca acetoxidans T 71 +<br />
E Unc. sulfate-reducing bacterium KS03 78 Desulfobacca acetoxidans T 67 +<br />
F Unc. sulfate-reducing bacterium xCR031 77 Desulfonema limicola T 73 +<br />
G Unc. sulfate-reducing bacterium Sed2-DSR11 86 Desulfobacca acetoxidans T 67 +<br />
a Unc., Uncultured.<br />
Sequencing the main dsrA amplicons along the upper 220 cm (band A, Fig. 3) revealed a<br />
similarity of 75 % to the dsrA gene from the Deltaproteobacterium Desulforhopalus<br />
singaporensis T (Table 2) and of 90 % to the Wadden Sea clone DSR_SpoogII_043_C07<br />
(Mussmann, personal communication). Most sequences originating from the layers beneath<br />
220 cm depth (band C) were closely related to the dsrA gene of the Firmicute<br />
Desulfotomaculum thermosapovorans T (77 % similarity). Three other sequences with low<br />
similarities among each other were affiliated to Desulfobacca acetoxidans T as closest<br />
described phylotype (67 - 71 % similarity).<br />
57
Publikation 3: Succession of sulfate-reducing Bacteria and methanogenic Archaea<br />
4. Discussion<br />
In the present study population sizes of bacteria, archaea, sulfate reducers and<br />
methanogens along the geochemical gradients of tidal-flat sediment were estimated by<br />
applying quantitative PCR. It turned out that population sizes of the different groups were<br />
well correlated with the respective geochemical gradients, and that anaerobic methane<br />
oxidation coupled to sulfate reduction might occur in these sediments.<br />
4.1. Prokaryotes quantification in sediments<br />
In our investigation, total cell counts in deeper layers showed higher values than<br />
calculated after quantitative PCR analysis. It is feasible that total cell counts by DAPI staining<br />
overestimate the actual in situ numbers by counting cell like particles. These false positive<br />
signals increase with decreasing cell numbers due to the need of concentrating sample<br />
material. A novel method with neglectable background signals using SYBR green as<br />
fluorescence dye was developed by Lunau et al. [32]. This technique yielded the same cell<br />
numbers for Wadden Sea surface sediments (Lunau and Hilker, personal communications) as<br />
our direct counts by DAPI, while for deeper layers a tenfold lower cell number was counted.<br />
These findings would correspond much better with the calculated numbers of Prokaryotes by<br />
quantitative PCR. However, there are other potential reasons for differences between direct<br />
counts and qPCR like varying DNA extraction efficiencies, co-extraction of PCR interfering<br />
humic-like substances, or deviating 16S rRNA gene copy numbers [28].<br />
4.2. Abundance of methanogens within the subsurface<br />
Functional genes indicative for methanogens and sulfate reducers were detected along the<br />
entire sediment column from the surface down to 450 cm depth. This is surprising since both<br />
physiological groups generally compete for the same substrates and hence are thought to not<br />
co-occur. However, methylothrophic methanogens might escape direct competition with<br />
sulfate reducers by utilization of certain methylated substrates (e.g. methyl amines, dimethyl<br />
sulfide) not utilized by the latter [33]. On the other hand, the relatively high numbers of mcrA<br />
targets detected just beneath the oxidized surface sediments could also be a result of<br />
occasionally occurring high organic matter supply by sedimentation. This short-term substrate<br />
surplus may rid the methanogens of the direct competition and offer a short-term niche [34,<br />
35]. The high numbers of Archaea and mcrA-gene targets between 100 and 200 cm indicate<br />
that these organisms are responsible for the methane peak within the sulfate-depleted zone.<br />
58
Publikation 3: Succession of sulfate-reducing Bacteria and methanogenic Archaea<br />
At first sight it seems surprising that the high methane values at 450 cm depth were not<br />
accompanied by strongly increasing numbers of methanogens or mcrA genes. However, this<br />
can be partly explained by sedimentological parameters. Compared to the coarse sand and<br />
shell layers the fine-grained mud has a very low hydraulic conductivity diminishing diffusive<br />
fluxes and leading to relatively steep chemical gradients. On the other hand, cell counts<br />
obtained by epifluorescence microscopy were already more than one order of magnitude<br />
lower than those for the sand layers. This trend was supported by the results of the<br />
quantitative PCR that indicated an even stronger decrease. A potential bias may also be<br />
caused by insufficient coverage of the target phyla by the PCR primers used. In a previous<br />
study, we detected a new branch within the Euryarchaeota present in the deep mud layers by<br />
applying primers targeting eukaryotic rRNA genes [13]. These archaea were not detected in<br />
the assays using archaeal primers, suggesting a potential underestimation of the actual in situ<br />
numbers of some groups of archaea.<br />
4.3. Relative abundance of sulfate-reducing bacteria<br />
The ratio of dsr to bacterial 16S rRNA targets in deeper sediment layers of site<br />
Neuharlingersieler Nacken was similar to that at the sediment surface (app. 5 %). However,<br />
the described qPCR bias for the quantification of Prokaryotes and functional genes should be<br />
roughly the same. Therefore, the calculated percentage of sulfate reducers does not change<br />
significantly. Even though they only account for five to ten percent of the whole community,<br />
they contribute thoroughly to biochemical processes within subsurface sediments. However,<br />
the calculated number was two to five times lower than described for other marine sediments<br />
[36, 37]. The discrepancy might be explained by the different methodological approaches<br />
used in these studies. Applying fluorescence in situ hybridization combined with catalyzed<br />
reporter deposition (CARD–FISH), Mußmann et al. investigated the uppermost layers of an<br />
adjacent tidal flat [36]. Sulfate reducers were estimated to represent app. 10 % of the total cell<br />
count which is in the same order of magnitude as our results. The deviations might be due to<br />
the different sedimentological settings of the investigated sampling sites. Sahm et al. have<br />
used slot-blot hybridization to calculate a proportion of SRB on the total prokaryotic rRNA of<br />
18 to 25 % in sediments of Aarhus Bay, Denmark [37]. However, this calculation is based on<br />
the assumption that all microorganisms contain the same amount of ribosomal RNA. This<br />
favors the quantification of microorganisms with a higher amount of ribosomes. In general,<br />
the method of choice depends on the question to be answered. DNA-based quantitative PCR<br />
and CARD-FISH show comparable results when certain abundancies are determined. The big<br />
59
Publikation 3: Succession of sulfate-reducing Bacteria and methanogenic Archaea<br />
advantage in analyzing RNA in contrast to DNA is that conclusions can specifically be drawn<br />
on active members of the microbial communities.<br />
4.4. Diversity of the sulfate-reducing populations<br />
At first sight the findings by DGGE analysis suggest an increasing diversity of sulfate<br />
reducers with depth. A vertically structured community of sulfate-reducing bacteria was<br />
found that was governed by more than a single environmental factor. Cluster analysis<br />
reflected the sedimentological settings to a certain extent. The sand- and shell layers were<br />
grouped together and the mud layers formed a separate cluster. However, similar patterns<br />
were found for sulfate-rich surface layers and the sulfate-depleted zone (160-180 cm). In this<br />
respect, our results differ from previous reports, that described changing communities of<br />
sulfate-reducing bacteria in surface sediments along an estuarine-salinity gradients and<br />
concomitantly increasing sulfate concentrations [18, 38].<br />
In general, the detected shift from sulfate-reducing bacteria affiliated to<br />
Deltaproteobacteria to those of Firmicutes is an agreement with previous analyses of the<br />
same sampling site. In a molecular approach, a shift from Proteobacteria to the Chloroflexi<br />
with depth indicated similar properties as deep biosphere habitats [12]. In a cultivation based<br />
approach, a shift to the Firmicutes with depth was found, indicating the presence of inactive<br />
spores [11]. Thus, the detection of dsrA genes that derived from Firmicutes might also be due<br />
to the accumulation of spores in deeper layers. The assessment of active microorganisms can<br />
only be achieved by RNA based methods. However, the analysis of sulfate-reducing<br />
communities via dsrA sequence analysis is prone to two more shortcomings. The limited<br />
sequence length (app. 350 bp) and - despite extensive recent work [27, 39] - still relatively<br />
low numbers of dsr sequences in the databases. This hinders the correct affiliation of a<br />
detected sequence to a certain phylogenetic group. On the other hand, the sequences detected<br />
by the DGGE approach can be expected to be present in significant numbers, since dsrA-gene<br />
sequences must represent one percent or more to be detected [40]. Therefore, the results<br />
presented here point in the same direction as those obtained by CARD-FISH [36]. Mußmann<br />
et al. found Desulfobulbaceae (including Desulforhopalus spp.) to represent up to 4 % of the<br />
bacterial community, while the most abundant SRB belonged to the Desulfosarcinales. The<br />
latter were present in the DGGE analysis as well, but delivered only a relatively faint band<br />
(Fig. 3, band F; related to Desulfonema limicola).<br />
60
Publikation 3: Succession of sulfate-reducing Bacteria and methanogenic Archaea<br />
4.5. Heterogeneity of the dsrA-gene sequences<br />
Although the total number of DGGE bands increased with depth, only two relatively<br />
homogeneous groups of sequences were found. The sequences of nine dsrA-gene fragments<br />
were affiliated to the dsrA gene of Desulfotomaculum thermosapovorans T but showed a<br />
different migration behavior in the DGGE gel. This genomic diversity was detected since the<br />
DGGE approach in principle can separate bands differing only in a single nucleotide [41].<br />
Due to the wobble hypothesis [42] sequence mutations of functional genes occur more<br />
frequently than in the highly conserved 16S rRNA gene. Sequence variations of the<br />
Desulfotomaculum thermosapovorans T affiliated dsrA genes were in 75 % of all cases caused<br />
by a mutation on the third nucleotide of the triplet code and obviously have less detrimental<br />
impact. At present, we can only speculate about the functional meaning of the remaining<br />
micro-heterogeneity of the dsrA sequences. But it might reflect adaptation to environmental<br />
conditions and occupation of different ecological niches [43].<br />
4.6. Anaerobic methane oxidation<br />
At several investigated sediments elevated numbers of sulfate reducers and methanogens<br />
within sulfate-methane transition zones suggest an anaerobic methane oxidation coupled to<br />
sulfate reduction [9, 10, 44, 45]. This process might also occur at site Neuharlingersieler<br />
Nacken. This is not only indicated by the elevated numbers of mcrA- and dsrA-gene copies at<br />
the sulfate-methane transition zones. The steep slope of the methane profile at the upper edge<br />
of the subsurface sulfate peak at 170 to 220 cm depth points towards a consumptive process.<br />
Highly specialized consortia of sulfate reducers (Desulfosarcina or Desulfococcus) and<br />
members of the archaeal ANME groups were supposed to conduct this reaction in sediments<br />
overlying methane hydrates [46, 47]. Their molecular signatures were also found in coastal<br />
sediments from Aarhus Bay [10]. Although the consortia were just recently detected by<br />
CARD-FISH in a nearby sand flat [8], at present we do not know if other phylogenetic groups<br />
might be involved in this process at site Neuharlingersieler Nacken. At the sulfate-methane<br />
interface of a deep sub-seafloor habitat, Parkes et al. did not find members of the ANME<br />
groups as well [45]. Here, the archaeal community was dominated by members of the<br />
Methanobacteriales and Methanosarcinales group, what was also found for the subsurface of<br />
site Neuharlingersieler Nacken [13].<br />
61
Publikation 3: Succession of sulfate-reducing Bacteria and methanogenic Archaea<br />
4.7. Ecological relevance and outlook<br />
Our results indicate that the methane production within sulfate depleted layers of the<br />
subsurface of tidal-flat sediments is mediated by methanogenic archaea. Even though elevated<br />
methane concentrations were determined in the water column above these sediments<br />
(Grunwald, personal communication), the methane profile suggest a consumptive process<br />
within the sediment. One explanation is microbial methane oxidation that controls the<br />
methane emission. Without this process, the concentration of this climatically active gas<br />
might be even higher. A detailed investigation of the methane flux and the cultivation of<br />
organisms that are involved in the methane cycle is currently performed in a project<br />
embedded in the research unit “BioGeoChemistry of Tidal Flats”.<br />
62
Publikation 3: Succession of sulfate-reducing Bacteria and methanogenic Archaea<br />
Acknowledgements<br />
We thank the Senckenberg Institute, Department for Marine Research, and especially the<br />
crew of the RV Senckenberg for their help to recover the sediment cores. We also thank Katja<br />
Ziegelmüller, Melanie Beck, and Y<strong>von</strong>ne Hilker for assistance in sequencing DGGE bands,<br />
analyzing sulfate-, and methane concentrations. This work is part of the research unit<br />
“BioGeoChemistry of Tidal Flats” funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).<br />
63
Publikation 3: Succession of sulfate-reducing Bacteria and methanogenic Archaea<br />
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theory. PNAS. 80, 1579-1583.<br />
[42] Crick, F.H. (1966) Codon-anticodon pairing: the wobble hypothesis. J. Mol. Biol. 19,<br />
548-55.<br />
[43] Jaspers, E. and Overmann, J. (2004) Ecological significance of microdiversity:<br />
Identical 16S rRNA gene sequences can be found in bacteria with highly divergent<br />
genomes and ecophysiologies. Appl. Environ. Microbiol. 70, 4831-4839.<br />
[44] D'Hondt, S., B. B. Jørgensen, D. J. Miller, A. Batzke, R. Blake, B. A. Cragg, H.<br />
Cypionka, G. R. Dickens, T. Ferdelman, K.-U. Hinrichs, N. G. Holm, R. Mitterer, A.<br />
67
Publikation 3: Succession of sulfate-reducing Bacteria and methanogenic Archaea<br />
Spivack, G. Wang, B. Bekins, B. Engelen, K. Ford, G. Gettemy, S. D. Rutherford, H.<br />
Sass, C. G. Skilbeck, I. W. Aiello, G. Guerin, C. H. House, F. Inagaki, P. Meister, T.<br />
Naehr, S. Niitsuma, R. J. Parkes, A. Schippers, D. C. Smith, A. Teske, J. Wiegel, C.<br />
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subseafloor sediments. Science 306:2216-2221.<br />
[45] Parkes, R.J., Webster, G., Cragg, B.A., Weightman, A.J., Newberry, C.J., Ferdelman,<br />
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prokaryotes stimulated at interfaces over geological time. Nature 436, 390-<br />
394.<br />
[46] Boetius, A., Ravenschlag, K., Schubert, C.J., Rickert, D., Widdel, F., Gieseke, A.,<br />
Amann, R., Jørgensen, B.B., Witte, U., and Pfannkuche, O. (2000) A marine microbial<br />
consortium apparently mediating anaerobic oxidation of methane. Nature 407, 623-<br />
626.<br />
[47] Orphan, V.J., House, C.H., Hinrichs, K.-U., McKeegan, K.D., and DeLong, E.F.<br />
(2002) Multiple archaeal groups mediate methane oxidation in anoxic cold seep<br />
sediments. PNAS. 99, 7663-7668.<br />
68
DISKUSSION<br />
3. Diskussion<br />
69
DISKUSSION<br />
3. Diskussion<br />
3.1 Detektion <strong>von</strong> „deep biosphere“ Bakterien im Wattenmeer<br />
Die molekularbiologischen Untersuchungen haben gezeigt, dass die Oberflächensedimente<br />
des Wattenmeeres <strong>von</strong> Proteobakterien dominiert werden. Ab 160 cm Tiefe werden diese<br />
Organismen <strong>von</strong> Vertretern der Chloroflexi als dominierende Bakterien abgelöst.<br />
Proteobakterien wurden schon in zahlreichen Arbeiten als die dominierenden Arten im<br />
marinen Milieu beschrieben (Gray & Herwig, 1996; Llobet-Brossa et al., 1998; Kim et al.,<br />
2004; Köpke et al., 2005; Stevens et al., 2005), wobei der Elektronendonator in diesen<br />
Habitaten nicht limitiert ist. Die molekularbiologisch untersuchten Wattsedimente ab 160 cm<br />
Tiefe sind seit mehreren hundert Jahren vergraben (Ziehe, 2005) und das organische Material<br />
ist sehr refraktär (Freese & Rullkötter, 2003). Somit unterscheidet sich die Verfügbarkeit des<br />
Elektronendonators in mehreren Metern Tiefe gravierend <strong>von</strong> den Oberflächensedimenten<br />
oder der Wassersäule und stellt demnach einen limitierenden Faktor für die mikrobiellen<br />
Gemeinschaften dar. Sämtliche in dieser Arbeit gefundenen Sequenzen, die der Gruppe der<br />
Chloroflexi zugeordnet wurden, fallen in die Untereinheit 2. Diese Untereinheit setzt sich<br />
hauptsächlich aus Sequenzen zusammen, die in der „deep biosphere“ gefunden wurden<br />
(Chandler et al., 1998; Coolen et al., 2002; Inagaki et al., 2003). In diesen Habitaten ist das<br />
für die Mikroorganismen verfügbare organische Material in geringen Konzentrationen<br />
vorhanden und ebenfalls refraktär (Coolen et al., 2002; Webster et al., 2004; Parkes et al.,<br />
2005). Der Elektronendonator beeinflusst somit entscheidend die bakteriellen Gemeinschaften<br />
im Watt wie auch in der „deep biosphere“. Sulfat oder andere Elektronenakzeptoren spielen<br />
dagegen für die Zusammensetzung der bakteriellen Gemeinschaften nur eine untergeordnete<br />
Rolle, da sich die Zusammensetzungen der bakteriellen Gemeinschaften unabhängig <strong>von</strong> z. B.<br />
den Sulfatkonzentrationen signifikant ändern.<br />
Aus der Dominanz der Chloroflexi ergibt sich zwangsläufig die Frage, welche genauen<br />
physiologischen Eigenschaften sie befähigen, die angesprochenen extremen Lebensräume zu<br />
dominieren. Da bis zum jetzigen Zeitpunkt nur wenige Isolate vorliegen und aus dem<br />
Wattenmeer gänzlich fehlen, ist es nicht möglich eine genaue Antwort auf diese Frage zu<br />
geben. Die gefundenen Chloroflexi scheinen aber unabhängig vom Sulfat zu sein, da sie<br />
sowohl die Sedimentschichten dominieren in denen Sulfat noch vorhanden ist, als auch in<br />
jenen wo Sulfat unterhalb der Detektionsgrenze liegt. Wahrscheinlich übt vielmehr das<br />
refraktäre organische Material einen starken Einfluss auf das Vorkommen der Chloroflexi aus,<br />
70
DISKUSSION<br />
da ihre Dominanz erst mit steigender Sedimenttiefe beginnt. Zudem zeigt ein Vergleich <strong>von</strong><br />
Isolaten der ersten drei Untereinheiten der Chloroflexi, dass sie während ihrer<br />
Stoffwechselprozesse entweder Wasserstoff produzieren oder benötigen. Das einzige<br />
bekannte Isolat der Untereinheit 1 Chloroflexi UNI-1 setzt Wasserstoff bei der Fermentation<br />
<strong>von</strong> Zuckern frei (Sekiguchi et al., 2001). Die anoxische Photosynthese betreibenden<br />
Chloroflexi der Untereinheit 3 (vormals GNSB) brauchen dagegen Wasserstoff als<br />
Elektronendonator (Madigan et al., 2003). Das einzige Isolat aus der Untereinheit 2<br />
Dehalococcoides ethenogenes 195 benötigt Wasserstoff bei der Degradation <strong>von</strong><br />
Tetrachlorethen, ein ebenfalls sehr refraktäres Substrat (Seshadri et al., 2005). Die<br />
molekularbiologisch gefundenen Sequenzen (die sich der Klasse der Chloroflexi zuordnen<br />
ließen) zeigen zu dem Isolat D. ethenogenes 195 die größte Ähnlichkeit, und lassen vermuten,<br />
dass die gefundenen Organismen ebenfalls fermentieren und dabei Wasserstoff freisetzen.<br />
Dieser könnte in sulfathaltigen Schichten Sulfatreduzierern und in sulfatfreien Zonen den<br />
methanogenen Archaeen als Elektronendonator dienen. Abschließend lässt sich die Frage der<br />
physiologischen Eigenschaften <strong>von</strong> Chloroflexi in tieferen Sedimentschichten des Watts nicht<br />
eindeutig klären, da ohne Isolate Substratteste und weitere physiologische Untersuchungen<br />
nicht möglich sind. Dennoch hat diese Studie gezeigt, dass in der „subsurface“ und in der<br />
„deep biosphere“ die Verfügbarkeit und Qualität des Elektronendonators dazu führt, dass sich<br />
die Bakteriengemeinschaften in ihren Zusammensetzungen habitatübergreifend ähneln.<br />
Wattsedimente stellen auf einer sehr kleinen Tiefenskala eine Art Obergrenze dar und eignen<br />
sich somit als Modellstandort zur Untersuchung der "Tiefen Biosphäre".<br />
3.2 Vertikale Abfolge <strong>von</strong> Sulfatreduzierern und Methanogenen<br />
Die mittels real-time PCR erhaltenen Werte für funktionelle (dsr und mcr) und 16S rRNA<br />
Gene zeigten erhöhte Kopieanzahlen an den Sulfat-Methan-Übergangszonen. In diesen Zonen<br />
sind Methan- und Sulfatkonzentrationen gegenläufig, wofür die anaerobe Oxidation des<br />
Methans eine Ursache sein könnte (Iversen & Jorgensen, 1985). Der signifikante Zuwachs an<br />
detektierten Prokaryoten in diesen Übergangszonen deutet zudem auf eine erhöhte<br />
mikrobielle Aktivität hin. Solch erhöhte Gesamtzellzahlen wurden auch für andere marine<br />
Habitate gezeigt und mit einer erhöhten mikrobiellen Aktivität in Verbindung gebracht<br />
(Thomsen et al., 2001; Coolen et al., 2002; Parkes et al., 2005).<br />
71
DISKUSSION<br />
Die in dieser Arbeit detektierten methanogenen Archaeen gehören hauptsächlich zur<br />
Ordnung der Methanosarcinales. Darunter waren allerdings keine Archaeen der ANME 2 und<br />
3 Cluster, die mit der anaeroben Oxidation <strong>von</strong> Methan in Verbindung gebracht werden<br />
(Boetius et al., 2000). Vertreter des ANME 1 Clusters wurden ebenfalls nicht detektiert. Es ist<br />
allerdings nicht auszuschließen, dass Organismen aus den ANME Clustern in tieferen<br />
Sedimentschichten des Watts vorhanden sind. Bei der Untersuchung des<br />
Oberflächensedimentes eines nahe gelegenen Sandwatts (Ishii et al., 2004) wurden zwar<br />
Zellen des ANME Clusters mittels FISH detektiert, aber nur in sehr geringer Anzahl (ein<br />
Konsortium pro 5 10 4 Zellen). Da sie somit weniger als ein Prozent der Gesamtanzahl an<br />
Archaeen ausmachen, wären sie in der vorliegenden Studie mit den universellen Archaeen-<br />
Primern nicht detektiert worden. Ihre Abundanz wäre unterhalb der Nachweisgrenze der<br />
PCR-DGGE Methode (Murray et al., 1996).<br />
Die molekularbiologisch detektierten Sulfatreduzierer konnten hauptsächlich der Gattung<br />
Desulfotomaculum zugeordnet werden. Diese Bakterien stehen ebenfalls nicht direkt im<br />
Zusammenhang mit AOM. Die <strong>von</strong> Boetius et al. postulierten sulfatreduzierenden Mitglieder<br />
der Konsortien, die sich aus den Gattungen Desulfoccocus und Desulfosarcina zusammen<br />
setzen (Boetius et al., 2000; Orphan et al., 2002), wurden weder in den Sulfat-Methan-<br />
Übergangszonen noch in den Bereichen dazwischen nachgewiesen. Dennoch wurden<br />
sulfatreduzierende Prokaryoten und auch methanogene Archaeen in allen Sedimentschichten<br />
detektiert. In anderen Habitaten der „deep biosphere“, wo wahrscheinlich AOM stattfindet,<br />
wurden ebenfalls keine ANME gefunden (Parkes et al., 2005). Somit muss eine AOM nicht<br />
unbedingt auf die postulierten Organismen beschränkt sein. Zudem sind Alternativen zu<br />
einem Konsortium denkbar, da ein Intermediat bis jetzt nicht eindeutig bestimmt wurde<br />
(Valentine & Reeburgh, 2000; Sørensen et al., 2001; Nauhaus et al., 2002). Auch wäre die<br />
Möglichkeit denkbar, dass ein einzelnes Archaeon alleine fähig wäre, beide Reaktionen<br />
durchzuführen.<br />
3.3 Detektion eines neues Clusters innerhalb der Euryarchaeota<br />
Der Einsatz eines Eukaryoten-spezifischen Primer-Paares in Wattenmeersedimenten (Diez<br />
et al., 2001) ermöglichte die Detektion des „Tidal flat cluster 1“. Es handelt sich dabei um ein<br />
neues Cluster innerhalb der Euryarchaeota (Abb. 3).<br />
72
DISKUSSION<br />
Euryarchaeota<br />
Thermoplasmatales<br />
Archaeoglobales<br />
TF1cluster<br />
360NF51E<br />
360NS49E<br />
360NS47E<br />
280NJ33E<br />
180NS20E 280NJ34E<br />
180NJ18E<br />
Methanosarcinales DHVE1<br />
ARC1<br />
Methanococcales<br />
Thermococcales<br />
Nanoarchaeota<br />
Crenarchaeota<br />
Methanomicrobiales<br />
ANME2<br />
Ricecluster1<br />
DHVE3<br />
Halobacteriales<br />
Methanobacteriales<br />
Bacteria Eukarya<br />
Korarchaeota<br />
AAG<br />
Abb. 3: Phylogenetische Einordnung des TF1-Clusters innerhalb der Euryarchaeota. Die<br />
erste Zahl gibt die Sedimenttiefe an, in der die Sequenzen detektiert wurde.<br />
Das TF1-Cluster wurde somit mit einer Primer-Kombination detektiert, die bis jetzt nicht in<br />
tieferen Sedimenten eingesetzt wurde und auch Archaeen nicht detektieren sollte. Die<br />
Detektion dieses Clusters ab einer Tiefe <strong>von</strong> 160 cm und die Verschiebung der dominierenden<br />
Bakterien zu den Chloroflexi auch unterhalb dieser Tiefe könnte ein Hinweis sein, dass der<br />
Elektronendonator ebenfalls eine wichtige Rolle bei diesen Archaeen spielt.<br />
Eine 100 %ig genaue phylogenetische Einordnung der gefundenen Sequenzen ist nicht<br />
möglich gewesen, da diese <strong>von</strong> DGGE Banden abgeleitet wurden, deren Fragmentlänge<br />
etwa 450 bp war. Die momentane Einordnung des Clusters in das Phylum der Euryarchaeota<br />
lässt die Vermutung zu, dass es sich ebenfalls um methanogene Archaeen handeln könnte, da<br />
der Großteil der Euryarchaeota und auch die nächsten Verwandten des TF1-Clusters<br />
methanogene Archaeen sind (Garcia et al., 2000). Die einzig molekularbiologische Detektion<br />
dieses neuen Clusters lässt aber keine weiteren physiologischen Vermutungen über die<br />
gefundenen Organismen zu. Ein ähnliches ungewöhnliches Ergebnis beim Einsatz <strong>von</strong><br />
Eukaryoten-spezifischen Primern ist auch <strong>von</strong> Schippers und Neretin beschrieben worden<br />
(Schippers & Neretin, 2006). Sie erhielten bei ihren Untersuchungen <strong>von</strong> Ozeansedimenten<br />
des Kontinentalrandes vor Peru zusätzlich zu PCR-Amplikons der erwarteten Länge kürzere,<br />
73
DISKUSSION<br />
aber nicht näher untersuchte PCR Fragmente. Dieser Sachverhalt wurde als eine Degradation<br />
der DNA interpretiert. Die in der vorliegenden Arbeit erhaltenen Amplifikate zeigten für das<br />
TF1-Cluster eine um 50 bp kürzere weitere Bande in den Agarosegelen, die sich als<br />
Sequenzen des TF1-Clusters erwiesen.<br />
Die molekularbiologischen Untersuchungen werfen aber auch die Frage auf, ob die<br />
molekularbiologische Analyse der funktionellen Gene (dsr und auch mcr) in der Lage waren,<br />
mit zunehmender Tiefe die funktionellen Gene noch adäquat zu detektieren. Mutationen<br />
innerhalb der Primer-Bindungsstellen der untersuchten Gene könnten eine Amplifikation<br />
verhindert haben. Damit würde eine deutliche Unterschätzung der erhaltenen Kopiezahlen für<br />
dsr und mcr mit einher gehen. Das es zu Anpassungen an das Habitat und Mutationen sogar<br />
auf Genomebene kommen kann, wurde schon mittels DNA-DNA Hybridisierung für<br />
Bakterien aus einem Frischwasser-Habitat gezeigt, wo mehrere Isolate eine hohe Homologie<br />
des 16S rRNA Gens aufzeigen, aber eine große Diversität bei der Hybridisierung zeigten<br />
(Jaspers & Overmann, 2004). Somit kann es mit zunehmender Tiefe im Watt zu einer<br />
Anpassung auf genomischer Ebene gekommen sein, was auch das Fehlen <strong>von</strong> erhöhten<br />
Kopieanzahlen in der untersten Sulfat-Methan-Übergangszone erklären könnte.<br />
3.4 Ausblick<br />
Um diese Arbeit weiterzuführen, sollte das für die Prokaryoten verfügbare organische<br />
Material näher untersucht werden. Über diesen Erkenntnisgewinn könnten Vermutungen über<br />
die Stoffwechselaktivitäten und eventuell auch Bilanzierungen getroffen werden. Da es sich<br />
beim organischen Material um refraktäres Material handelt, wird es hauptsächlich <strong>von</strong><br />
fermentativ lebenden Organismen verwertet. Mittels einer detaillierten Bestimmung der<br />
vorhanden C-Quellen könnten somit die dominierenden Stoffwechselwege der Gärer<br />
postuliert werden, was eventuell ein Primer-design für die so eingegrenzten Bakterienarten<br />
ermöglichen könnte. Sich mittels molekularbiologischer Methoden einen Überblick über diese<br />
nicht unbedeutende Gruppe <strong>von</strong> Mikroorganismen zu verschaffen (Schink, 2002), könnte<br />
weitere Rückschlüsse über die „subsurface“ <strong>von</strong> Wattensedimenten liefern. Da eine<br />
Kultivierung dieser Organismen problematisch zu sein scheint (Köpke et al., 2005), würde<br />
eine molekularbiologische Untersuchung hier ein adäquates Mittel sein, diese Gruppe näher<br />
zu untersuchen. Dennoch wird eine Detektion mittels DGGE oder anderen<br />
molekularbiologischen Methoden ebenfalls schwierig sein (Nachweisgrenze 1 %, [Murray et<br />
74
DISKUSSION<br />
al., 1996]), da eine hohe Diversität vermutet wird und somit nur eine geringe Anzahl an<br />
Organismen einer Art vorhanden sein werden. Dennoch könnten diese Untersuchungen<br />
wichtige Erkenntnisse im Stoffkreislauf der „subsurface“ des Wattenmeeres liefern.<br />
Des weiteren sollte versucht werden, Vertreter der Chloroflexi zu isolieren, um mehr<br />
Informationen über die physiologischen Eigenschaften dieses abundanten Vertreters zu<br />
erhalten. Der mögliche Zusammenhang dieser Organismen als potentielle Produzenten <strong>von</strong><br />
Wasserstoff könnte einen entscheidenden Einfluss auf das Wachstum <strong>von</strong> Sulfatreduzierern<br />
und auch Methanogenen haben. Eine Quantifizierung der Chloroflexi mittels real-time PCR<br />
würde eine Bilanzierung ermöglichen, die dann im Zusammenhang mit Sulfatreduktionsraten<br />
und Methanbildungsraten ein umfangreicheres Bild des Habitates liefern könnte.<br />
Ein weiterer Punkt wäre die Untersuchung des neu detektierten TF1-Clusters. Neben dem<br />
Versuch einer Isolierung wäre die Entwicklung <strong>von</strong> spezifischen Primern über die momentan<br />
vorhanden Sequenzen möglich. Dadurch wären genauere phylogenetische Einordnungen<br />
möglich. Zudem könnten diese Stammbaumberechnungen Aussagen über ihre evolutionäre<br />
Einordnung liefern, da sie eventuell größere Gemeinsamkeiten auf der 16S rRNA Gen-Ebene<br />
mit Eukaryoten aufweisen als andere Archaeen. Eine mögliche Detektion <strong>von</strong> weiteren TF1-<br />
Sequenzen durch den Einsatz <strong>von</strong> spezifischen Primern in anderen Habitaten der „deep<br />
biosphere“ könnte dagegen den Sachverhalt untermauern, dass das Watt die Obergrenze<br />
dieser Habitate darstellt und sich als Modellstandort zur Untersuchung der „Tiefen Biosphäre“<br />
eignet.<br />
3.5 Literatur<br />
Boetius, A., Ravenschlag, K., Schubert, C.J., Rickert, D., Widdel, F., Gieseke, A. et al. (2000)<br />
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37-50.<br />
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75
DISKUSSION<br />
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gradient gel electrophoresis (DGGE) to study the diversity of marine picoeukaryotic<br />
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Environ. Microbiol. 67: 2942-2951.<br />
Freese, E., and Rullkötter, J. (2003) Characterisation of organic matter in sediments from the<br />
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Garcia, J.-L., Patel, B.K.C., and Ollivier, B. (2000) Taxonomic, phylogenetic, and ecological<br />
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Gray, J.P., and Herwig, R.P. (1996) Phylogenetic analysis of the bacterial communities in<br />
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16S rRNA gene sequences can be found in bacteria with highly divergent genomes<br />
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Kim, B.-S., Oh, H.-M., Kang, H., Park, S.-S., and Chun, J. (2004) Remarkable bacterial<br />
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Köpke, B., <strong>Wilms</strong>, R., Engelen, B., Cypionka, H., and Sass, H. (2005) Microbial diversity in<br />
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Llobet-Brossa, E., Rossello-Mora, R., and Amann, R. (1998) Microbial community<br />
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Madigan, M.T., Martinko, J.M., and Parker, J. (2003) Brock. Biology of Microorganisms.<br />
Pearson Education, Inc. Upper Saddle River, NJ 07458 10th ed.<br />
76
DISKUSSION<br />
Murray, A.E., Hollibaugh, J.T., and Orrego, C. (1996) Phylogenetic compositions of<br />
bacterioplankton from two California estuaries compared by denaturing gradient gel<br />
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anaerobic oxidation of methane coupled to sulphate reduction in sediment from a<br />
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Orphan, V.J., House, C.H., Hinrichs, K.-U., McKeegan, K.D., and DeLong, E.F. (2002)<br />
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et al. (2005) Deep sub-seafloor prokaryotes stimulated at interfaces over geological<br />
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Schink, B. (2002) Synergistic interactions in the microbial world. Antonie van Leeuwenhoek<br />
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Schippers, A., and Neretin, L.N. (2006) Quantification of microbial communities in nearsurface<br />
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Sekiguchi, Y., Takahashi, H., Kamagata, Y., Ohashi, A., and Harada, H. (2001) In situ<br />
detection, isolation, and physiological properties of a thin filamentous microorganism<br />
abundant in methanogenic granular sludges: A novel isolate affiliated with a clone<br />
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Seshadri, R., Adrian, L., Fouts, D.E., Eisen, J.A., Phillippy, A.M., Methe, B.A. et al. (2005)<br />
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Sørensen, K.B., Finster, K., and Ramsing, N.B. (2001) Thermodynamic and kinetic<br />
requirements in anaerobic methane oxidizing consortia exclude hydrogen, acetate, and<br />
methanol as possible electron shuttles. Microbial Ecol. 42: 1-10.<br />
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77
DISKUSSION<br />
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Ziehe, D. (2005) Datierung <strong>von</strong> biogenen Carbonaten mit Aminosäurenantiomerenverhältnissen.<br />
Diplomarbeit an der Carl <strong>von</strong> Ossietzky Universität Oldenburg,<br />
Fakultät V.<br />
78
DANKSAGUNG<br />
Danksagung<br />
Ich möchte mich herzlichst bei <strong>Herrn</strong> Prof. Dr. Heribert Cypionka für die Bereitstellung und<br />
der Möglichkeit zur Bearbeitung des äußerst interessanten Themas und auch für das<br />
entgegengebrachte Vertrauen und die dargebrachte Unterstützung bedanken. Bei <strong>Herrn</strong> Prof.<br />
Dr. Ralf Rabus bedanke ich mich für die Übernahme der Zweitgutachtertätigkeit. Auch <strong>Herrn</strong><br />
Prof. Dr. Meinhard Simon danke ich für seine Tätigkeit im Prüfungskomitee.<br />
Mein ganz besonderer Dank gilt <strong>Herrn</strong> Dr. Bert Engelen für die umfangreiche Einführung in<br />
die Techniken der Molekularbiologie und für die aufgebrachte Zeit um das Beste aus den<br />
Ergebnissen herauszuholen und damit äußerst gute Publikationen zu verfassen. Bert, Danke<br />
für alles!<br />
Außerdem danke ich <strong>Herrn</strong> Dr. Henrik Sass für die umfangreichen Einblicke in die „Welt der<br />
Bakterien“ und hier nicht nur in die „Welt der Kultivierung“, sondern auch in die „Welt der<br />
Physiologie“. Zudem danke ich ihm für seinen Einsatz bei der Erstellung der Publikationen<br />
und auch dem Geraderücken <strong>von</strong> Interpretationen einiger Ergebnisse.<br />
Für die Hilfe und den Einsatz bei den Probenahmen danke ich den Mitarbeitern vom<br />
Senckenberg Institut, des Terramare Wilhelmshaven und der Besatzung des Forschungskutter<br />
„Senkenberg“ undenkbar waren, danke ich auch der Crew der FK „Senckenberg“. Hierbei<br />
besonders Alexander Bartholomae, Tae Soo Chang, Elke Tilch und Helmo Nicolai für die<br />
geologischen Ratschläge und logistischen und menschlichen Unterstützungen bei den<br />
diversen Probenahmen.<br />
Vielen Dank an alle Arbeitsgruppen des <strong>ICBM</strong>s und dessen Mitarbeitern für die vielseitigen<br />
Hilfestellungen und Gespräche während die letzten Jahre. Besonderen Dank sei natürlich den<br />
Leuten der Arbeitsgruppen „Cypionka“ und auch „Simon“ ausgesprochen, die bei<br />
Diskussionen der Ergebnisse mit Rat und Tat täglich zur Verfügung standen. Besonders<br />
hervor heben möchte ich dabei: Beate Köpke für die gemeinsame Zeit, die wir an einem<br />
schönen Projekt verbracht haben und für die guten Diskussionen und vielen Anregungen.<br />
Willm Martens-Habbena für Hilfestellungen wo immer Probleme auftraten. Andrea<br />
Schlingloff für das Überlassen ihres Wissen bei der Sequenzierung. Jacqueline Süß für das<br />
ständige Verbessern der real-time Technik. Melanie Beck, Thorsten Brinkhoff, Y<strong>von</strong>ne
DANKSAGUNG<br />
Hilker, Martin Könneke, Jürgen Köster und Falko Mathes für die Einführungen in neue<br />
Techniken, für fruchtbare Diskussionen und Hilfestellungen bei Problemen. Und auch allen<br />
weiteren nicht namentlich Erwähnten und doch nicht Vergessenen, die während der letzten<br />
Jahre kamen und gingen und immer für eine positive Stimmung im Labor und Institut sorgten.<br />
Dann möchte ich meiner Freundin Sandra Heckelmann für die ununterbrochene und liebe<br />
Unterstützung während der letzten Monate danken. Meinem Sohn Jonas danke ich für das<br />
freundliche Lächeln, mit dem ich jeden Abend begrüßt werde. Und nicht zuletzt sei auch<br />
meinen Eltern aufs herzlichste gedankt, auf deren Unterstützung ich mich immer verlassen<br />
konnte und kann und die mir damit die Möglichkeit gaben diese Arbeit durchzuführen und<br />
fertig zu stellen.<br />
Der Deutschen Forschungsgemeinschaft gilt mein Dank für die finanzielle Unterstützung,<br />
ohne die dieses Projekt ebenfalls nicht zustande gekommen wäre.<br />
Abschließend möchte ich mich noch bei allen bedanken, die bisher nicht namentlich erwähnt<br />
wurden und die auf die eine oder andere Weise zur Fertigstellung dieser Arbeit beigetragen<br />
haben.
LEBENSLAUF<br />
LEBENSLAUF<br />
ANGABEN ZUR PERSON<br />
Name:<br />
WILMS, Manfred <strong>Reinhard</strong> Werner Hartmud<br />
Adresse:<br />
Zur Kalkkaute 21, 35041 Marburg<br />
Staatsangehörigkeit: Deutsch<br />
Geburtsdatum: 24. 03. 1972<br />
Geburtsort: Wilhelmshaven<br />
SCHUL- UND BERUFSBILDUNG<br />
Ab 04.2006<br />
Angestellt bei Novartis Vaccines and Diagnostics GmbH & Co. KG<br />
09. 2001- 11. 2006 Promotion am Institut für Chemie und Biologie des Meeres (<strong>ICBM</strong>) der<br />
Carl <strong>von</strong> Ossietzky Universität Oldenburg in der Arbeitsgruppe<br />
Paläomikrobiologie bei Prof. Dr. HERIBERT CYPIONKA. Titel der<br />
Dissertation: „Molekularbiologische Erfassung und Charakterisierung<br />
der mikrobiellen Gemeinschaften im Rückseitenwatt der Insel<br />
Spiekeroog“.<br />
10. 1995 - 08. 2001 Studium der Biologie an der Carl <strong>von</strong> Ossietzky Universität Oldenburg<br />
Studienschwerpunkte: Mikrobiologie, Genetik, Biochemie<br />
09. 1997 Vordiplom<br />
08. 2001 Diplom<br />
Thema der Diplomarbeit bei H. Doz. Dr. LUISE BERTHE-CORTI:<br />
„Versuche zum Nachweis und zur Isolierung <strong>von</strong> Alkan-<br />
Monooxygenasen in Fundibacter jadensis.“<br />
10. 1995 - 09. 1996 Studium der Mathematik an der Carl <strong>von</strong> Ossietzky Universität<br />
Oldenburg<br />
10. 1994 - 09. 1995 Studium der Interkulturellen Pädagogik an der Carl <strong>von</strong> Ossietzky<br />
Universität Oldenburg<br />
11. 1992 - 01. 1994 Zivildienst bei der Gesellschaft für Paritätische Sozialarbeit mbH, in<br />
Wilhelmshaven<br />
08. 1984 - 06. 1992 Mariengymnasium, Jever<br />
Erworbene Qualifikation: Abitur
Erklärung<br />
Hiermit bestätige ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig verfasst und nur die<br />
angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe.<br />
Marburg, den 25. August 2006