Aufbau eines 60-Kanal Aufnahme - Fachbereich Physik der ...

Aufbau eines 60-Kanal Aufnahme- und 

Stimulationssystems 

zur Untersuchung neuronaler Aktivität 

Diplomarbeit 

im Fach 

Angewandte Physik 

Universität Kaiserslautern 

Fachbereich Physik 

Patrick Hellwig 

Erstprüfer: 

Zweitprüfer: 

Prof. Dr. C. Ziegler 

Juniorprof. Dr. A. Blau 

Angefertigt in der Zeit vom 15. Januar 2002 bis 24. Dezember 2002 

Kaiserslautern, Dezember 2002

Inhaltsverzeichnis 

1 Einleitung 1 

I Literatur- und Theorieteil 3 

2 Literatur- und Theorieteil 4 

2.1 Biologische Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 

2.1.1 Ruhe- und Aktionspotentiale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 

2.1.2 Die Nervenzelle (Das Neuron) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 

2.1.3 Reizweiterleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 

2.1.4 Künstliche Reizung des Neurons . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 

2.2 Elektronische Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 

2.2.1 Einleitung und Motivation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 

2.2.2 Anforderungen an die Elektronik . . . . . . . . . . . . . . . . 8 

2.2.3 Operationsverstärker . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 

2.2.4 Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 

2.2.4.1 Verstärkungsfaktor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 

2.2.4.2 Differenzverstärkung eines Operationsverstärkers (open 

loop gain) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 

2.2.4.3 Rückkopplung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 

2.2.4.4 Offset . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 

2.2.4.5 Bandbreite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 

2.2.4.6 Stabilitätskriterien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 

2.2.4.7 Eingangsruhestrom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 

2.2.4.8 Eingangswiderstand . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 

2.2.4.9 Anstiegsgeschwindigkeit (slew rate) . . . . . . . . . . 14 

2.2.5 Zusammenfassung Verstärkerbaustein-Kriterien . . . . . . . . 14 

2.2.6 Filter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 

2.3 Elektroden zur Aufnahme von Zellsignalen . . . . . . . . . . . . . . . 16 

2.3.1 Einzelne Ableitungs- und Stimulationselektroden . . . . . . . 16 

2.3.2 patch-clamp Technik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 

2.3.3 Mikroelektrodenfelder . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 

2.3.4 CMOS Neurochips . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 

2.3.5 Optische Aufnahmemethoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 

2.4 Aufnahmesysteme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21


ii 

2.4.1 MEA basierte Systeme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 

2.4.1.1 Multichannelsystems . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 

2.4.1.2 Panasonic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 

2.4.1.3 Plexon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 

2.4.1.4 Nippon Telegraph & Telephone (NT&T) . . . . . . . 22 

2.4.2 CMOS basierte Systeme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 

2.4.2.1 Andreas Offenhäusser . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 

2.4.2.2 INPRO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 

2.5 Experimente und Anwendungen zellbasierter Systeme . . . . . . . . . 23 

2.5.1 Dissoziierte Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 

2.5.1.1 Modelle der Wirklichkeit . . . . . . . . . . . . . . . . 23 

2.5.1.2 Lernen und Gedächtnis . . . . . . . . . . . . . . . . 23 

2.5.1.3 Neuronaler Code . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 

2.5.1.4 Datenverarbeitung - Parallel Processing und Data 

Mining . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 

2.5.1.5 Neuro-Interfaces . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 

2.5.1.6 Biosensoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 

2.5.2 Gehirnschnitte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 

II Materialien und Methoden 26 

3 Materialien und Methoden 27 

3.1 Messaufbau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 

3.1.1 Aufnahmeelektronik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 

3.1.1.1 Verstärkereinheit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 

3.1.1.2 Filtereinheit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 

3.1.1.3 Analog-Digital-Wandlung . . . . . . . . . . . . . . . 30 

3.1.2 Stimulationselektronik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 

3.1.3 Charakterisierung der Elektronik . . . . . . . . . . . . . . . . 33 

3.1.3.1 Transferfunktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 

3.1.3.2 Rauschen und Zeitcharakteristiken . . . . . . . . . . 33 

3.1.4 Peripherie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 

3.1.4.1 Gehäuse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 

3.1.4.2 Mechanoelektrische Kopplung . . . . . . . . . . . . . 34 

3.1.4.3 Heizung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 

3.1.4.4 Flusskammer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 

3.1.5 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 

3.2 Zellkulturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 

3.2.1 Chemikalien und Medien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 

3.2.1.1 Medien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 

3.2.1.2 Antibiotika . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 

3.2.2 Präparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 

3.2.2.1 Dissoziierte Neuronen . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 

3.2.2.2 Herzmuskelzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39


iii 

3.3 Sonstiges . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 

3.3.1 Herstellung der Platinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 

III Experimentelle Durchführung 40 

4 Durchführung, Experimente und Ergebnisse 41 

4.1 Messaufbau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 

4.1.1 Aufnahme- und Stimulationselektronik . . . . . . . . . . . . . 41 

4.1.2 Filtereinheit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 

4.1.2.1 Gehäuse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 

4.1.3 Charakterisierung der Elektronik . . . . . . . . . . . . . . . . 44 

4.1.3.1 Verstärkungsfaktor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 

4.1.3.2 Übersprechen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 

4.1.3.3 Rauschen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 

4.1.3.4 Schaltverhalten der Stimulationselektronik . . . . . . 49 

4.1.3.5 Leitgummis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 

4.1.4 Peripherie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 

4.1.4.1 Heizung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 

4.1.4.2 Flusskammer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 

4.1.5 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 

4.1.5.1 Aufnahme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 

4.1.5.2 Stimulationssoftware . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 

4.2 Zellaktivität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 

4.3 Vergleich mit MCS-System . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 

IV Zusammenfassung und Ausblick 61 

5 Zusammenfassung und Ausblick 62 

5.1 Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 

5.2 Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 

V Anhang 66 

6 Anhang 67 

6.1 Elektronik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 

6.1.1 Matrix-Schalter zur Kanalauswahl . . . . . . . . . . . . . . . . 67 

6.1.2 Platinenlayouts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 

Literaturverzeichnis 78 

Danksagung 84

Abbildungsverzeichnis 

2.1 Änderung des Membranpotentials als Funktion der Leitfähigkeit der 

Zellmembran für Natrium(g Na )- und Kaliumionen(g K ) und daraus resultierendes 

Aktionspotential (Erklärung im Text). Abbildung: [Silbernagl 

und Despopoulos, 4.Auflage, 1991] . . . . . . . . . . . . . . . 5 

2.2 Aktionspotentiale von Nervenzellen, quergestreifter Muskulatur und 

Herzmuskelzellen unterscheiden sich in ihrem Aussehen. Abbildung 

angelehnt an: [Silbernagl und Despopoulos, 4.Auflage, 1991] . . . . . 6 

2.3 Neuron und Synapse. Abbildung: [Silbernagl und Despopoulos, 4.Auflage, 

1991] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 

2.4 Synapse, synaptischer Spalt und synaptische Signalübertragung. Abbildung: 

[Silbernagl und Despopoulos, 4.Auflage, 1991] . . . . . . . . 7 

2.5 Schaltsymbol des Operationsverstärkers. Zwischen den beiden Eingängen 

( ” 

+“ und ” 

-“) liegt die Differenzspannung U D an. U P und U N 

sind die Spannungen zwischen der Referenz und den beiden Eingängen. 

Der Operationsverstärker gibt die verstärkte Spannung U a aus. 

Abbildung: [Tieze und Schenk, 1989] . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 

2.6 Rückkopplungsverstärkung beim a) invertierenden und b) nicht-invertierenden 

Verstärker. Abbildung: [Tieze und Schenk, 1989] . . . . . 11 

2.7 Typischer Frequenzgang der Differenzverstärkung ohne Gegenkopplung. 

Abbildung: [Tieze und Schenk, 1989] . . . . . . . . . . . . . . . 12 

2.8 Erhöhung der Bandbreite durch Gegenkopplung. Abbildung: [Tieze 

und Schenk, 1989] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 

2.9 Tiefpassfilter erster und zweiter Ordnung. Der Widerstand R 1 lässt 

alle Frequenzen passieren. Über die Kapazität werden die hochfrequenten 

Anteile über die Masse vermindert. . . . . . . . . . . . . . . 15 

2.10 Hochpassfilter erster und zweiter Ordnung. Die Kapazität lässt nur 

hohe Frequenzen passieren. Über den Widerstand können eventuelle 

Gleichstromanteile zwischen der Kapazität und dem Verstärker abfließen. 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 

2.11 Schematische Darstellung der prinzipiellen Möglichkeiten der Signalerfassung 

an (Nerven-) Zellen und der zu erwartenden Signaltypen. 

Abbildung: [Blau, 1995] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 

2.12 Ein 60-Elektroden Mikroelektrodenarray (MEA). Abbildung: MCS . . 18


v 

2.13 Bildlicher Vergleich von planarem Elektrodentyp (links) und 3D-Fakir 

Elektrodentyp (rechts). Die planaren Elektroden werden für dissoziierte 

Zellkuluren und die 3D-Elektroden für Gehirnschnitte eingesetzt. 

Abbildung: Marc Heuschkel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 

2.14 60-Kanalverstärker von Multichannelsystems. . . . . . . . . . . . . . 21 

3.1 Schematische Darstellung des Messaufbaus (Erklärung im Text) . . . 27 

3.2 Schematische Darstellung eines Verstärkerkanals. Das Eingangssignal 

(IN) wird mittels eines Instrumentenverstärkers (InstAmp IC2) 10- 

fach verstärkt und dem ersten Operationsverstärker (OpAmp IC1A) 

zugeführt, der mittels Rückkopplung der beiden Widerstände R1 und 

R2 das Signal wiederum 10-fach verstärkt. Der zweite Operationsverstärker 

(IC1B) führt das Signal durch die Rückkopplung (Widerstände 

R3 und R4) mittels 10-facher Verstärkung zur 1000-fachen 

Endverstärkung am Ausgang (OUT). . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 

3.3 Schematische Darstellung eines Filterkanals. Das Eingangssignal (IN) 

durchläuft die Tiefpass-Filterstufe (IC1B) auf der linken Seite, gelangt 

zur Hochpass-Filterstufe (IC2B) auf der rechten Seite und wird am 

Ausgang (OUT) als gefiltertes Signal ausgegeben. . . . . . . . . . . . 30 

3.4 Berechneter Verlauf eines Butterworth-Tiefpass-Filters zweiter Stufe 

mit einer Grenzfrequenz von 10 kHz und eines nachgeschalteten 

Butterworth-Hochpass-Filters zweiter Stufe mit einer Grenzfrequenz 

von 100 Hz. Die Berechnungen wurden mit ” 

Filter Free” von Nuhertz 

Technologies durchgeführt. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 

3.5 Programmierung des ADG715 über den seriellen I 2 C-Bus. Nach der 

Start-Bedingung wird eine für einen Schalterbaustein spezifische Identifikationsadresse 

übertragen, der ein Datenbyte folgt. Jeder Baustein 

beinhaltet 8 Schalter. Jedes Bit des Datenbytes repräsentiert einen 

Schalter. Sobald die Stop-Bedingung nach dem Datenbyte übertragen 

ist, schaltet der Baustein die soeben übertragene Schalterkonfiguration. 32 

3.6 Schematischer Aufbau zur Messung der Transferfunktion einer Elektronik 

mit einem Netzwerkanalysator. Erklärung im Text. . . . . . . . 33 

3.7 Schematische Darstellung der Peripherie (Erklärung im Text) . . . . . 35 

3.8 Ein Leitgummi besteht aus abwechselnd leitenden (schwarze Bereiche) 

und nicht-leitenden Bereichen (weisse Bereiche). . . . . . . . . . 36 

3.9 Schematische Schaltung der Heizungssteuerung. Die beiden Potentiometer 

arbeiten als Spannungsteiler. Daher sind keine Angaben über 

Widerstände nötig. In dieser Arbeit wurden Potentiometer von 0 bis 

100 Ω verwendet. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 

4.1 Fotos der Verstärkereinheiten. A) Erste Verstärkerstufe. B) Ein Modul 

der zweiten und dritten Verstärkungsstufe. C) Zusammengebaute 

Verstärkerplatine. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41


vi 

4.2 Links: Ein Stimulationsmodul ist auf die Basisplatine gesteckt. Rechts: 

Foto der 16-Kanal Entkopplungsschalterplatine. In der Mitte befinden 

sich die beiden 8-Kanal-Schalterbausteine vom Typ AFDG715. 

Die beiden 16-poligen Buchsenleisten sind die Ein- und Ausgänge. Die 

beiden 2-poligen Buchsenleisten dienen der Spannungsversorgung und 

als Steuerleitungen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 

4.3 Die Aufnahme- und Stimulationselektronik sind in einem Metallgehäuse 

zusammengefasst. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 

4.4 16 Kanal Filtermodul. Die Buchsenleiste links oben ist der Signaleingang. 

Es folgen oben zwei Steckmodule, die für die Eigenschaften des 

Tiefpass-Filters zuständig sind. Unten befindet sich das Steckmodul 

für die Eigenschaften des Hochpass-Filters. Der Ausgang ist die oben 

rechts schräg stehende Buchsenleiste. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 

4.5 Die 64 Filterkanäle befinden sich in einem 19” Einschubgehäuse. Der 

Ein- und Ausgang wird durch ein SCSI-Kabel verbunden. . . . . . . . 43 

4.6 Links: Die Alu-Basisplatte, in die das MEA eingelegt wird, enthält 

auch die Heizung und den Temperatursensor. Rechts: Die schwarzen 

Leitgummis sind quadratisch angeordnet und werden auf das MEA 

gelegt, so dass sie genau auf den Elektrodenflächen liegen. . . . . . . 44 

4.7 Beispiel eines nichtlinearen Sinus-Kurvenfits des Ein- und Ausgangssignals 

eines Verstärkerkanals. Der Fit wurde mit Origin 7.0 Professional 

der Firma OriginLab durchgeführt. . . . . . . . . . . . . . . . . 45 

4.8 Verstärkungsfaktoren der 64 Kanäle des Verstärkers. . . . . . . . . . . 46 

4.9 Transferfunktionen der Filtereinheit im 19”-Gehäuse. Gezeigt sind jeweils 

die Mittelwerte über die 16 Kanäle der vier Filtermodule. . . . . 46 

4.10 Untersuchung der Frequenzparameter des Netzwerkanalysators. Frequenzen 

unter 10 Hz sind wegen der Netzwerkanalysator-Filtereinstellung 

nicht messbar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 

4.11 Untersuchung des Übersprechens eines Kanals gegenüber den anderen. 

Auf Kanal 13 wurde eine Sinusförmige Wellenform gelegt. . . . . 48 

4.12 Untersuchung des Rauschens des Verstärkersystems. Links: Masseleitung 

und Elektrode sind direkt verbunden. Rechts: In das Messgerät 

wurde ein MEA mit Medium eingelegt. Das Medium wurde mit Masse 

über eine in das Bad getauchte Elektrode kontaktiert. . . . . . . . . . 49 

4.13 Stimulationsartefakte entstehen durch die Aufladung von Kondensatoren 

in der Verstärkerschaltung. Der Artefakt beeinträchtigt die 

Messung nach der Stimulation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 

4.14 Aufbau zur Messung der Impedanz eines Leitgummis: Das Leitgummi 

ist zwischen zwei Kupferplatten befestigt. Mit einem Netzwerkanalysator 

kann dann die Frequenzabhängigkeit des Leitgummis bestimmt 

werden. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 

4.15 Gemessene Transferfunktion des Leitgummis aus einer Mischung aus 

Silikon / Graphit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 

4.16 Links: Die Heizspirale beherbergt einen Temperatursensor in der 

Mitte. Rechts: Fertiges 19” Temperatursteuermodul. . . . . . . . . . 52


vii 

4.17 Links: Flusskammer aus PDMS. Zu sehen ist der Durchflusskanal 

in der Mitte. Rechts und links sind Zu- und Ableitung für Medium 

und Neuropharmaka. Die verwendeten Luer-Klemmen sind im Originalzustand 

und für das Experiment zurechtgeschnitten dargestellt. 

Rechts: Mittels zweier Spritzen, die miteinander verklebt sind, kann 

gleichzeitig exakt die gleiche Menge Medium aus der Flusskammer 

gesaugt werden, wie in sie hereingepumpt wird. Dadurch verringern 

sich die auftretenden Druckdifferenzen. . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 

4.18 Die Software NeuroNI Feeding Assistant”kontrolliert den Zufluss von 

” 

Medium über ein 8-Wege-Ventil, das per seriellem Port des Computers 

gesteuert wird. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 

4.19 Aufnahmesoftware . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 

4.20 Stimulationssoftware: Berechnete Kurven . . . . . . . . . . . . . . . . 55 

4.21 Stimulationssoftware: WAV-Abspielung . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 

4.22 Stimulationssoftware: 2D-Muster . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 

4.23 Elektrode mit Zellteppich. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 

4.24 Fragliches Zellsignal. Bei einer Messung mit Stimulation zeigte sich 

dieses Signal. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 

4.25 Vergleich des gemessenen Signals mit einem Zellsignal einer Mäusekultur 

(aufgenommen mit MCS-Verstärker von Paolo Bonifazi, SISSA- 

Institut in Triest, Italien) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 

5.1 Befestigung des MEAs auf einem pin-grid-array-Sockel (PGA). . . . . 64 

6.1 Programmiersequenz des AD75019 Bausteins. Erklärung siehe Text. 

Abbildung aus Datenblatt AD75019, Analog Devices . . . . . . . . . 67

1 Einleitung 

Neurons are the fundamental units, 

” 

or building blocks, of the brain. 

Our task is to learn the meaning 

behind their signaling.“ 

John G. Nicholls, From Neuron to Brain 

Eines der Ziele der Biowissenschaften war es schon immer gewesen, das Geheimnis 

des Lebens zu lüften. Je detaillierter sich der menschliche Körper untersuchen 

ließ, um so differenzierter wurde die Interpretation der Vorgänge, die das Phänomen 

Leben“ steuern. Besondere Aufmerksamkeit galt schon sehr früh der Suche nach 

” 

der Quelle der Kreativität und Individualität der Menschen, die im Gehirn vermutet 

und lokalisiert wurde. Allerdings ist die Funktionsweise des Gehirns bis heute 

nur teilweise verstanden. Es besteht aus einer unvorstellbar hohen Zahl an Gehirnzellen 

(ca. 10 14 ), den sog. Neuronen, die über jeweils Tausende von Verknüpfungen 

miteinander kommunizieren können. 

Ein möglicher Schritt zum Verständnis des Gehirns ist es, den Zellen gezielt Fragen“ 

stellen zu können und die Antwort“ der Neuronen aufzunehmen. Hodgkin 

” 

” 

lokalisierte 1952 mit Hilfe von invasiven Zelluntersuchungen mit Glaselektroden den 

Ursprung der elektrischen Aktivität durch Ionenkanäle in der Zellmembran [Hodgkin 

und Huxley, 1952]. Diese konnten durch die Einführung der Patch-Clamp Technik 

durch [Neher und Sakmann, 1976] und [Hamill u.a., 1981] genau untersucht werden. 

Ein Problem dieser Technik ist es, dass beim Einsatz der Glaselektroden die Zellen 

auf lange Sicht zerstört werden. Diesen Nachteil konnten [Gross u.a., 1977], [Pickard, 

1979] und [Gross u.a., 1995] mittels Metallelektroden umgehen, die eine extrazelluläre 

kapazitive Signalaufnahme erlaubten. Diese in Dünnschichttechnologie hergestellten 

Elektroden werden Multi-Elektroden-Arrays“ (MEAs) oder auch Multi- 

” 

Mikroelektroden-Platten (MMEPs) genannt. Dem Gehirn entnommene Neuronen 

können in vitro 1 auf solchen Mikroelektrodenfeldern kultiviert werden [Hämmerle 

u.a., 1994], [Nisch u.a., 1994]. In der Regel bilden sie untereinander Verbindungen 

aus und verschalten sich zu einem neuronalen Netz, das neuronalen Verknüpfungsmustern 

im Gehirn ähneln könnte [Habets u.a., 1987], [Corner und Ramakers, 1991], 

[Gross u.a., 1993]. Über die Elektroden lassen sich einerseits die elektrischen Signale 

der Neurone auslesen; andererseits können die Neurone durch elektrische Pulse 

mittels einer Stimulationselektronik auch gereizt werden. 

1 In vitro: Im Reagenzglas

1. Einleitung 2 

In dieser Diplomarbeit wird die Entwicklung eines Messaufbaus zur Aufnahme 

und Stimulation neuronaler Aktivität beschrieben. Grundlage dieser Messungen sind 

oben genannte Mikroelektrodenfelder, die über eine elektromechanische Kopplung 

mit einer Verstärker-, Aufnahme- und Stimulationselektronik verbunden werden. 

Der Aufbau gestattet, mit artifiziellen Signalmustern Lern- und Konditionierungsexperimente 

durchzuführen. 

Zum Test des Systems wurden Experimente mit differenzierten neuronalen Zellen 

und Herzmuskelzellen durchgeführt [Banker und Goslin, 1998]. Für andere Fragestellungen 

ließen sich auch Gehirnschnitte oder Retinagewebe verwenden. 

Mit einem solchem Aufbau können beispielsweise folgende Fragestellungen untersucht 

werden: 

• Konditionierung ( ” 

Pawlowscher Hund“): Lassen sich Zellen gezielt trainieren? 

Ist Lernen in den sich selbstorganisierenden Netzwerken möglich ? Wenn ja, 

wie ? [Hasselmo und McClelland, 1999], [Kalvas und Nakamura, 1999], [Tateno 

und Jimbo, 1999], [Shahaf und Marom, 2001] 

• ” 

Neurocomputer“ : Kann einem solchen Netzwerk künstlich eine Art Rechenvorschrift 

einprogrammiert (gelehrt) werden, um Aufgaben wie z.B. Mustererkennung 

oder Bildmanipulation durchzuführen ? [Potter, 2001], [DeMarse u.a., 

2001] 

• ” 

Neurosensor“ : Wie reagieren die Zellen auf verschiedene chemische Substanzen 

? Ließen sie sich zur Detektion neurotoxischer Substanzen oder zur Beurteilung 

neuroaktiver Pharmaka verwenden ? [Pancrazio u.a., 1998], [O’Connor 

u.a., 2000], [Stenger u.a., 2001] 

Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit werden die Grundlagen der Neurobiologie 

und Elektronik dazu verhelfen, die Brücke zwischen diesen beiden sehr verschiedenen 

Gebieten zu schlagen. Anschließend werden die geforderten Eigenschaften des 

Systems skizziert, um zuverlässig Aktivität von elektrogenen Zellen aufnehmen und 

stimulieren zu können. Im folgenden Literaturteil werden existierende Lösungen vorgestellt 

und untereinander verglichen. 

Im Abschnitt ” 

Materialien und Methoden“ wird der Messaufbau und dessen Komponenten 

beschrieben. Im Teil ” 

Ergebnisse und Resultate“ wird er charakterisiert 

und mit den existierenden Systemen verglichen. Dort werden auch die biologischen 

Experimente vorgestellt und diskutiert. 

In der abschließenden Zusammenfassung werden alle Ergebnisse zusammengestellt 

und in Bezug zu weiteren Experimenten und Fragestellungen gesetzt. 

Im Anhang finden sich die ausführlichen Beschreibungen für die Herstellung der 

Elektronik und Rezepte der benutzten Nährstoffmedien.

Teil I 

Literatur- und Theorieteil

2 Literatur- und Theorieteil 

2.1 Biologische Grundlagen 

Nervenzellen (Neuronen) sind sehr komplex in ihrem Bau und ihrer Funktionsweise. 

Ein ganzer Zweig der Biologie beschäftigt sich mit der Beschreibung und Untersuchung 

dieser Zellen. Detaillierte Beschreibungen finden sich z.B. in den Lehrbüchern 

von [Campbell, 1998], [Silbernagl und Despopoulos, 4.Auflage, 1991], [Schmidt u.a., 

28. Auflage, 2000] und [Klinke und Silbernagl, 2. Auflage, 2000]. 

Beim Menschen finden sich drei Arten von elektrisch erregbaren Zellen, die auf 

einen Reiz mit einer Änderung ihrer elektrischen Membraneigenschaften reagieren: 

• Nervenzellen: Erzeugung, Übertragung und Modifikation von Impulsen 

• Muskelzellen: Kontraktion aufgrund eines eingehenden Impulses 

• β−Zellen der Langerhans Inseln: Stimulation der Insulinsekretionsdrüse [Dean 

und Matthews, 1968], [Schuhmacher, 1997] 

Ziel dieser Diplomarbeit ist die Verarbeitung elektrischer Nervensignale. Zum Austausch 

von Informationen besitzen Neurone sowohl passive als auch spannungsgesteuerte 

Ionenkanäle, die durch elektrochemische Reizweiterleitung (Depolarisierung 

der Zellmembran in Form von sog. ” 

Aktionspotentialen”) die Kommunikation zwischen 

mehreren Zellen ermöglichen. Diese Aktionspotentiale bieten eine mögliche 

Schnittstelle zum Ableiten von elektrischen Zellsignalen. Es folgt eine Beschreibung 

der Eigenschaften des intrazellulären Informationsaustausches. 

2.1.1 Ruhe- und Aktionspotentiale 

Mittels aktiver und passiver Transportvorgänge durch die Zellmembran werden geladene 

Stoffe zwischen Zellinnerem und –äußerem verschoben. Die Konzentrationsunterschiede 

einzelner Ionensorten zwischen dem Zellinneren und dem Außenraum 

erzeugen eine elektrische Potentialdifferenz über der Zellmembran, das sog. Ruhemembranpotential. 

Bei Muskel- und Nervenzellen liegt diese Potentialdifferenz zwischen 

50-100 mV, wobei das Zellinnere negativ geladen ist. 

Wird eine elektrisch erregbare Zelle gereizt, ändert sich die Ionenleitfähigkeit der 

Membran und dadurch ihr Potential. Bei genügend großen Reizen überschreitet das 

Membranpotential einen Schwellenwert, wodurch es zur Erregungsweiterleitung in 

einer Nervenzelle über ein sog. Aktionspotential (AP) bzw. zur Kontraktion einer

2. Literatur- und Theorieteil 5 

Muskelzelle kommt. Durch den Reiz wird das im Inneren der Zelle negative Ruhemembranpotential 

in positive Richtung umgepolt. Man spricht von ” 

Depolarisation“. 

Die Erzeugung des Aktionspotentials kann wie folgt beschrieben werden: Wird das 

sog. Schwellenpotential – eine Grenzspannung – überschritten, so werden lokal Na + - 

Kanäle aktiviert. Das Ruhemembranpotential bricht lokal sehr rasch zusammen (Depolarisationsphase 

des Aktionspotentials) und erreicht positive Werte (Overshoot). 

Die Na + -Durchlässigkeit sinkt nach < 0,1 ms wieder, die K + -Leitfähigkeit der Membran 

steigt jedoch gleichzeitig langsam an, was zum Wiederaufbau des Ruhemembranpotentials 

(Repolarisationsphase) führt. Wegen der erhöhten K + -Leitfähigkeit 

kommt es allerdings vorübergehend zu einer sogenannten Hyperpolarisation, die jedoch 

nach etwa 5-10 ms wieder abgebaut wird, da sich die K + -Kanäle wieder schließen 

und die ursprüngliche Ionenverteilung durch Ionenpumpen wiederhergestellt 

wird. Der typische Verlauf eines Aktionspotentials ist in Abbildung 2.1 dargestellt. 

Nach der Reizung in der Anfangsphase der Repolarisation ist die Zelle für eine kurze 

Zeitspanne (absolute Refraktärperiode) nicht erregbar und danach für eine weitere 

kurze Zeitspanne nur durch einen stärkeren Reiz erregbar (relative Refraktärperiode). 

Abb. 2.1: Änderung des Membranpotentials als Funktion der Leitfähigkeit der Zellmembran 

für Natrium(g Na )- und Kaliumionen(g K ) und daraus resultierendes 

Aktionspotential (Erklärung im Text). Abbildung: [Silbernagl und 

Despopoulos, 4.Auflage, 1991] 

Die Aktionspotentiale von Nerv und quergestreiftem Muskel (Skelettmuskulatur) 

unterscheiden sich kaum, die Aktionspotentiale von Herzmuskeln zu Nerven jedoch 

sehr (Abbildung 2.2). 

2.1.2 Die Nervenzelle (Das Neuron) 

Ein typisches (motorisches) Neuron (siehe Abbildung 2.3) besteht aus einem Zellkörper 

(Soma), einem Axon (Neurit) und Dendriten. Das Axon bildet oft Nebenäste


Abb. 2.2: Aktionspotentiale von Nervenzellen, quergestreifter Muskulatur und Herzmuskelzellen 

unterscheiden sich in ihrem Aussehen. Abbildung angelehnt 

an: [Silbernagl und Despopoulos, 4.Auflage, 1991] 

(Kollaterale), die sich am Ende nochmals aufteilen und in sog. Endknöpfen (Synapsen) 

enden. Das Axon nimmt Verbindung zu den Dendriten, Somata, Axonen oder 

Synapsen anderer Zellen auf. Ein einzelnes Neuron kann Tausende solcher Kontakte 

herstellen. 

Abb. 2.3: Neuron und Synapse. Abbildung: [Silbernagl und Despopoulos, 4.Auflage, 

1991] 

Die Zellmembran des Somas setzt sich als Axolemma entlang des Axons fort, das 

im zentralen Nervensystem (ZNS) von Oligodendrozyten, im peripheren Nervensystem 

(PNS) von Schwannschen Zellen umgeben ist (Axon + Hülle = Nervenfaser). 

Schwannsche Zellen bilden konzentrische Schichten um das Axon herum, die sog. 

Myelin- oder Markscheide. Sie wirkt als elektrischer Isolator (hydrophobes Lipoprotein) 

und ist entlang des Axons ca. alle 1,5 mm an den sog. Ranvierschen Schnürringen 

unterbrochen. Das Axon ist für die Reizweiterleitung zuständig. 

Die Synapse ist die Kontaktstelle des Axons einer Nervenzelle zu einem anderen 

Neuron, aber auch zu Muskel- und Drüsenzellen. Bei den Säugern findet an 

der Synapse (mit wenigen Ausnahmen) keine elektrische, sondern nur eine chemische 

Signalübertragung statt: Durch das elektrische Signal im Axon wird aus Vesikeln 

(Bläschen) an der präsynaptischen Membran (≡ Membran der Senderzelle) 

ein Überträgerstoff (Neurotransmitter) freigesetzt, der durch den synaptischen Spalt 

(10-40 nm) zur postsynaptischen Membran (≡ Membran der Empfängerzelle) dif-


fundiert und dort elektrische Veränderungen bewirkt (siehe Abbildung 2.4). Je nach 

Art des Überträgerstoffes führt die synaptische Übertragung zu einer Hemmung 

oder Erregung des Empfängerneurons. Da die postsynaptische Membran keine Neurotransmitter 

entsenden kann, lassen Synapsen das Signal nur in einer Richtung 

durch, d.h. sie haben Ventilfunktion, ohne die eine gerichtete Informationsübertragung 

nicht möglich wäre. 

Abb. 2.4: Synapse, synaptischer Spalt und synaptische Signalübertragung. Abbildung: 

[Silbernagl und Despopoulos, 4.Auflage, 1991] 

2.1.3 Reizweiterleitung 

Axone dienen der Erregungssweiterleitung zwischen den Neuronen. Die elektrochemische 

Weiterleitung des Signals erfolgt durch andauernde Neubildung des Aktionspotentials 

entlang der Nervenfaser. Ein Unterschied in der Leitungsgeschwindigkeit 

besteht zwischen marklosen Nervenfasern (ca. 1 m/s) und markhaltige Nervenfasern 

(ca. 120 m/s). Die Myelinscheide isoliert die Faser gegenüber der Umgebung elektrisch 

ab; dadurch kann das elektrische Feld über größere Distanzen (ca. 1,5 mm) 

wirken. Das Aktionspotential wird also ” 

sprunghaft“ von Schnürring zu Schnürring 

weitergeleitet. 

2.1.4 Künstliche Reizung des Neurons 

Nervenzellen können von außen elektrisch gereizt werden, indem mit einem Spannungspuls 

von bis zu 800 mV der Nerv depolarisiert wird. Fraglich ist hierbei jedoch, 

inwieweit die künstlichen Spannungsstöße sich von den ” 

natürlichen“ Reizen unterscheiden.


2.2 Elektronische Grundlagen 

2.2.1 Einleitung und Motivation 

Die Kommunikation zwischen Neuronen verläuft mittels elektrochemischer Reizweiterleitung. 

Ein wichtiger Schritt zum Verständnis neuronaler Information ist die 

Möglichkeit Signale von Nervenzellen aufnehmen zu können, um sie dann im Computer 

zu analysieren. Die Zellen werden auf Glasplatten kultiviert, auf die Goldelektroden 

mit einem Durchmesser zwischen 10 und 30 µm aufgebracht sind. Erzeugt 

eine Zelle, die auf einer solchen Goldelektrode liegt, ein Aktionspotential, so kann 

durch kapazitive Wechselwirkung auf der Goldelektrode ein Spannungswechsel von 

wenigen 10 µV gemessen werden. Über dünne Leiterbahnen gelangt das Signal zu 

einer 2×3 mm 2 großen Goldelektrode. Dort wird das Signal über einen Kontakt abgegriffen 

und über weitere Leiterbahnen bis zur Aufnahmeelektronik weitergeleitet. 

Von der Zellmembran bis zur Elektronik entsteht dadurch ein Widerstand von bis zu 

einigen MΩ. Um von außen kommende Störeinflüsse zu minimieren, ist eine Impedanzwandlung 

unumgänglich. Da typische Datenaufnahmekarten für den Computer 

Spannungen im Volt-Bereich aufnehmen, müssen die Signale zusätzlich verstärkt 

werden. 

In diesem Teil der vorliegenden Diplomarbeit werden die Rahmenbedingungen 

für die Aufnahmeelektronik definiert. Zusammen mit den kompakt dargestellten 

Elektronik-Grundlagen kann ein Gesamtkonzept erarbeitet werden, das die endgültige 

Form der Aufnahmeelektronik beschreibt. Der eigentliche Aufbau der Geräte 

wird im Teil ” 

Material und Methoden“ beschrieben. 

2.2.2 Anforderungen an die Elektronik 

Die Eigenschaften der neuronalen Zellen auf dem MEA lassen sich wie folgt zusammenfassen: 

Eigenschaft 

Dauer eines Aktionspotentials 

Amplitude eines kapazitiv aufgenommenen 

Signals eines Neurons 

Amplitude eines kapazitiv aufgenommenen 

Signals einer Herzmuskelzelle 

Impedanz zwischen Zelle und Verstärker 

Spannungsbereich der Computermesskarte 

Bedingung 

1 ms – 10 ms 

0 – 100 µV (hängt vom Abstand 

der Zelle zur Elektrode ab) 

0 – 10 mV (hängt vom Abstand 

der Zelle zur Elektrode ab) 

0,2 – 2 MΩ 

Von ± 0,1 V bis ± 10 V 

(beliebig einstellbar) 

2.2.3 Operationsverstärker 

Integrierte Verstärkerbausteine werden in der Elektronik Operationsverstärker genannt 

[Tieze und Schenk, 1989], [Wupper, 1994], [Diedrich, 2000]. In den folgenden


Abschnitten werden die jeweils beschriebenen Grundlagen mit den oben beschriebenen 

Eigenschaften in Verbindung gebracht. Primär handelt es sich um die folgenden 

Punkte: 

• Verstärkungsfaktor: Faktor, um den das Eingangssignal verstärkt wird 

• Bandbreite: Frequenzbereich, in dem der Verstärker arbeitet 

• Eingangswiderstand: Eigenimpedanz des Verstärkereingangs 

• Anstiegsrate: Geschwindigkeit, mit der der Verstärker Spannungswechsel verstärken 

kann 

2.2.4 Grundlagen 

Ziel eines Verstärkerbausteins ist die lineare Verstärkung (≡ Erhöhung der Amplitude) 

eines Eingangssignals um einen definierten Skalierungsfaktor. Das in der 

Elektronik typische Schaltsymbol eines Operationsverstärkers (OPV) ist in Abbildung 

2.5 zu sehen. Statt einem einzigen Signaleingang besitzt der OPV aus technischen 

Gründen einen invertierenden Eingang ” 

–“ (positive Eingangsspannungen 

bewirken negative Ausgangsspannung) und einen nicht-invertierenden Eingang ” 

+“ 

(die Polarität der Eingangsspannungen bleibt bei der Ausgangsspannung erhalten). 

Weitere Anschlüsse sind eine symmetrischen Spannungsversorgung (meist ±15 V) 

und ein Ausgang. Erweiterte Modelle besitzen Anschlüsse für z. B. Offset-Korrektur 

und Frequenzgang-Korrektur. Die typische native Verstärkung liegt zwischen 1000× 

bis 100.000× und kann über Rückkopplung des Ausgangs mit einem Eingang auf 

beliebige kleinere Verstärkungen eingestellt werden. 

Abb. 2.5: Schaltsymbol des Operationsverstärkers. Zwischen den beiden Eingängen 

( ” 

+“ und ” 

-“) liegt die Differenzspannung U D an. U P und U N sind die 

Spannungen zwischen der Referenz und den beiden Eingängen. Der Operationsverstärker 

gibt die verstärkte Spannung U a aus. Abbildung: [Tieze 

und Schenk, 1989]


2.2.4.1 Verstärkungsfaktor 

Das neuronale Signal von ca. 100 µV muss um einen Faktor 1000 – 10000 verstärkt 

werden, um auf ein Ausgangssignal von 100 mV – 1 V zu kommen. Da man auch in 

der Lage sein möchte, Herzmuskelzellen untersuchen zu können, die Amplituden bis 

zu 10 mV erzeugen, beschränkt man die Verstärkung auf 1000-fach. 

2.2.4.2 Differenzverstärkung eines Operationsverstärkers (open loop gain) 

Die native Verstärkung ohne Rückkopplung (≡ Gegenkopplung) nennt man Differenzverstärkung 

A D oder auch offene Verstärkung“ (open loop gain). Sie liegt 

” 

typischerweise im Bereich 10 4 ..10 5 . Bei realen Schaltungen werden aus technischen 

Gründen (z.B. Bandbreite, siehe weiter unten) jedoch selten die vollen Verstärkungsfaktoren 

benutzt. Daher müssen Rückkopplungsaspekte berücksichtigt werden, die 

in den folgenden Paragraphen behandelt werden. 

2.2.4.3 Rückkopplung 

Um die Verstärkung auf einen definierten Wert zu setzen, koppelt man über einen 

Widerstand R N einen definiert abgeschwächten Teil des Ausgangssignals in den invertierten 

Eingang ein. Die resultierende Verstärkung ist eine Funktion von Rückkopplungswiderstand 

R N und Widerstand R 1 . Eine detailliertere Darstellung der 

mathematischen Beziehungen ist bei [Tieze und Schenk, 1989] zu finden. Man spricht 

von Gegenkopplung bzw. Rückkopplung. Hierbei gibt es zwei Möglichkeiten: 

1. Invertierender Verstärker: Als Eingang wird der invertierende Eingang benutzt 

(s. Abb. 2.6a). Das verstärkte Signal ist invertiert. Für die Verstärkung A gilt: 

A = − R N 

R 1 

(2.1) 

2. Nicht-invertierender Verstärker: Als Eingang wird der nicht-invertierende Eingang 

benutzt (s. Abb. 2.6b). Das verstärkte Signal bleibt bei seiner Polarität. 

Für die Verstärkung A gilt: 

A = 1 + R N 

R 1 

(2.2) 

Durch Variation der Rückkopplungstechnik können verschiedene anwendungsrelevante 

Effekte hervorgerufen werden: 

• Spannungsteiler: linearer Verstärker 

• Widerstands-Kondensator (RC)-Netzwerke: aktiver Filter 

• Nichtlineare Elemente: nichtlineare Rechenoperationen 

Ein Operationsverstärker mit Rückkopplung kann also sowohl als linearer Verstärker, 

als auch als aktiver Filter verwendet werden.


Abb. 2.6: Rückkopplungsverstärkung beim a) invertierenden und b) nicht-invertierenden 

Verstärker. Abbildung: [Tieze und Schenk, 1989] 

2.2.4.4 Offset 

Bei realen Operationsverstärkern ist die Verstärkungskurve um ein sog. Offset U 0 im 

µV- bis mV-Bereich verschoben (input offset voltage). Temperaturschwankungen, 

Betriebsspannungsschwankungen und Laufzeiteffekte rufen weitere Offset-Effekte 

hervor. Die Offset-Effekte lassen sich zusammenfassen: 

Offsetspannung 

U 0 : native Spannungsdifferenz 

Temperaturdrift 

∂U 0 

∂T 

≈ 3..10 µV K 

Langzeitdrift 

Betriebsspannungsschwankungen 

∂U 0 

∂t 

≈ ... 

∂U 0 

∂U D 

µV 

Monat 

≈ 10..100 µV V 

Für einen ” 

idealen“ Verlauf muss diese Spannungsabweichung korrigiert werden. 

Da für die in dieser Arbeit verwendeten kommerziellen OPV die Offsetwerte vernachlässigbar 

klein sind, kann angenommen werden: U 0 = 0 V. Es folgt, dass die 

Ausgangsspannung U a proportional zur Eingangsspannung U D ist. Das verstärkte 

Signal ist ein lineares Abbild des ursprünglichen Signals. Eine Signalverfälschung 

findet nicht statt. 

2.2.4.5 Bandbreite 

Ein Verstärker muss die neuronalen Signale im Bereich von 1 ms – 10 ms Dauer 

verstärken können. Umgerechnet in Frequenzen sind das 1 kHz – 100 Hz. Idealerweise 

filtert die Elektronik Frequenzen von 50 Hz (Netzrauschen) und Frequenzen oberhalb 

von 10 kHz (Hochfrequenz-Störfelder, z.B. Computer) aus dem Signal. Hierzu werden 

aktive Filter eingesetzt, die in Abschnitt 2.2.6 besprochen werden.


2.2.4.6 Stabilitätskriterien 

Der Frequenzgang der Differenzverstärkung beschränkt den Verstärkungsfrequenzbereich 

eines OPV. Um einen OPV stabil zu halten, muss ein Tiefpass sehr niedriger 

Grenzfrequenz in die Schaltkreise des OPV integriert werden. Man nennt die 

Frequenz f T , bei der ein OPV instabil wird, Transitfrequenz. Man spricht auch vom 

Verstärkungs-Bandbreite-Produkt (gain bandwidth product). Der typische Frequenzgang 

eines unmodifizierten Verstärkers ist in Abbildung 2.7 dargestellt. Bis zu einer 

Frequenz von wenigen Hertz ist die Verstärkung konstant und nimmt dann kontinuierlich 

ab. Von Verstärkerbausteinen werden konstante Verstärkungswerte über ein 

breites Frequenzspektrum erwartet. 

Abb. 2.7: Typischer Frequenzgang der Differenzverstärkung ohne Gegenkopplung. 

Abbildung: [Tieze und Schenk, 1989] 

Der Frequenzverlauf ändert sich mit Gegenkopplung. Die Verstärkung ist weitgehend 

unabhängig von der nativen Verstärkung A D , solange der durch Rückkopplung 

eingestellte Verstärkungsfaktor viel kleiner als die native Verstärkung ist. Durch die 

Gegenkopplung ist man in der Lage, einen über ein breites Frequenzspektrum konstanten 

Verstärkungsfaktor einzustellen. Die Abbildung 2.8 stellt diese Zusammenhänge 

graphisch dar. Durch eine geeignete Einstellung der Widerstände wird der 

Faktor 1 definiert, der gleich dem Verstärkungsfaktor ist: 

k 

1 

k := (R 1 + R N ) 

= A (2.3) 

R 1 

Die Herabsetzung der nativen Verstärkung auf eine gegengekoppelte Verstärkung 

nennt man Schleifenverstärkung g: 

g = k · A D (2.4) 

Da Signale von Gehirnzellen im kHz-Bereich liegen, muss für die Aufnahme von 

neuronaler Aktivität ein Operationsverstärker mindestens eine gewisse Transitfrequenz 

übertreffen. Dies ist ein erstes Auswahlkriterium für Operationsverstärker. 

Bei Signalen im kHz-Bereich und A D = 10 5 sollte die Bandbreite größer als einige 

100 kHz sein.


Abb. 2.8: Erhöhung der Bandbreite durch Gegenkopplung. Abbildung: [Tieze und 

Schenk, 1989] 

2.2.4.7 Eingangsruhestrom 

Der Eingangsruhestrom (input bias current) ist relativ groß (bipolare OPVs: 20..200 

nA, Feldeffekttransistor-OPVs: pA). Deswegen entsteht ein Eingangsoffsetstrom, 

das einen Spannungsabfall in der Spannungsquelle erzeugt. Deswegen nutzt man 

Feldeffekttransistor-OPV (FET-OPV), die einen niedrigen Eingangsruhestrom besitzen. 

2.2.4.8 Eingangswiderstand 

Für die beiden Gegenkopplungsformen ergeben sich unterschiedliche Eingangswiderstände: 

(a) Nicht-invertierender Verstärker: Der Differenzeingangswiderstand r D wird 

durch die Gegenkopplung um den Faktor g hochtransformiert (Elektrometer Gegenkopplung). 

Anwendung: Das MEA habe eine Impedanz von r g =1 MΩ. Der Verstärkungsfehler 

solle kleiner als 0,1% betragen. Daraus errechnet sich, dass der Eingangswiderstand 

r gl größer als 1 GΩ sein muss. 

(b) Invertierender Verstärker: 

Der Eingangswiderstand ergibt sich zu: 

r e = R 1 (2.5) 

Da der Widerstand R 1 zwischen Verstärker und MEA geschaltet werden muss, 

kann kein zu großer Widerstand genommen werden. Damit ist diese Schaltung als 

erste Verstärkerstufe ungeeignet. 

Aufgrund der hohen Impedanz der Mikroelektrodenarrays muss auf einen hohen 

Eingangswiderstand geachtet werden. Feldeffekttransistoren bieten ausser den 

niedrigen Eingangsruheströmen noch sehr hohe Eingangswiderstände, ein niedriges


Rauschen und sehr hohe Verstärkungsbandbreiten. Wie in 2.2.4.7 und 2.2.4.8 diskutiert, 

steht das zweite Auswahlkriterium für Operationsverstärker fest: Sie müssen 

mit Feldeffekttransistoren aufgebaut sein und der Kontakt mit dem MEA sollte von 

einer nicht-invertierenden Verstärkerstufe wegen des höheren Eingangswiderstandes 

übernommen werden. Der Eingangswiderstand sollte größer als 1 GΩ sein (siehe 

Anwendung weiter oben). 

2.2.4.9 Anstiegsgeschwindigkeit (slew rate) 

Neuronale Signale besitzen Signale von 1 ms Dauer und ca. 100 µV Amplitude. Ein 

Verstärker muss in der Lage sein, die Flanken des Signals schnell genug verstärken zu 

können, damit die neuronale Information möglichst unverfälscht bis zum Computer 

gelangen kann. Damit ergibt sich die maximale Frequenz, die ohne Verzerrungen verstärkt 

werden kann (Sinus-Schwingung angenommen) durch die Anstiegsgeschwindigkeit 

dUa der Ausgangsspannung eines Operationsverstärkers: 

dt 

dU a 

dt 

∣ = 2πfÛa (2.6) 

max 

Nimmt man für Signale eine maximale Frequenz von f max = 10 kHz an, so ergibt 

sich eine Anstiegsgeschwindigkeit von 0,6 V/µs. Dies ist die dritte Anforderung an 

einen Operationsverstärker, der als MEA-Verstärker eingesetzt werden kann. Auch 

bei der Anstiegsgeschwindigkeit haben Feldeffekttransistoren sehr gute Eigenschaften. 

2.2.5 Zusammenfassung Verstärkerbaustein-Kriterien 

Zusammenfassend konnten folgende Kriterien gefunden werden: 

Bedingung 

Transitfrequenz 

Eingangswiderstand 

Verstärkeraufbau 

Wert 

einige 100 kHz 

> 1 GΩ ≡ 10 9 Ω 

FET (Feldeffekttransistoren) 

Anstiegsgeschwindigkeit > 0,6 V µs 

2.2.6 Filter 

Da Störsignale von Spannungsnetz und Computer die schwachen neuronalen Signale 

überdecken oder nicht existierende Informationen vortäuschen könnten, ist 

man daran interessiert, diese Störungen herauszufiltern. Für diese Zwecke nutzt 

man Operationsverstärker mit RC-Kopplung. Je nach Verschaltung der Kapazitäten 

und Widerstände entstehen Hochpass-, Tiefpass- oder Bandpassfilter. Für die 

50Hz-Netzspannung benötigt man einen Hochpassfilter, der bei etwa 100 Hz seine 

Grenzfrequenz hat. Für das störende Hochfrequenz-Rauschen benötigt man einen 

Tiefpass mit etwa 10 – 20 kHz Grenzfrequenz.


Die Stärke der Abschwächung der ungewünschten Frequenzen eines Filters hängt 

von der Anzahl der Filterstufen ab, die hintereinandergeschaltet werden. Man spricht 

von der sog. Filterordnung. In den Abbildungen 2.9 und 2.10 sind die ersten beiden 

Ordnungen eines Tiefpass- und Hochpassfilters dargestellt. Der in den Schaltungen 

enthaltene Verstärker dient jeweils der Impedanzwandlung von Ein- und Ausgang. 

Abb. 2.9: Tiefpassfilter erster und zweiter Ordnung. Der Widerstand R 1 lässt alle 

Frequenzen passieren. Über die Kapazität werden die hochfrequenten 

Anteile über die Masse vermindert. 

Abb. 2.10: Hochpassfilter erster und zweiter Ordnung. Die Kapazität lässt nur hohe 

Frequenzen passieren. Über den Widerstand können eventuelle Gleichstromanteile 

zwischen der Kapazität und dem Verstärker abfließen.


2.3 Elektroden zur Aufnahme von Zellsignalen 

Zur Ableitung neuronaler Signale werden Elektroden benötigt. Für verschiedenste 

Anwendungsgebiete wurden unterschiedliche Elektrodenformen entwickelt, die im 

Folgenden beschrieben werden. Eine Übersicht über die meistgenutzten Aufnahmetechniken 

ist in Abbildung 2.11 dargestellt. 

pA 

Patch-clamping 

mV 

50 

Intrazelluläre 

Nadelelektroden 

offen 

geschlossen 0 

0 

Schwellenwert 

Ruhepotential 

µV 

0 

Extrazelluläre 

Nadelelektroden 

2 

B 

4 ms 

2 4 

C 

A D 

ms 

rel. Intensität 

Optische Aufnahme 

Intrinsische Signale 

(Reflexion), Farbstoffe: relative 

Absorption oder Fluoreszenz 

1 

2 

s 

Gegen- 

Referenz 

elektrode 

E 

µV 

100 

0 

2 

4 

ms 

Extrazelluläre 

Mikroelektrodenfelder 

(MEAs, MMEPS) 

Basislinie 

2 

4 

ms 

Abb. 2.11: Schematische Darstellung der prinzipiellen Möglichkeiten der Signalerfassung 

an (Nerven-) Zellen und der zu erwartenden Signaltypen. Abbildung: 

[Blau, 1995] 

2.3.1 Einzelne Ableitungs- und Stimulationselektroden 

Erste Zellableitungen an Neuronen wurden mit Metallmikroelektroden durchgeführt. 

Mit zwei Elektroden wurde die Potentialdifferenz zwischen Zellinnerem und 

-äußerem gemessen. Die maximale Messzeit ist beschränkt, da die Zelle durch das 

Anstechen mit der Metallelektrode innerhalb von Minuten bis Stunden stirbt. Die 

Untersuchung extrazellulärer Signale von Nervenbündeln wurde mit kurzen zylinderförmigen 

Manschettenelektroden durchgeführt, die auch in das Gewebe implantiert 

werden können.


in-vivo Elektroden 

Eine weitere Klasse von Elektroden sind die in-vivo Elektroden, bei denen Elektroden 

direkt in den Körper implantiert werden [Kim und Kim, 2000], [Hofmann u.a., 

2000] und [Folkers und Hofmann]. Sie eignen sich zum Studium und zur Steuerung 

von Gehirnbereichen [Nicolelis, 2001], [Henze u.a., 2000] oder als Interface zwischen 

biologischem Gewebe und Elektronik. Durch unterschiedliche Anwendungsfelder entstanden 

verschiedenste Elektrodenformen [Blau, 1995]. 

2.3.2 patch-clamp Technik 

Traditionelle elektrophysiologische Ableitungen von Zellen wurden mittels Glasmikropipettenelektroden 

realisiert [Neher und Sakmann, 1976], [Land u.a., 2001]. Diese 

Methode ermöglicht in-vitro-Experimente mit Einzelzellen, bei denen die Eigenschaften 

der Neuronen, deren Ionenkanäle und ihrer Synapsen erforscht werden können 

[Fitzsimonds u.a., 1997]. Die Aktivität einzelner Ionenkanäle lässt sich mit den Strömen 

messen, die durch eine konstant angelegte Spannung hervorgerufen werden. Die 

Mikropipette wird konzentrisch um einen Ionenkanal angebracht und mit einem 

leichten Unterdruck an der Membran der Zelle festgesaugt. Dadurch wird der Ionenkanal 

gegenüber der Extrazellulärflüssigkeit isoliert. Der Ionenstrom durch den 

Kanal wird messbar. Da mit dieser Technik nur wenige Einzelzellen unter hohem 

Zeitaufwand per Mikromanipulator kontaktiert werden können, sind Untersuchungen 

des Netzwerkverhaltens jedoch nicht möglich. 

2.3.3 Mikroelektrodenfelder 

Extrazelluläre Ableitungen mit Multielektrodenarrays (MEA) ermöglichen die gleichzeitige 

Aufnahme der Netzwerkaktivität von Hunderten von Neuronen. Thomas 

[Thomas u.a., 1972] nutzte Elektrodenarrays um Feldpotentiale von spontan kontrahierenden 

Herzmuskelzellen untersuchen zu können. Die Aufnahme von Einzelzellaktivität 

war allerdings nicht möglich. Gross [Gross, 1979] und Pine [Pine, 1980] 

entwickelten unabhängig voneinander Elektrodenfelder, die gleichzeitig viele Einzelzellmessungen 

von neuronalen Netzwerken erlaubten. Es entstand eine Vielzahl 

verschiedener Elektrodenformen, unterschiedliche Hardwaresysteme und Software 

[Eggers u.a., 1990], [Novak und Wheeler, 1986], [Gross und Schwalm, 1994], [Pine, 

1987], [Jimbo und Kawana, 1992]. 

Multielektrodenarrays (siehe Abbidlung 2.14) mit mindestens 60 Elektroden sind 

jetzt kommerziell von Multichannelsystems [MCS], Panasonic [Panasonic] und Günter 

Gross [CNNS] erhältlich. Die MEAs bestehen meist aus planaren Elektroden 

von 10 – 100 µm Durchmesser, die auf einem Substrat aus Glas oder Silizium aufgebracht 

sind. Als Elektrodenmaterial wird Gold oder durchsichtiges Indium-Zinn- 

Oxid (ITO) verwendet. Um die Kapazität der Elektroden zu verbessern, kann poröses 

Platin ( ” 

platinum black“) elektrochemisch abgeschieden werden, das aufgrund 

einer dreidimensionalen Topographie eine große Oberfläche besitzt. Zur Verbesserung 

der Impedanz kann Iridium-Oxid [Blau u.a., 1997] oder Titan-Nitrid [Egert


Abb. 2.12: Ein 60-Elektroden Mikroelektrodenarray (MEA). Abbildung: MCS 

u.a., 1998] aufgesputtert werden. Die Isolierung der Leiterbahnen wird typischerweise 

mit Polyimid oder Siliziumnitrid/-oxid vorgenommen. Verbesserungen der Kultivierungsbedingungen 

ermöglichen es, die Zellen über lange Zeit am Leben und 

elektrisch aktiv zu halten [Potter und DeMarse, 2001]. Auch andere Zelltypen können 

untersucht werden, z.B. Retinagewebe [Stett u.a., 2000] oder Herzmuskelzellen 

(HMZ) [Thomas u.a., 1972]. Für Gehirnschnitte (slices) wurden dreidimensionale 

Fakir” MEAs entwickelt [Heuschkel u.a., 2001], die in Abbildung 2.13 mit planaren 

” 

Elektroden verglichen werden, da die durch die Präparation abgestorbenen äußeren 

Zellschichten von der spitzen Elektrode durchbohrt werden. 

Marc Heuschkel bietet mit Ayanda Biosystems MEAs an, die kompatibel zum 

MCS System sind. Im Unterschied zu MCS benutzt Heuschkel Elektrodenarrays, die 

in einem photolitographischen Prozess erstellt und auf eine Trägerplatinen gebondet 

wurden. 

Glas-Multielektrodenfelder führen die Elektrodenfelder auf Gold- oder ITO-Leiterbahnen 

an die Elektronik, was bei einer Erhöhung der Elektrodenzahl wegen zu 

großen Übersprechens und zu langen Leitungen auf Grenzen stößt. 

2.3.4 CMOS Neurochips 

[Fromherz und Stett, 1995] und [Offenhäusser u.a., 1997] benutzen auf Feld-Effekt- 

Transistoren basierende Neurochips statt der Elektroden auf Glassubstrat, bei denen 

die Zellen auf dem Gate des Transistors kultiviert werden.


Abb. 2.13: Bildlicher Vergleich von planarem Elektrodentyp (links) und 3D-Fakir 

Elektrodentyp (rechts). Die planaren Elektroden werden für dissoziierte 

Zellkuluren und die 3D-Elektroden für Gehirnschnitte eingesetzt. Abbildung: 

Marc Heuschkel 

Weitere Untersuchungen des Netzwerkverhaltens von neuronalen Zellen erfordern 

eine Erhöhung der Elektrodenanzahl. Nisch stellt in [Bucher u.a., 2001] lichtaddressierbare 

MEAs vor, die bis zu 3600 sub-µm Elektroden haben. Allerdings lassen sich 

die Elektroden nur seriell auslesen. 

Das europäische INPRO-Projekt hat die Erstellung von CMOS-Chips mit etwa 

1000 Elektroden und integrierter Verstärker-, Stimulations- und Datenübertragungselektronik 

zum Ziel. Dieses Projekt wird unter 2.4.2.2 näher beschrieben. 

CMOS Chips eigenen sich für hohe Elektrodenanzahl durch die Integration der 

Verstärkerelektronik und der Analog-Digital-Wandlung auf dem Chip. Dadurch müssen 

nur wenige Datenleitungen nach außen geführt werden. CMOS-Chips sind günstig 

und durch die Wafer-Technik in großen Stückzahlen produzierbar. 

2.3.5 Optische Aufnahmemethoden 

Einen komplett anderen Ansatz ohne Elektroden verfolgen Arbeitsgruppen, die mit 

spannungsabhängigen Farbstoffen arbeiten [Wu u.a., 1998], [Hüser u.a., 1996]. Probleme 

bereiten hier das schnelle Ausbleichen der Farbstoffe (bleaching) und die dabei 

entstehenden toxischen Stoffe. Die Aufnahme neuronaler Aktivität erfordert eine 

technisch hochwertige Ausrüstung, da ein Aktionspotential eine Lichtintensitätsveränderung 

von ca. 1% hervorruft und damit das Signal- zu Rauschverhältnis sehr 

schlecht ist. Weiterhin benötigt man eine hohe Auflösung, um auch Details auf der 

Zellmembran erkennen zu können. Damit Aktionspotentiale zeitlich aufgelöst wer-


den können, muss eine Bildwiederholrate im sub-Millisekundenbereich durch teure 

CCD-Hochgeschwindigkeitskameras erkauft werden. 

Die Stimulation der Zellen kann entweder elektrisch über konventionelle Elektroden 

erfolgen oder per Laserstrahl über die Aktivierung von Neurotransmittern per 

uncaging”-Technik, bei der modifizierte Neurotransmitter mittels Laserlicht gezielt 

” 

freigesetzt werden können [Park u.a., 2002], [Caucheteux-Silberzan u.a., 1993].


2.4 Aufnahmesysteme 

2.4.1 MEA basierte Systeme 

2.4.1.1 Multichannelsystems 

Multichannelsystems (MCS) bietet ein 60-Kanal Verstärkersystem für MEAs des 

Naturwissenschaftlichen und Medizinischen Institutes an der Universität Tübingen 

(NMI) an. Die 1200-fache Verstärkung ist mit einem integrierten Frequenzfilter verbunden, 

der fest verdrahtet im Bereich zwischen 1 Hz und 5000 Hz ausgeliefert werden 

kann. Zur Aufnahme dient ein Computer mit einer Analog-Digital-Wandlerkarte 

(AD-Karte) und der Software MC Rack. 

Die Stimulation erfolgt getrennt von der Aufnahme-Hard- und -Software durch 

eine Stimulationseinheit mit einem bis acht Kanälen. Die stimulierten Elektroden 

werden mittels Kabel auf einen deaktivierten Kanal des Verstärkers gesteckt. Mit 

jedem Stimulationskanal geht ein Aufnahmekanal verloren. Aufgrund der technischen 

Eigenschaften ist damit eine dynamische Auswahl von Stimulationskanälen 

nicht möglich. Auch das direkte Aufnehmen eines stimulierten Kanals kann nicht 

vorgenommen werden. 

Abb. 2.14: 60-Kanalverstärker von Multichannelsystems. 

2.4.1.2 Panasonic 

Panasonic bietet ein 64-Kanal Verstärkersystem für Pansonic-spezifische MEAs an. 

Diese sind nicht MCS-kompatibel. Die 1000-fache Verstärkung erfolgt in einem externen 

Verstärkersystem, das sich in einem 19” Rack befindet. Die Kontaktierung 

mit dem MEA ist passiv und beinhaltet keine Vorverstärkung, was durch lange Kabellängen 

Rauschen mit sich bringt. Die Daten werden mit einem Computer und


der Software ” 

Performer” aufgenommen. Eine Stimulationsmöglichkeit ist nicht vorgesehen, 

was den Einsatzbereich einschränkt. 

2.4.1.3 Plexon 

Die Firma Plexon vertreibt einen Verstärker, der mit MEAs von Günter Gross 

(CNNS, U. of N. Texas) zusammenarbeitet. Im Gegensatz zu den anderen Systemen 

arbeitet das Plexon-System mit digitalen Signal Prozessoren (DSP), die die 

Analog-Digital-Wandlung vornehmen und eine erste Vorverarbeitung ermöglichen. 

Die Aufnahme der Daten erfolgt mit einem Computer. 

Eine Stimulationsmöglichkeit ist nicht vorgesehen. 

2.4.1.4 Nippon Telegraph & Telephone (NT&T) 

NT&T in Japan arbeitet mit Jimbo in den Kawana-Laboratorien zusammen. Das 

von Jimbo entwickelte Gerät ist nicht kommerziell erhältlich. 

2.4.2 CMOS basierte Systeme 

Die Zellen werden auf CMOS-Chips mit Feldeffekttransistoren (FET) kultiviert. 

Der Vorteil bei diesen Systemen ist die Nähe der Verstärkerelektronik zu den Zellen. 

Statt auf einer Elektrode sitzen die Zellen auf einem Transistor, der die erste 

Verstärkungsstufe darstellt. Das Signal zu Rausch Verhältnis ist dadurch sehr gut 

im Vergleich zu den reinen Elektroden-MEAs. Weiterhin ist die Produktion dieser 

CMOS Chips wesentlich günstiger. 

2.4.2.1 Andreas Offenhäusser 

[Krause u.a., 2000] beschreibt ein CMOS basiertes System, das im Max-Planck- 

Institut für Polymerforschung in Mainz unter Wolfgang Knoll entwickelt wurde. 

Dieses System ermöglicht keine direkte extrazelluläre Stimulation. 

2.4.2.2 INPRO 

Zielsetzung des europäischen ” 

INformation PROcessing by Natural Neural networks” 

-Projektes (INPRO) ist die parallele Datenverarbeitung mit neuronalen Zellen. In 

einem ersten Schritt sollen Tiefpass-Filtereigenschaften der Zellen verifiziert werden, 

die in eine Mustererkennung münden. Den Zellen wird ein S/W-Bild unter 

Annahme eines neuronalen Codes präsentiert, die dieses Bild mit vorher gelernten 

Bilder vergleichen und charakterisieren sollen. Grundlage bildet ein von der 

ETH Zürich entwickeltes CMOS-MEA mit integrierter Verstärker-, Stimulationsund 

Datenübertragungsstufe. Die Nährstoff- und Neuropharmakaversorgung wird 

mittels eines Flusskammersystems der Universität Neuchâtel gesichert. Biokompatibilität 

und Datenauswertealgorithmen werden von der Universität Kaiserslautern 

getestet. Die theoretischen Grundlagen werden vom SISSA-Institut der Universität 

Triest entwickelt. Geplant ist ein Array von etwa 1000 Elektroden.


2.5 Experimente und Anwendungen zellbasierter 

Systeme 

Der Einsatz von MEAs bietet ein weitreichendes Einsatzgebiet: 

• Pharmascreening: Schnelle, einfache, kostengünstige und reproduzierbare Untersuchungen 

von pharmakologischen Substanzen. Dadurch sind weniger ethisch 

bedenkliche Tierexperimente nötig. 

• Parallele Datenverarbeitung: Viele Daten des neuronalen Netzes können gleichzeitig 

ausgelesen werden. Dadurch können viele Daten in kurzer Zeit charakterisiert 

werden. Besonders für Datenextraktion ist diese Anwendung interessant, 

da derzeitige Computerchips diese Aufgaben aufgrund ihres seriellen 

Vorgehens nur sehr mangelhaft lösen können. 

• Physiologische Untersuchungen: Die Analyse von verteilten Codes des Gehirns 

[Singer, December 2000] wird durch Messung von Korrelationseffekten von 

mehreren neuronalen Antworten gleichzeitig möglich. 

• Histologische Untersuchungen: Mittels Gehirnschnitten und Fakirelektroden 

können histologische Fragestellungen untersucht werden. 

2.5.1 Dissoziierte Zellen 

2.5.1.1 Modelle der Wirklichkeit 

Die Multielektrodentechnik erleichtert die Suche nach einer Theorie der Zell-Zell- 

Interaktion [Singer, December 2000]. Untersucht werden die Potentialformen der 

Neuronen, die sogenannten Feldpotentiale. In Kombination mit Modellrechnungen 

werden Theorien zum Aufbau und der Funktionsweise von Neuronen aufgestellt 

und verfeinert. Durch Ersatzschaltbilder und Modellsysteme können Zellmembran, 

Medium und Ionenkanäle simuliert und nachgebildet werden, um die Physik und 

Physiologie der Zellen besser verstehen zu können. 

2.5.1.2 Lernen und Gedächtnis 

Durch Langzeituntersuchungen mit kombinierten Stimulationen können Lernphänomene 

untersucht werden. Hierbei handelt es sich um Veränderungen in der Aktivierungsbarriere 

für Aktionspotentiale. Man spricht von Long Term Potentiation 

(LTP) für eine Herabsenkung der Aktivierungsschwelle und von Long Term Depression 

(LTD) für eine Anhebung der Aktivierungsschwelle. Von physiologischer Seite 

interessiert man sich für die Veränderungen innerhalb der Zelle bei diesen Phänomenen 

1 . Fraglich ist, ob sich nur Änderungen auf der Zellmembran ergeben oder ob 

sich auch der Zellmetabolismus ändert. 

1 Die Häufigkeitsverteilung der Proteine in der Zellmembran könnte sich verändert haben.


Shahaf [Shahaf und Marom, 2001] stellte ein erstes Experiment vor, bei dem ein 

neuronales Netz gezielt so lange stimuliert wurde, bis eine definierte Antwortsequenz 

gemessen wurde. Es konnte gezeigt werden, dass die Zellen nach einer gewissen Zeit 

auf das Signal reproduzierbar antworten. 

2.5.1.3 Neuronaler Code 

Bis heute ist die Sprache, mit der die Neuronen kommunizieren, nicht verstanden. 

Dieser ” 

Neuronale Code” wird daher von vielen Arbeitsgruppen untersucht [Meister 

und II, 1999]. 

Aus der Aktivität der Neuronen versucht man durch definierte Stimulationsanfragen 

mittels Korrelationsfunktionen, Wavelettanalyse und stochastische Resonanzmethoden 

Antwortmuster zu erkennen. Besondere Aufmerksamkeit wird bei der Analyse 

des Neuronalen Codes den Spikes gewidmet ( ” 

burst analysis”). Neuropharmaka 

führen Änderungen der Signale herbei, die mit Modellen erklärt werden können. Dadurch 

wird das Herausfinden von Regelmäßigkeiten und Zeitkonstanten vereinfacht. 

2.5.1.4 Datenverarbeitung - Parallel Processing und Data Mining 

Ein weiteres fruchtbares Anwendungsfeld besteht in der parallelen Datenverarbeitung 

(Parallel Processing). Vernetzte Gehirnzellen sind für die Auswertung verrauschter 

Daten, massive parallele Datenverarbeitung und für die Untersuchung 

versteckter Zusammenhänge (Data Mining) in Daten ideal geeignet. Vergleichbar 

hiermit sind die Bemühungen der künstlichen Intelligenz [Fayyad u.a., 1996]. 

2.5.1.5 Neuro-Interfaces 

Menschen, die ein teilweise durchtrenntes Rückenmark besitzen oder denen Körperteile 

fehlen, besitzen meist im Gehirn noch die vollen Fähigkeiten zur Kontrolle dieser 

Organe. Die Sensorinformationen und motorischen Steuersignale kommen nicht 

mehr an der für sie bestimmten Stelle an. Durch geeignete Platzierung von Elektroden 

können neue Signalpfade mittels einer Elektronik künstlich hergestellt werden 

und neue Lebensqualität durch diese ” 

Neuroimplantate” erzielt werden [Nicolelis, 

2001]. Probleme bereitet besonders die Schnittstelle zwischen den Zellen und der 

Elektronik [Rutten u.a., 2001]. Daher wurden Zell-Substrat-Adhäsionsvermittler, 

biokompatible Materialien und geeignete Beschichtungen untersucht [Blau, 1995], 

[Blau, 1999]. 

2.5.1.6 Biosensoren 

Ziegler beschreibt in einem Review-Artikel [Ziegler, 2000] die Anwendungen zellbasierter 

Systeme als Biosensoren. Neuronen können in pharmakologische Screeningverfahren 

einbezogen werden, um die Wirksamkeit von Substanzen testen zu können. 

Weiterhin eignen sich die Zellen als Sensoren für toxische Stoffe. Diese Klasse von 

Zellsensoren werden ” 

Cell Monitoring System“ (CMS) genannt und sind für spezielle 

Anwendungen, z.B. pH-Messungen bereits realisiert [Baumann u.a., 1999].


2.5.2 Gehirnschnitte 

Die Untersuchung der Funktionsweise verschiedener Gehirnregionen und deren Interaktion 

erfordert Gehirnschnitte, deren Struktur in zwei Dimensionen erhalten bleibt. 

Dadurch sind definierte Input/Output-Stellen von verschiedensten Gehirnregionen 

erreichbar. Durch die Präparation der Gehirnschnitte sterben die äußersten Zelllagen 

ab. Bei der Aufnahme und Stimulation der verbleibenden lebenden Neuronen 

sind die abgestorbenen Zelllagen im Weg und verschlechtern das Signal-zu-Rausch- 

Verhältnis. Heuschkel [Heuschkel u.a., 2001] beschreibt eine 3D-Elektrodenform, die 

mit räumlich strukturierten Elektrodenspitzen durch die tote Zelllage hindurchgehen 

und direkt an den lebenden Zellschichten ableiten. Weiterhin können durch die 

Dicke der Gehirnschnitte (engl.: slices) von einigen Zelllagen (Bereich 100 - 200 µm) 

die Neuronen schlecht mit Nährstoffen versorgt werden. Derzeit sind daher poröse 

Mikroelektrodenstrukturen in Entwicklung. 

[Fromherz, 2002] stellt ein Modell vor, dass Gehirnschnitte auf MEAs simuliert. 

Es basiert auf dem von [Hodgkin und Huxley, 1952] vorgeschlagenen Modell.

Teil II 

Materialien und Methoden

3 Materialien und Methoden 

3.1 Messaufbau 

Der Messaufbau dient der Aufnahme und Stimulation neuronaler Signale. Eine schematische 

Skizze der Apparatur ist in Abbildung 3.1 zu sehen. Das Zellsignal wird 

durch die Aufnahmeelektronik verstärkt und in einem Computer aufgenommen (oberer 

Teil der Abbildung). Die Reizung der Zellen findet durch die Stimulationselektronik 

statt (unterer Teil der Abbildung). In der Darstellung sind die Lebenserhaltungssysteme 

für die Zellen nicht dargestellt. Primär handelt es sich um eine Heizung, die 

physiologische Temperaturen um 37 ◦ C im Nährmedium konstant hält. Diese Geräte 

werden im Abschnitt 3.1.4 beschrieben. 

N 

N 

N 

N 8 A H I J H A H 

* = @ F = I I . E J A H 

) , = H J A 

A A 

- A J H @ A 

2 + 

F F K C I I ? D = J A H , ) = H J A 

Abb. 3.1: Schematische Darstellung des Messaufbaus (Erklärung im Text) 

In den folgenden Abschnitten werden die verwendeten Bauteile und Methoden 

beschrieben. Wichtigster Teil des Messaufbaus ist der Verstärker, der die schwer 

messbare neuronale Netzwerkaktivität so verstärkt, dass sie von einer Computer- 

Messkarte detektierbar ist. Dies wird im Teil ” 

Aufnahmelektronik” behandelt. Die 

Informationen werden von einer Analog-Digital-Wandlerkarte im PC aufgenommen 

und mit einer in C++ programmierten Software ausgewertet. 

Der Teil ” 

Stimulationselektronik”beschreibt die künstliche Reizung der Nervenzellen 

durch eine Digital-Analog-Wandlerkarte im PC, deren Signale über elektronische 

Schalter auf die einzelnen Elektroden eingekoppelt werden können. Die Steuerung 

der Stimulation findet synchron in Verbindung mit der Aufnahmesoftware statt.

3. Materialien und Methoden 28 

Auf die Lebenserhaltungssysteme wie z.B. Heizung wird im Abschnitt ” 

Peripherie” 

eingegangen. Die eigentliche Präparation der Zellen wird im Abschnitt ” 

Zellkulturen” 

beschrieben. 

3.1.1 Aufnahmeelektronik 

3.1.1.1 Verstärkereinheit 

Typische Analog-Digital-Wandlerkarten (A/D-Wandler) für den Computer zur Aufnahme 

von analogen Signalen können Spannungsbereiche zwischen -10 V bis +10 V 

aufnehmen. Mit einer Auflösung von 12-bit wird dieser Spannungsbereich linear in 

2 12 ( = 4096) Teile aufgeteilt. Dadurch können Spannungsdifferenzen von etwa 5 mV 

aufgelöst werden. Da typische neuronale Signale im Bereich weniger µV liegen, muss 

zwischen den Zellen und dem A/D-Wandler ein Verstärker die Spannungsamplitude 

vergrößern. Bei einem Verstärkungsfaktor von 1000-fach können Signale mit µV Stufen 

aufgenommen werden, wenn der A/D-Wandlerbereich zwischen -10 V und +10 V 

liegt. Maximale Signale von neuronalen Zellen auf MEAs liegen bei etwa 100 µV. 

Denkbar wäre also eine 10.000-fache Verstärkung, bei der das Signal zwischen -1 V 

und +1 V liegen sollte. Dann wäre allerdings eine Aufnahme von Herzmuskelzellen 

nicht mehr möglich, die ein deutlich stärkeres Signal von einigen mV abgeben. Aus 

diesen Gründen wird eine 1000-fache Verstärkung in dieser Arbeit realisiert. Durch 

Wahl eines A/D-Wandlers mit kleinerem Aufnahmebereich kann die Auflösung weiter 

verbessert werden. 

Aufgrund der im Literatur- und Theorieteil besprochenen Bandbreiteverkleinerung 

durch schlechtes Signal- zu Rauschverhältnis bei zu starker Verstärkung müssen 

mehrere Verstärkerstufen in einer Kaskadenschaltung von jeweils 10-facher Verstärkung 

hintereinandergeschaltet werden (siehe Abbildung 3.2). 

Abb. 3.2: Schematische Darstellung eines Verstärkerkanals. Das Eingangssignal (IN) 

wird mittels eines Instrumentenverstärkers (InstAmp IC2) 10-fach verstärkt 

und dem ersten Operationsverstärker (OpAmp IC1A) zugeführt, 

der mittels Rückkopplung der beiden Widerstände R1 und R2 das Signal 

wiederum 10-fach verstärkt. Der zweite Operationsverstärker (IC1B) führt 

das Signal durch die Rückkopplung (Widerstände R3 und R4) mittels 10- 

facher Verstärkung zur 1000-fachen Endverstärkung am Ausgang (OUT).


Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Recherche über die auf dem Markt erhältlichen 

Operationsverstärker durchgeführt. Die hier präsentierten und verwendeten 

Bausteine bieten die beste Übereinstimmung mit den im Theorieteil besprochenen 

Anforderungen in Relation zu Preis, Größe des Bausteins und einfacher praktischer 

Anwendbarkeit. 

Da besonders die erste Stufe wegen des noch sehr kleinen Signals von wenigen µV 

sehr rauschempfindlich ist, wird hier ein hochwertiger Instrumentenverstärker vom 

Typ INA2141 (Texas Instruments) eingesetzt. Instrumentenverstärker sind eine spezielle 

Unterart von Operationsverstärkern, die auf Messsignalverstärkung optimiert 

sind. Ausgegeben wird die Spannungsdifferenz zwischen den beiden Eingängen, d.h. 

intern findet eine Gegenkopplung statt. Einer der beiden Eingänge wird jeweils mit 

einer MEA-Elektrode verbunden, der andere Eingang mit einer für alle Kanäle gleichen 

Referenzelektrode, die in das Medium getaucht wird. Da jeder Baustein zwei 

Verstärker enthält, werden 32 Bausteine für 64 Kanäle verwendet. Das Eigenrauschen 

des Bausteins liegt unter 0,6 µV Spitze-Spitze [INA]. Der Eingangswiderstand 

ist größer als 10 10 Ω. Die Anstiegsgeschwindigkeit ist 4 V/µs. Alle Kriterien des 

Theorieteils sind somit für diesen Baustein erfüllt. 

Die zweite und dritte Stufe der Kaskade aus 10-fach Verstärkern wird durch 

einen vierfach-Operationsverstärker vom Typ TLC074 (Texas Instruments) realisiert. 

Durch Rückkopplung mit einer Kombination aus 1 kΩ- und 10 kΩ-Widerständen 

ist der Verstärkungsfaktor auf 10-fach eingestellt (siehe Abbildung 3.2). Das Eingangsrauschen 

liegt unter 1 µV Spitze-Spitze [TLC]. Der Eingangswiderstand ist 

größer als 10 10 Ω. Die Anstiegsgeschwindigkeit ist 4 V/µs. Auch bei diesem Baustein 

sind alle Kriterien erfüllt. 

3.1.1.2 Filtereinheit 

Elektrische Leitungen fangen elektrische Felder der Umgebung wie eine Antenne 

ein. Besonders die sinusförmige 50 Hz Wechselspannung und hochfrequente Signale 

der Computer könnten ” 

empfangen” werden. Diese Beeinflussungen aus der Umwelt 

überlagern sich mit dem Originalsignal als unerwünschtes Rauschen. Eine nachträgliche 

Signalverarbeitung in Form eines Filters kann solche Störeinflüsse minimieren. 

Um die Beeinflussung des schwachen Signals so gering wie möglich zu halten, 

werden in den Verstärkerstufen keine zusätzlichen Bauteile zur Signalverarbeitung 

integriert. Erst eine dem Verstärker nachgeschaltete Stufe modifiziert das Originalsignal, 

indem unerwünschte Frequenzen herausgefiltert werden. Dieses Vorgehen hat 

den großen Vorteil, mit den Verstärkerstufen auch Gleichstromsignale aufnehmen zu 

können. In der Filterstufe befinden sich zwei aktive Filter, die einen Bandpass-Filter 

formen (siehe Abbildung 3.3). Ein Bandpass-Filter wird durch die Zusammenschaltung 

eines Tiefpass- und eines Hochpass-Filters vom Typ Buttworth zweiter Stufe 

realisiert [Tieze und Schenk, 1989]. 

Ein Tiefpassfilter lässt tiefe Frequenzen passieren und schwächt hohe Frequenzen 

ab. Dies wird durch eine Kombination aus Widerständen und Kondensatoren 

realisiert. In Abbildung 3.3 ist auf der linken Seite ein Tiefpassfilter schematisch 

dargestellt. Das Signal durchläuft zwei Widerstände (R1 und R2) bis zum Eingang


Abb. 3.3: Schematische Darstellung eines Filterkanals. Das Eingangssignal (IN) 

durchläuft die Tiefpass-Filterstufe (IC1B) auf der linken Seite, gelangt zur 

Hochpass-Filterstufe (IC2B) auf der rechten Seite und wird am Ausgang 

(OUT) als gefiltertes Signal ausgegeben. 

eines Operationsverstärkers, der als Impedanzwandler arbeitet, d.h. die Verstärkung 

ist 1. Der hochfrequente Teil des Signals kann teilweise durch den Kondensator C2 

über Masse abfließen und wird dadurch nicht verstärkt. Der Teil des hochfrequenten 

Signals, der nicht über Masse abgeflossen ist, geht durch den Operationsverstärker 

und wird über den Kondensator C1 zwischen die beiden Widerstände R1 und R2 

zurückgeführt. Dadurch kann ein weiterer Teil des Signals über den Kondensator 

C2 über Masse abfließen. Insgesamt wird dadurch der niederfrequente Teil des Signals 

unbeeinflusst durchgelassen und der hochfrequente Teil zu einem großen Teil 

gefiltert. 

Der Ausgang des Tiefpassfilters ist mit dem Eingang eines Hochpassfilters (rechte 

Seite in Abbildung 3.3) verbunden. Dieser besteht aus zwei Kondensatoren (C3 

und C4) in Folge, die nur den hochfrequenten Teil des Signals passieren lassen. 

Analog zum Tiefpassfilter werden hohe Frequenzen ungehindert durchgelassen und 

tiefe Frequenzen durch den Widerstand R4 über Masse abgezweigt. 

Durch geeignete Wahl der Kondensatoren und Widerstände kann so ein Bandpassfilter 

realisiert werden. Die Parameter wurden mittels des Programms ” 

Filter Free” 

von Nuhertz Technologies so berechnet, dass Frequenzen von 500 Hz bis 10 kHz im 

Bandpass-Bereich liegen. In Abbildung 3.4 ist der berechnete Verlauf für die in der 

schematischen Filterschaltung angegebenen Kondensatoren dargestellt. 

Als Impedanzwandler wurden MC33274 Operationsverstärker (Motorola) mit jeweils 

vier Kanälen verwendet. Die Frequenzbereiche der Filter werden über die beiden 

Kondensatoren (C1, C2 bzw. C3, C4) in der Schaltung definiert. Durch Trennung 

der Kondensatoren von der Filterplatine (Operationsverstärker und Widerstände) in 

Form von Kondensator-Modulen, kann der Frequenzbereich nachträglich verändert 

werden. In jedem Experiment kann der Frequenzbereich für jeweils 16 Kanäle durch 

Einstecken eines entsprechenden Filtermoduls beliebig gewählt werden. 

3.1.1.3 Analog-Digital-Wandlung 

Zur Datenaufnahme im Computer wird ein A/D-Wandler DAQ-2204 (Adlink) verwendet. 

Er nimmt Spannungen von 64 Kanälen mit 1,2 MHz Summen-Samplingrate


Abb. 3.4: Berechneter Verlauf eines Butterworth-Tiefpass-Filters zweiter Stufe mit 

einer Grenzfrequenz von 10 kHz und eines nachgeschalteten Butterworth- 

Hochpass-Filters zweiter Stufe mit einer Grenzfrequenz von 100 Hz. Die 

Berechnungen wurden mit ” 

Filter Free” von Nuhertz Technologies durchgeführt. 

in wählbaren Bereichen von -0,1 . . . +0,1 V bis -10 . . . +10 V auf. Damit ergibt 

sich eine Samplefrequenz von 18 kHz pro Kanal. Bei einem eingestellten Spannungsbereich 

von -0,1 . . . +0,1 V nimmt die Karte bei einer Auflösung von 12-bit Spannungsdifferenzen 

von 5 µV auf. Dadurch ist das verstärkte Zellsignal mit einer hohen 

Auflösung detektierbar. Die Karte kann über eine dynamic link library-Systemdatei 

(DLL) aus jeder Programmiersprache gesteuert werden. 

Ein 68-poliges Very High Density Cable Interconnect-Kabel (VHDCI) verbindet 

die Messkarte mit der Filtereinheit oder dem Verstärker. Die Karte wird im sogenannten 

double-buffer-mode (Zwischenspeicher) betrieben, wodurch die Datentransferraten 

von 2,4 MB/s für alle 64 Kanäle problemlos vom Computer verarbeitet 

werden können. Das schematisches Datenflussdiagramm ist wie folgt: 

Elektrode → Analog-Digital-Wandler → Zwischenspeicher → Applikation 

3.1.2 Stimulationselektronik 

Es gibt verschiedene Wege die Zellen zu stimulieren: 

• Chemisch durch Neuropharmaka 

• Elektrisch durch patch clamp Technik 

• Elektrisch durch eine externe Mikroelektrode 

• Elektrisch durch die MEA-Elektroden 

Da elektrische Stimulation wegen ihrer Einfachheit besonders attraktiv ist, bietet 

es sich an, eine Stimulationselektronik für 60 Kanäle zu entwerfen. Ein Aktionspotential 

kann durch einen künstlichen Spannungspuls ausgelöst werden. Die Stimulationseinheit 

sollte in der Lage sein, eine oder mehrere Elektroden beliebig auswählen


zu können und ein Stimulationsmuster in Form einer Spannungsfolge auf den ausgewählten 

Elektroden ausgeben zu können. 

Die Erzeugung des Stimulationssignals geschieht durch eine Digital-Analog-Wandlerkarte 

(D/A-Wandler) vom Typ PD2-AO-32/16 (United Electronic Industries). Sie 

besitzt 32 Kanäle, die in 16-bit Auflösung Stimulationsmuster mit einer Datenrate 

von 100.000 Wertänderungen pro Sekunde (Samples/sec) beliebige Signalformen 

ausgeben kann. Um auf allen 60 Kanälen stimulieren zu können, werden zwei Karten 

des gleichen Typs eingesetzt. Die Steuerung der Karte übernimmt eine in Visual 

Studio (Microsoft) programmierte Software. 

Zur Auswahl der zu stimulierenden Elektroden des MEAs werden Entkopplungsschalter 

ADG715 (Analog Devices) eingesetzt. Bei der Stimulation ergibt sich das 

prinzipielle Problem, dass die Stimulation über die gleichen Elektroden auf dem 

MEA erfolgt, wie die Aufnahme. Man muss also die Leitungen der Stimulation von 

den Leitungen der Aufnahme abkoppeln, solange nicht stimuliert wird. Ansonsten 

würden sich die verlängerten Signalwege und Eigenschaften der Stimulationselektronik 

durch ein viel größeres Rauschen in der Aufnahmeleitung negativ auswirken. 

Ideal wäre eine galvanische Trennung der beiden Kanäle. In dieser Arbeit werden 

elektronische Schalter sehr nahe den Elektrodenkontakten platziert, die über den 

PC einund ausgeschaltet werden können (siehe Abbildung 3.1 unterer Teil). Diese 

Bausteine werden mit Modulplatinen auf der ersten Stufe des Verstärkers aufgesetzt. 

Die Schalter werden per seriellem I 2 C-Bus 1 gesteuert. 

Der Baustein wird über zwei Kontrollleitungen programmiert. Eine der beiden Leitungen 

ist eine Taktleitung (SCL), die andere eine Datenleitung (SDA). Übertragen 

wird immer ein Byte, also 8 Bits in serieller Folge. Eine Programmierfolge besteht 

aus mehreren aufeinanderfolgenden Bytes. Die Datenübermittlung wird durch eine 

Start-Sequenz begonnen und durch eine Stop-Sequenz beendet. Die genaue Spezifikation 

ist in Abbildung 3.5 dargestellt. 

Abb. 3.5: Programmierung des ADG715 über den seriellen I 2 C-Bus. Nach der Start- 

Bedingung wird eine für einen Schalterbaustein spezifische Identifikationsadresse 

übertragen, der ein Datenbyte folgt. Jeder Baustein beinhaltet 8 

Schalter. Jedes Bit des Datenbytes repräsentiert einen Schalter. Sobald die 

Stop-Bedingung nach dem Datenbyte übertragen ist, schaltet der Baustein 

die soeben übertragene Schalterkonfiguration. 

1 http://www.semiconductors.philips.com/buses/i2c/


3.1.3 Charakterisierung der Elektronik 

3.1.3.1 Transferfunktionen 

Die Frequenzabhängigkeit der Verstärker wird durch die Transferfunktion beschrieben. 

Gemessen wird der Verstärkungsfaktor in Abhängigkeit von der Frequenz. Ein 

Netzwerkanalysator vom Typ R3753AH (Advantest) wird durch ein Programm 2 unter 

der Programmierumgebung VEE Pro 6.0 (Agilent) ferngesteuert. Frequenzen von 

5 Hz bis 2 MHz werden mit einem Sinussignal durchgefahren und der Verstärkungsfaktor 

durch einen Vergleich von eingespeister Leistung zu ausgegebener Leistung 

bestimmt. Eine schematische Darstellung ist in Abbildung 3.6 zu sehen. Hierzu sind 

der Ausgangskanal 1 des Netzwerkanalysators mit dem Elektronik-Eingang und der 

Ausgangskanal 2 des Analysators mit seinem Referenzeingang verbunden. Der Eingangskanal 

des Netzwerkanalysators ist mit dem Ausgang der Elektronik gekoppelt. 

Der Netzwerkanalysator vergleicht die ausgegebene Leistung (Referenzeingang) mit 

der durch die Elektronik verstärkten Leistung. 

Netzwerkanalysator 

Ausgang 

1 2 

Eingang 

Ref 

Eingang Ausgang 

Elektronik 

Abb. 3.6: Schematischer Aufbau zur Messung der Transferfunktion einer Elektronik 

mit einem Netzwerkanalysator. Erklärung im Text. 

3.1.3.2 Rauschen und Zeitcharakteristiken 

Die obere Rauschgrenze wird mit einem Oszilloskop vom Typ LT264M (LeCroy) 

bestimmt. Durch Abmessung der Peak- zu Peakspannung V pkpk des Verstärkerausgangs 

und Einbeziehung des Verstärkungsfaktors VF aus der Transferfunktion kann 

eine obere Grenze des Rauschens bestimmt werden. 

V Rauschen ≤ V pkpk 

(3.1) 

VF 

Weitere wichtige Eigenschaften sind die Zeitcharakteristiken der Elektronik. Fragestellungen, 

wie schnell Schalter programmiert werden können und wann die Aufnahmeelektronik 

nach einem Stimulationspuls wieder störungsfrei funktioniert, werden 

mit dem Oszilloskop dokumentiert. 

2 Das Programm wurde von Herrn Dr. Hartmut Stadler programmiert und zur Verfügung gestellt.


3.1.4 Peripherie 

In diesem Abschnitt wird die Peripherie des Messaufbaus beschrieben. Eine schematische 

Darstellung der verwendeten Komponenten ist in Abbildung 3.7 gezeigt. 

Hierzu gehören: 

1. Gehäuse der Elektronik als Schutz vor mechanischen Einflüssen und als elektrische 

Abschirmung (siehe Abbildung 3.7 Bereich 2) 

2. Elektromechanische Kopplung des MEAs mit der Elektronik (nicht in der Abbildung 

dargestellt) 

3. Materialien und Geräte zur Umweltkontrolle 

• Automatisierte Mediumversorgung (siehe Abbildung 3.7 Bereich 1 + 2) 

• Heizung (siehe Abbildung 3.7 Bereich 3) 

3.1.4.1 Gehäuse 

Das Gehäuse muss mehrere Funktionen erfüllen (siehe Abbildung 3.7 Bereich 2): 

• Einfacher MEA-Wechsel: Um Routineuntersuchungen an MEAs durchzuführen, 

muss ein schneller und einfacher Austausch der Proben möglich sein. 

Gleichzeitig muss eine gute elektrische Kontaktierung gewährleistet sein. 

• Elektrische Abschirmung: Die Experimente sollten gut vor elektromagnetischer 

Strahlung geschützt sein. 

• Temperaturregelung: Das MEA muss auf physiologischen Temperaturen gehalten 

werden. 

• Nährstoff- und Pharmakaversorgung: Das Gehäuse sollte die Möglichkeit einer 

Zufuhr von Flüssigkeiten in das MEA bieten. 

• Mechanischer Schutz: Die Messungen sollten durch leichte Stöße und Vibrationen 

nicht gestört werden. 

3.1.4.2 Mechanoelektrische Kopplung 

Die Goldkontaktstellen der MEAs müssen mit der Elektronik verbunden werden. 

Denkbar sind Metallzungen, die auf die Elektroden pressen [MCS]. Diese Verbindung 

kann jedoch unzuverlässig sein, da die Auflagefläche der Abgreifstifte sehr 

gering ist. Kleine Partikel und Staubkörner können die Verbindung erheblich stören. 

Einen alternativen Ansatz bieten anisotrope Leitgummis (elastomeric connectors). 

Es handelt sind um Silikonstreifen, die schichtweise aus unbehandeltem und mit


Bereich 1: automatisierte Versorgung 

Medium Pumpe Ventil 

Bereich 2: Flusskammer 

Gehäuse 

Flusskammer 

Zellen 

MEA 

37,0 o 

C 

Abfall 

Bereich 3: Heizung 

Abb. 3.7: Schematische Darstellung der Peripherie (Erklärung im Text)


Abb. 3.8: Ein Leitgummi besteht aus abwechselnd leitenden (schwarze Bereiche) und 

nicht-leitenden Bereichen (weisse Bereiche). 

Graphit oder Goldkügelchen behandeltem Material hergestellt werden (siehe Abbildung 

3.8). Dadurch entsteht ein Wechsel von leitenden und nichtleitenden Silikonschichten. 

Werden diese Gummis auf die Kontaktstellen gepresst, ergibt sich eine 

wesentlich größere Kontaktfläche. 

Verwendet werden ” 

s-type” Leitgummis (Shin Etsu Polymers) 3 . Die Abmessungen 

wurden auf die Elektrodenflächen des MEAs abgestimmt. Als pitch, d.h. als Abstand 

zwischen leitendem und nicht-leitendem Material, standen 0,05 mm und 0,25 mm 

zur Verfügung. 

3.1.4.3 Heizung 

Neuronen aus Säugetieren benötigen Körpertemperatur zum Überleben. Während 

der Kultivierung liegen die Zellen in einem CO 2 -Brutschrank (Biosafe eco, Integra 

Biosciences), in dem die Temperatur konstant auf 37,0 ◦ C und der CO 2 -Gehalt zur 

pH-Pufferung auf 5% gehalten wird. Während der Experimente befinden sich die 

Kulturen außerhalb des Brutschranks im Verstärkergehäuse. Während dieser Zeit 

könnten die Kulturen zu kalt werden und die Zellen absterben. Deswegen werden sie 

während der gesamten Messzeit mit einer Heizung auf Körpertemperatur gehalten 

(siehe Abbildung 3.7 Bereich 3). Zur Stabilisierung des pH-Wertes im Kulturmedium 

muss ein CO 2 -unabhängiges Puffersystem zum Einsatz kommen. 

Ein Regelkreis hält die Temperatur konstant [Blau, 1999]. Die schematische Schaltung 

ist in Abbildung 3.9 dargestellt. Ein Leistungs-Operationsverstärker gibt Spannungen 

abhängig von der Differenz der Spannung zwischen Soll- und Ist-Eingang aus. 

Dadurch wird die Heizung bei zu niedriger Temperatur mit einem Strom solange 

durchflossen, bis die Temperatur den Soll-Wert erreicht hat. 

3.1.4.4 Flusskammer 

Um die neuronalen Zellen mit Nährstoffen und Neuropharmaka zu versorgen, muss 

Nährmedium zugeführt werden. Prinzipiell können die Zellen mit einer Eppendorf- 

Pippette alle zwei Tage manuell gefüttert werden. Um diesen sehr zeitaufwendigen 

Prozess zu vereinfachen, bietet es sich an, Zellen in einer Flusskammer zu kultivieren, 

3 Die Leitgummis wurden freundlicherweise als Proben von der Firma MH&W und der Firma Shin 

Etsu Polymers bereitgestellt.


Abb. 3.9: Schematische Schaltung der Heizungssteuerung. Die beiden Potentiometer 

arbeiten als Spannungsteiler. Daher sind keine Angaben über Widerstände 

nötig. In dieser Arbeit wurden Potentiometer von 0 bis 100 Ω verwendet. 

durch die automatisiert Medium ausgetauscht werden kann (siehe Abbildung 3.7 

Bereich 1 und 2). 

3.1.5 Software 

Für die Datenaufnahme und -analyse wird eine Software benötigt. Als Programmierumgebung 

wurde Visual Studio (Microsoft) verwendet. Die Software muss folgende 

Eigenschaften erfüllen: 

• Aufnahme 

– Datenaufnahme mit der maximalen Datenrate der AD-Karte 

– Abspeicherung der Daten auf Festplatte 

– Darstellung einer Übersicht der aktuell aufgenommenen Daten 

• Stimulation 

– Ausgabe von Stimulationsmustern auf bis zu 64 Kanälen 

– Der Start der Stimulation sollte durch die Aufnahmesoftware auslösbar 

sein 

3.2 Zellkulturen 

3.2.1 Chemikalien und Medien 

3.2.1.1 Medien 

Zur Zellkultivierung wurden MEM-Medium (SIGMA), Neurobasal (Gibco 10888- 

022) und Dulbecco’s MEM (Gibco 10567-014) eingesetzt. Es handelt sich um vorgefertigte 

Nährstoffmischungen, die aus Aminosäuren, Salzen, Vitaminen, sonstigen


Substanzen und einer anorganischen Puffersubstanz (NaHCO 3 ) bestehen. Als Serum 

wurden Pferdeserum (Gibco 16050-122), fötales Kälberserum (Gibco 10270-098, 

LOT 40Q3614K) und die Serum-Ersatz- und Ergänzungsmedien B27 (Gibco 17504- 

044) und F12 (Sigma) verwendet. Der physiologische pH-Wert von 7,4 wurde durch 

Zugabe von NaOH nach der Mischung von Medium, Serum und sonstigen Zusätzen 

mit einer pH-Sonde vom Typ 252 (Testo) für den Einsatz im Inkubator eingestellt. 

Ein Wirkungsvergleich der verschiedenen Medien wurde mit 24-fachen Multischalen 

(24-Well, Falcon) durchgeführt, in deren Schalen unterschiedliche Medien verteilt 

wurden. Nach einigen Tagen in Kultur wurden mit dem Mikroskop Aufnahmen der 

Zell-Netzwerkstrukturen gemacht. 

Durch Einsatz einer HEPES-Pufferlösung 4 kann ein physiologischer pH-Wert auch 

außerhalb des Inkubators stabilisiert werden. Hierzu wird dem Medium HEPES in 

einer Konzentration von 10 mM zugegeben und mittels einer pH-Sonde der physiologische 

Wert 7,4 durch Zugabe von NaOH eingestellt. 

3.2.1.2 Antibiotika 

Durch Zugabe einer Penicillin- / Streptomycin-Mischung können die Kulturen auch 

unter unsterilen Bedingungen gehalten werden. Dazu werden 100 µg/ml Streptomycin 

und 100 U/ml Penicillin gemischt und im Medium gelöst. Penicillin bleibt 3 Tage 

in wässriger Lösung aktiv. Zu beachten ist jedoch, dass diese Mischung nur gegen 

Bakterien, nicht jedoch gegen Pilzsporen aktiv ist [Lindl, 2000]. 

3.2.2 Präparation 

3.2.2.1 Dissoziierte Neuronen 

Zur Präparation der neuronalen Zellen werden 9 bis 11 Tage alte Embryos (E9 

- E11) aus Hühner-Eiern verwendet 5 . Das steril entnommene Embryogehirn wird 

vorsichtig zerteilt und für 10 Minuten in einer Trypsin-Lösung (0,25 % Trypsin (Sigma), 

0,1 % EDTA (Fluka) auf 20ml Medium (Neurobasal, D-MEM oder MEM)) 

im Brutschrank bei 37˚C Temperatur und 5 % CO 2 -Gehalt in einem Zentrifugenröhrchen 

inkubiert. Die in der Zellsuspension befindlichen Neuronen werden von der 

Trypsin-Lösung durch 5-minütiges Zentrifugieren auf Stufe 5 getrennt. Das Gewebe 

wird mit einer langen Pipettenspitze abgesaugt und in ein frisches Röhrchen mit 

Medium überführt. Der Zellhaufen wird in einzelne Neurone mit einer feuerpolierten 

Pasteurpipette durch Einsaugen und Herausdrücken mechanisch separiert. Die 

Zelldichte wird durch Auszählen in einer Neubauer Zählkammer und Zugabe von 

Medium auf einen gewünschten Wert gebracht (meist etwa 10 5 Zellen/ml). Die Zellsuspension 

wird auf Kulturschalen und MEAs mit einer Eppendorfpipette zu je 50 µl 

verteilt und mit 2 ml Medium aufgefüllt. Nach 4 – 5 Tagen werden durch Absaugen 

von 1 ml Medium und Hinzugeben von 1 ml frischem Medium die Zellen mit neuem 

Medium versorgt. 

4 HEPES: N-2-Hydroxyethylpiperazin-N’-2-Ethansulfonsäure 

5 Z.B. E9: Es handelt sich um Embryos, die nach Befruchtung 9 Tage bebrütet worden sind. E11 

= 11 Tage.


3.2.2.2 Herzmuskelzellen 

Zur Präparation der Herzmuskelzellen werden E7-Embryos aus Hühner-Eiern verwendet. 

Das schlagende Herz wird mit einem Binokular-Mikroskop gesucht und mit 

einer Pinzette und einem Skalpell vom restlichen Körper getrennt. Übrig gebliebenes 

Blut und Fremdkörper werden mit einer Phosphat-gepufferten Saline-Lösung (PBS) 

abgespült. Das in mehrere Segmente geteilte Herz wird mit einer Trypsin-Lösung 

(0,25 % Trypsin (Sigma), 0,1 % EDTA (Fluka) auf 20ml MEM-Medium) im Brutschrank 

bei 37˚C Temperatur und 5 % CO 2 Gehalt in einem Zentrifugenröhrchen 

für 15 Minuten inkubiert und anschließend für 5 Minuten bei Stufe 5 zentrifugiert. 

Der Zellhaufen wird aufgesaugt und in frisches Medium gegeben. Die Dichte der 

Herzmuskelzellen wird durch Auszählen in der Neubauer Zählkammer und Zugeben 

von Medium auf einen gewünschten Wert von etwa 5×10 5 Zellen/ml gebracht. Die 

Zellsuspension wird in 50 µl Portionen auf Kulturschalen ausplattiert und mit 2 ml 

Medium aufgefüllt. Täglich werden durch Austausch von 1 ml Medium mit frischem 

Medium die Herzmuskelzellen mit neuen Nährstoffen versorgt. 

3.3 Sonstiges 

3.3.1 Herstellung der Platinen 

Für die Herstellung der Platinen werden handelsübliche 1,5 mm Epoxy-Kupfer- 

Platinen (Conrad) mit einer Photolackschicht verwendet. Nach 5-minütiger Belichtung 

mit einem Dia-Betrachtungsgerät werden die Platinen in einem Fotoentwickler 

(Conrad) entwickelt. Nachdem sich die belichteten Bereiche komplett abgelöst haben, 

wird die Platine in ein Ätzbad (Conrad) gelegt. Zur Vergütung der Leiterbahnen 

wird die Platine in ein Zinnbad gelegt und anschließend mit Lötlack besprüht. 

Die Platinen wurden teilweise von Herrn Schlägel in der Elektronikwerkstatt der 

Universität Kaiserslautern hergestellt. 

Die Bestückung der SMD-Platinen (Filtereinheit, Stimulationseinheit) erfolgte 

mit Lötpaste (Conrad) und einem Lötkolben (Weller). Die Verstärkerplatinen wurden 

von Herrn Stücki in der Elektronikwerkstatt der Universität Kaiserslautern mit 

einem halbautomatischen SMD-Heißluft-Bestückungsgerät gelötet. Zur Entfernung 

von Flussmitteln legte Herr Stücki die Platinen in ein Ultraschallbad. 

Durchkontaktierungen und Dual-Inline-Package (DIP)-Bausteine wurden mit einem 

Lötkolben (Weller) und Lötzinn (Staniol) durchgeführt bzw. aufgelötet.

Teil III 

Experimentelle Durchführung

4 Durchführung, Experimente und 

Ergebnisse 

4.1 Messaufbau 

4.1.1 Aufnahme- und Stimulationselektronik 

Das zweiseitige Platinenlayout der Aufnahmeelektronik wurde mit der Software Eagle 

4 (CadSoft) entworfen. Die Layouts zur Fotoreproduktion sind im Anhang abgebildet. 

Die Bausteine sind per surface mount device-Technik (SMD) verlötet worden. 

Die erste Verstärkerstufe besteht aus einer einzelnen quadratischen Platine für alle 

64 Kanäle (Abbildung 4.1A). Die quadratische Aussparung in der Mitte, unter der 

sich das MEA befindet, ermöglicht ein gleichzeitiges Mikroskopieren während der 

Messungen. Auf jeder Seite befinden sich acht INA2141 Bausteine. Die Stufen 2 und 

3 sind auf einer einzelnen Platine zu jeweils 16 MEA-Kanälen mit Bausteinen vom 

Typ TLC074 zusammengefasst, die auf den Ausgang der ersten Stufe gesteckt wird 

(Abbildung 4.1B). Die komplette Verstäkereinheit ist in Abbildung 4.1C dargestellt. 

A) Stufe 1 (10x) B) Stufe 2 & 3 (100x) 

C) Verstärker 

4x 

Abb. 4.1: Fotos der Verstärkereinheiten. A) Erste Verstärkerstufe. B) Ein Modul 

der zweiten und dritten Verstärkungsstufe. C) Zusammengebaute Verstärkerplatine.

4. Durchführung, Experimente und Ergebnisse 42 

Die Ausgänge der dritten Stufe sind über ein Flachbandkabel (Conrad) mit einem 

68-poligen SCSI-3 Stecker (79059, Molex) verbunden, der am Gehäuse des Verstärkers 

befestigt ist. Die verbleibenden 4 Adern des 68-poligen Kabels werden für 

Spannungsversorgung und Masse genutzt. 

Die Entkopplungsschalter der Stimulationseinheit sind auf einer separaten Platine 

mit ebenfalls 16 Kanälen pro Platine zusammengefasst (Abbildung 4.2). Jeder 

ADG715-Baustein ist ein Thin Shrink Small Outline Package-SMD-Chip (TSSOP). 

Dies ist eine extrem kleine Bauform und ermöglicht eine sehr nahe Platzierung an 

den Elektrodenkontakten. Da eine halbautomatische Bestückung der Platinen mit 

TSSOP-Bausteinen aufgrund sehr kleiner Kontaktabstände nicht möglich ist, wurde 

mit einer dünnen Spritze auf jedes SMD-Beinchen ein Tropfen SMD-Lötpaste (Conrad) 

gegeben. Dann wurde der Baustein mit einer Pinzette (Conrad) auf der Platine 

platziert und festgehalten. Mit einem Lötkolben (Weller) konnten dann die Beine 

auf der Platine festgelötet werden. In Abbildung 4.2 ist ein 16-Kanal-Modul einzeln 

(rechts) und auf die Verstärkerstufe gesteckt (links) abgebildet. 

Abb. 4.2: Links: Ein Stimulationsmodul ist auf die Basisplatine gesteckt. Rechts: 

Foto der 16-Kanal Entkopplungsschalterplatine. In der Mitte befinden sich 

die beiden 8-Kanal-Schalterbausteine vom Typ AFDG715. Die beiden 16- 

poligen Buchsenleisten sind die Ein- und Ausgänge. Die beiden 2-poligen 

Buchsenleisten dienen der Spannungsversorgung und als Steuerleitungen. 

Die resultierende ” 

Sandwich-Platine”, bestehend aus den drei Verstärkerstufen 

und der Stimulationselektronik, wird in das Gehäuse geschraubt (Abb. 4.3). 

Abb. 4.3: Die Aufnahme- und Stimulationselektronik sind in einem Metallgehäuse 

zusammengefasst.


4.1.2 Filtereinheit 

Die Filtereinheit besteht aus einer zweiseitigen SMD-Basisplatine, die Impedanzwandler 

und Widerstände enthält, und drei aufzusteckenden Filtermodulen, auf die 

die frequenzbestimmenden SMD-Kondensatoren aufgelötet werden (siehe Abbildung 

4.4). Falls nicht anders angegeben, sind Filtermodule für Frequenzbereiche von 100 

Hz bis 10 kHz eingebaut. 

Abb. 4.4: 16 Kanal Filtermodul. Die Buchsenleiste links oben ist der Signaleingang. 

Es folgen oben zwei Steckmodule, die für die Eigenschaften des Tiefpass- 

Filters zuständig sind. Unten befindet sich das Steckmodul für die Eigenschaften 

des Hochpass-Filters. Der Ausgang ist die oben rechts schräg 

stehende Buchsenleiste. 

Die Filterstufe ist in einem separaten 19“ Modul eingebaut und wird über 68- 

polige SCSI-3 Steckkontakte (Molex) mit der Verstärkereinheit und der Analog- 

Digital-Wandlerkarte verbunden. Die Pinbelegung entspricht dem Multichannelsystems 

Standard. Dadurch kann die Filterstufe auch mit einem Multichannelsystems- 

Gerät eingesetzt werden. 

Abb. 4.5: Die 64 Filterkanäle befinden sich in einem 19” Einschubgehäuse. Der Einund 

Ausgang wird durch ein SCSI-Kabel verbunden.


4.1.2.1 Gehäuse 

Um einen einfachen Wechsel der MEAs zu ermöglichen besteht das Gehäuse aus 

zwei Teilen: einer Basisplatte und einem Elektronikgehäuse. Als Basisplatte dient 

eine Aluminiumplatte (80 × 80 mm 2 ) von 4 mm Dicke, in die eine quadratische Vertiefung 

mit den Maßen 50 × 50 mm 2 mit einer Tiefe von 3 mm eingefräst ist. In diese 

Vertiefung ist eine Heizspirale auf einer 0,5 mm dicken Elektronik-Platine (Epoxyd- 

Harz) in ein Wärmeleitpad (Conrad Elektronik, Gap Pad, 189203-62) eingebettet. 

Im Zentrum der Heizspirale befindet sich ein Temperatursensor LM45 (Conrad Elektronik, 

SMD LM45 SOT23, 144827-62). Die Maße eines MEAs sind (49 × 49 × 1 

mm 3 ), der genau in die verbleibende Vertiefung passt. Eine schematische Darstellung 

ist in Abbildung 4.6 auf der linken Seite zu sehen. Diese Aluminiumplatte ist in 

einer PVC-Platte eingelassen, die die Abmessungen des Elektronikgehäuses besitzt. 

Abb. 4.6: Links: Die Alu-Basisplatte, in die das MEA eingelegt wird, enthält auch 

die Heizung und den Temperatursensor. Rechts: Die schwarzen Leitgummis 

sind quadratisch angeordnet und werden auf das MEA gelegt, so dass 

sie genau auf den Elektrodenflächen liegen. 

Das Elektronikgehäuse besteht aus 2 mm VA-Stahl. Es wurde in der Metallwerkstatt 

der Universität Kaiserslautern durch Biege- und Stanztechniken gefertigt (Abbildung 

4.3). Das Gehäuse stellt einen Faradayschen Käfig dar, der vor elektromagnetischer 

Strahlung schützt. In der Ober- und Unterseite befindet sich jeweils ein 

rechteckiges Loch von 50×50 mm 2 , durch die das MEA kontaktiert werden kann. Die 

Kontaktierung erfolgt durch Leitgummis, die auf den Elektrodenflächen des MEAs 

liegen (siehe Abbildung 4.6 rechte Seite). 

4.1.3 Charakterisierung der Elektronik 

4.1.3.1 Verstärkungsfaktor 

Jeder einzelne Kanal des Verstärkers wurde auf der Eingangsseite mit einem Frequenzgenerator 

(Philips) verbunden und dessen verstärktes Signal auf der Ausgangsseite 

mit einem Oszilloskop (LeCroy) verglichen. Als Referenzfunktion diente ein 

Sinus-Signal mit 1 kHz Frequenz. Sowohl Eingangs- als auch Ausgangssignal wurden 

per nichtlinearem Kurvenfit mit Origin (OriginLabs) mit einer Sinus-Funktion


angefittet (siehe Abbildung 4.7). Der Verstärkungsfaktor errechnet sich durch Quotientenbildung 

der Amplitudenparameter des Fits von Ein- und Ausgangssignal. 

Abb. 4.7: Beispiel eines nichtlinearen Sinus-Kurvenfits des Ein- und Ausgangssignals 

eines Verstärkerkanals. Der Fit wurde mit Origin 7.0 Professional der Firma 

OriginLab durchgeführt. 

Im Mittel ergab sich eine Verstärkung vom Faktor 1038 ± 44. Die 64 Kanäle sind 

in Abbildung 4.8 graphisch zusammengefasst. Die Schwankung von ca. 4% kann 

durch die Ungenauigkeiten in den Widerständen und Kondensatoren der Elektronik 

erklärt werden. Um eine ideale vergleichbare Verstärkung auf allen Kanälen erreichen 

zu können wird eine Normierung auf Softwareebene durchgeführt. Hierzu wird eine 

Metallplatte statt eines MEAs in den Verstärker gelegt und ein Kanal wird als 

Referenzkanal (= 100% Verstärkung) gesetzt. Die restlichen Kanäle werden auf den 

Verstärkungsfaktor des Referenzkanals skaliert. 

Die Transferfunktionen der einzelnen Kanäle wurden mit dem Netzwerkanalysator 

aufgenommen. Die Bandbreite wurde von 5 Hz bis 2 MHz eingestellt und in 1201 

Schritten linear durchgefahren. Da alle Kanäle annähernd gleiches Verhalten zeigten, 

sind alle 64 Transferfunktionen in Abbildung 4.9 zusammengefasst. Man erkennt 

gut den linearen Bereich in den Durchlassfrequenzen von 300 Hz bis 10 kHz und 

den starken Abfall außerhalb dieser Frequenzen. Der Filter zeigt den berechneten 

Frequenzverlauf nach Abbildung 3.4. 

Für die 50 Hz Netzfrequenz ergibt sich ein Wert von etwa -40 dB. Dies ist eine 

Abschwächung des Signals um den Faktor 100. Auf der hochfrequenten Seite ist


Abb. 4.8: Verstärkungsfaktoren der 64 Kanäle des Verstärkers. 

eine Abschwächung um den Faktor 100 ab etwa 100 kHz erreicht. Bereits bei etwa 

300 kHz wird das Signal um den Faktor 1000 abgeschwächt. 

Abb. 4.9: Transferfunktionen der Filtereinheit im 19”-Gehäuse. Gezeigt sind jeweils 

die Mittelwerte über die 16 Kanäle der vier Filtermodule. 

In den Frequenzen bis 100 Hz erkennt man Abweichungen im Signal zwischen 

den einzelnen Filtermodulen. Der Netzwerkanalysator wurde bei der Aufnahme der 

Transferfunktionen mit einem Frequenzparameter von 100 Hz betrieben. Dadurch 

kann der Netzwerkanalysator keine Frequenzen unterhalb der eigentlichen Analysatorbandbreite 

auflösen. Durch Umstellung der Einstellung auf 10 Hz konnte diese 

Vermutung bestätigt werden. Dies ist in Abbildung 4.10 dokumentiert.


Abb. 4.10: Untersuchung der Frequenzparameter des Netzwerkanalysators. Frequenzen 

unter 10 Hz sind wegen der Netzwerkanalysator-Filtereinstellung 

nicht messbar. 

Die Schwankungen in der Messkurve liegen an den Einstellungen des Netzwerkanalysators. 

Eine niedrigere Analysatorbandbreite zeigt eine detailliertere Kurve ohne 

starke Schwankungen. Da die untere Grenze des Netzwerkanalysators bei 5 Hz liegt, 

machen Untersuchungen mit diesem Gerät bei einer Filtereinstellung von 10 Hz nur 

im Bereich von 10 Hz bis 10 kHz Sinn. 

4.1.3.2 Übersprechen 

Ein entscheidender Faktor bei der Messung von elektrischen Signalen ist die gegenseitige 

Beeinflussung elektronischer Komponenten, das sog. Übersprechen (crosstalk). 

Hierzu wurde auf einen Kanal eine sinusförmige Welle gegeben und auf verschiedenen 

Verstärkerausgängen die Aktivität mit dem Oszilloskop gemessen. Ein Beispiel 

einer solchen Messung ist in Abbildung 4.11 zu sehen. Auf Kanal 13 wurde das Sinussignal 

eingespeist. Die anderen Kanäle liegen auf Masse. Alle Kanäle zeigen die 

typische Transferfunktion. Allerdings sind die Signale der auf Masse liegenden Leitungen 

wesentlich schwächer. Der Unterschied zwischen Kanal 13 und den Kanälen 

12, 14, 15, 16 liegt bei etwa -60 dB, was einer Abschwächung des Signals um den 

Faktor 1000 entspricht. Da relativ starkes Rauschen durch die hohen Impedanzen 

des MEAs erwartet werden, sollte ein Übersprechen in der Messung nicht bemerkbar 

sein. Bis 100 Hz sind schwache Schwingungsphänomene zu erkennen, die ebenfalls 

unter -60 dB liegen.


Abb. 4.11: Untersuchung des Übersprechens eines Kanals gegenüber den anderen. 

Auf Kanal 13 wurde eine Sinusförmige Wellenform gelegt. 

4.1.3.3 Rauschen 

Rauschen kann zwei Ursprünge haben: 

• Elektronik: Bausteine und Leitungen auf der Platine erzeugen ein sog. Eigenrauschen. 

• Gesamtsystem: Störungen durch eine hohe Impedanz, die durch MEA, Zuleitungen 

und Medium hervorgerufen wird. 

Das Verstärker-Eigenrauschen wurde durch ein Verbinden der Masseleitung mit 

den Eingängen des Verstärkers bestimmt (siehe Abbildung 4.12 linke Seite). Für die 

Untersuchung des Rauschens des Gesamtsystems wurde ein MEA mit MEM-Medium 

gefüllt, eine Referenzelektrode in das Medium gegeben und mit der Masseleitung des 

Verstärkers verbunden. Das gefüllte MEA wurde in den Verstärker gesetzt und das 

Ausgangssignal auf dem Oszilloskop gemessen (siehe Abbildung 4.12 rechte Seite). 

Zwischen direktem Kurzschluss und Messung mit Medium liegen etwa 3 mV Differenz. 

Dies lässt sich durch die hohen Leitungswiderstände des MEAs und des Mediums 

erklären. Die Gesamtrauschspannung mit MEA und Medium Peak-to-Peak 

ist 14 mV. Bei einer ca. 1000-fachen Verstärkung liegt das Rauschen bei etwa 14 µV. 

Im Vergleich zu einem erwarteten Zellsignal von max. 100 µV ergibt sich ein Signalzu 

Rauschverhältnis von 7:1. Zellsignale sollten deutlich erkennbar sein.


Abb. 4.12: Untersuchung des Rauschens des Verstärkersystems. Links: Masseleitung 

und Elektrode sind direkt verbunden. Rechts: In das Messgerät 

wurde ein MEA mit Medium eingelegt. Das Medium wurde mit Masse 

über eine in das Bad getauchte Elektrode kontaktiert. 

4.1.3.4 Schaltverhalten der Stimulationselektronik 

Bei gleichem Experimentieraufbau wie bei der Rauschanalyse wird eine Elektrode 

mit einem Funktionsgenerator verbunden. Es werden bipolare sinusförmige Spannungspulse 

in Abständen von 1 Sekunde auf die Elektrode gegeben. Dadurch kann 

die Reaktion der Verstärkerelektronik auf die hohen Spannungspulse von bis zu 

800 mV untersucht werden. Das resultierende Bild ist in Abbildung 4.13 zu sehen. 

Es entsteht ein Stimulationsartefakt. 

Abb. 4.13: Stimulationsartefakte entstehen durch die Aufladung von Kondensatoren 

in der Verstärkerschaltung. Der Artefakt beeinträchtigt die Messung nach 

der Stimulation.


Durch die Stimulationspulse werden innerhalb der Verstärkerelektronik Kondensatoren 

aufgeladen, die sich wieder entladen müssen, bevor die Aufnahme fortgesetzt 

werden kann. Diese Totzeit nennt man Stimulationsartefakt. Sie kann durch eine 

Übersteuerung des Verstärkers mit einem Pulsgenerator gemessen werden. Auf den 

Eingang des Verstärkers wird ein Puls von bis zu 1 V gegeben. Durch die 1000- 

fache Verstärkung übersteuert der Verstärker und geht in die Sättigung. Nachdem 

der Stimulationspuls beendet ist, sollte der Verstärker sofort wieder in die Nulllage 

übergehen. Durch Aufladungen der Kondensatoren im Verstärker geht der Verstärkerausgang 

erst langsam auf die Nullage zurück. Man erkennt deutlich den exponentiellen 

Abfall des Artefakts durch die Entladung des Kondensators. Es ergibt sich 

eine maximale Artefaktdauer von 2 ms. 

Stimulationsartefakte stören die Messungen der Netzwerkaktivität. Durch das Artefakt 

werden die Zellsignale überdeckt. Eine Minimierung dieses Artefakts ist wichtig. 

Die hier gemessene Artefaktdauer von 2 ms ist in Relation zu einer Aktionspotentialdauer 

von mindestens 1 ms relativ kurz und akzeptabel. 

Sollen die Zellen auf ein bestimmtes Ereignis (z.B. bestimmtes Spike-Muster) stimuliert 

werden, so spricht man von Echtzeitstimulation. Typische in Computer eingebaute 

Analog-Digitalwandlerkarten benutzen einen Zwischenpuffer zur Datenaufnahme, 

der Daten zwischenspeichert, bis er voll ist. Erst dann stellt er den Speicherinhalt 

der Applikation zur Verfügung. Dadurch erhält die Mess-Applikation die Informationen 

zeitverzögert. Eine Echtzeitstimulation ist damit nur mit dieser geräteund 

softwarespezifischen Zeitverzögerung möglich, die so niedrig wie möglich sein 

sollte. Ein idealer Wert wäre eine Zeitskala unter einer Millisekunde. Wie bereits 

im Abschnitt ” 

Material und Methoden” erwähnt, kann bei dem hier beschriebenen 

Aufbau die Zeitskala auf etwa 2 ms beschränkt werden. 

4.1.3.5 Leitgummis 

Um das elektrische Leitvermögen der Leitgummis zu charakterisieren wurde eine 

Spektrumanalyse mit dem Netzwerkanalysator durchgeführt. Hierzu wurde der Leitgummi 

zwischen zwei Kupferplatten eingespannt und der Ein- und Ausgang des 

Netzwerkanalysators jeweils an einer der beiden Kupferplatten kontaktiert (siehe 

Abbildung 4.14). 

Abb. 4.14: Aufbau zur Messung der Impedanz eines Leitgummis: Das Leitgummi 

ist zwischen zwei Kupferplatten befestigt. Mit einem Netzwerkanalysator 

kann dann die Frequenzabhängigkeit des Leitgummis bestimmt werden.


Die gemessene Funktion zeigt einen fast linearen Verlauf im Frequenzbereich um 

1 kHz. Die durchgelassene Leistung ist bei 1 kHz maximal. Frequenzen von 500 Hz 

bis einige kHz enthalten die wichtigsten Informationen neuronaler Aktivität. Da bei 

diesen Frequenzen auch die durchgelassene Leistung maximal ist, sind Leitgummis 

für die Kontaktierung ideal. Durch die elastischen Eigenschaften des Materials können 

Kontaktierungen wesentlich zuverlässiger als mit einfachen Goldkontaktstiften 

vorgenommen werden. Die Differenz der Transferfunktionen mit und ohne Leitgummi 

zeigt bei hohen Frequenzen einen Abstieg in der Absorption des Signals. Dadurch 

wirkt das Leitgummi wie ein Tiefpassfilter, der störende Hochfrequenzfelder schlechter 

als niederfrequente Informationen weiterleitet. 

Abb. 4.15: Gemessene Transferfunktion des Leitgummis aus einer Mischung aus Silikon 

/ Graphit 

4.1.4 Peripherie 

4.1.4.1 Heizung 

Auf einer 0,5 mm dicken Platine sind konzentrisch Leiterbahnen angebracht (Abb. 

4.16 links). Die Platine ist 40×40 mm 2 groß. Ein Temperatursensor LM45 (National 

Semiconductors) misst die Oberflächentemperatur der Platine. Die Kontakte des 

Sensors sind durch Löcher auf die Rückseite der Platine und von dort aus an den 

Rand der Platine geführt. Der Sensor ist so kalibriert, dass er bei 0 ◦ C eine Spannung 

von 0 V zurückgibt. Für jedes weitere ◦ C steigt die Ausgabespannung um 10 mV. 

Die Heizungsschaltung ist mit einem 2 A - Netzteil in ein 19“ Modul (Conrad) eingebaut 

(Abb. 4.16 rechts). Sie wurde aus einer zweiseitigen Kupferplatine mit Photolack 

geätzt. Als Verstärker dient ein Hochleistungs-OPV (LM675T, Linear Technologies). 

Der Anschluss des Temperatur-Steuergeräts mit dem MEA erfolgt über 

ein 9-Pol Sub-D Kabel (Molex). Ein zweiter Anschluss für den Computer ermöglicht


Abb. 4.16: Links: Die Heizspirale beherbergt einen Temperatursensor in der Mitte. 

Rechts: Fertiges 19” Temperatursteuermodul. 

die Temperaturprotokollierung während der Messungen. Ein Flüssigkristallmodul 

(LCD-Modul, Conrad) stellt wahlweise die aktuelle Temperatur oder die Solltemperatur 

dar. Über einen Drehpotentiometer kann die Soll-Temperatur eingestellt 

werden. Der OPV wird über einen Kippschalter (Molex) wahlweise mit –15 V . . . 

+15 V oder 0 V . . . +15 V versorgt. Dadurch kann optional mit Peltier-Elementen 

temperiert werden. 

4.1.4.2 Flusskammer 

Eine Form aus Epoxydharz (Uhu) wurde hergestellt. In diese Form wird Polydimethylsiloxan 

(PDMS) gefüllt und über 2 Stunden bei 60 ◦ C ausgehärtet. Das ausgehärtete 

PDMS wird auf Glas adhäsiv aufgeklebt und erlaubt ein einfaches Füttern 

der Zellen. Das Prinzip einer Flusskammer ist in Abbildung 3.7 dargestellt. 

Bei der Herstellung der Flusskammern aus PDMS traten an der Schlauch-Flusskammer-Schnittstelle 

oft undichte Stellen auf. Durch ein Design, das über eingegossene 

Luer-Schlauchverbinder eine stabilere Verankerung der Schlauchanschlüsse im 

PDMS ermöglicht, konnte dieses Problem gelöst werden (siehe Abbildung 4.17 linke 

Seite). 

Mit einer Spritzenpumpe kann das MEA sehr einfach mit Medium versorgt werden 

(siehe Abbildung 4.17 rechte Seite). Durch den geschlossenen Aufbau kann auch 

außerhalb des sterilen Brutschrankes gearbeitet werden. 

Eine Automatisierung der Nährstoffversorgung erhöht die Reproduzierbarkeit. Ein 

8-Wege-Ventil vom Typ EMTMA (VICI) verteilt das Medium an verschiedene Kulturen. 

Das Ventil wird über den seriellen Port eines Computers gesteuert, der per 

in Visual Basic (Microsoft) geschriebener Computersoftware gesteuert wird. In dieser 

Software können Ventile ausgewählt werden, bestimmte Zeitspannen abgewartet 

und komplette Fütterungsprogramme implementiert und zyklisch wiederholt werden 

(Abbildung 4.18).


Abb. 4.17: Links: Flusskammer aus PDMS. Zu sehen ist der Durchflusskanal in der 

Mitte. Rechts und links sind Zu- und Ableitung für Medium und Neuropharmaka. 

Die verwendeten Luer-Klemmen sind im Originalzustand 

und für das Experiment zurechtgeschnitten dargestellt. Rechts: Mittels 

zweier Spritzen, die miteinander verklebt sind, kann gleichzeitig exakt die 

gleiche Menge Medium aus der Flusskammer gesaugt werden, wie in sie 

hereingepumpt wird. Dadurch verringern sich die auftretenden Druckdifferenzen. 

Abb. 4.18: Die Software ” 

NeuroNI Feeding Assistant” kontrolliert den Zufluss von 

Medium über ein 8-Wege-Ventil, das per seriellem Port des Computers 

gesteuert wird.


4.1.5 Software 

4.1.5.1 Aufnahme 

Die Aufnahmesoftware wurde mit Visual C++ (Microsoft) erstellt. Zwei unabhängige 

Prozesse, sog. threads, trennen die Datenaufnahme und -speicherung von der 

Datenanalyse und -darstellung. Der erste Prozess arbeitet unter höchster Systempriorität 

für die Datenaufnahme. In einem zweiten Prozess werden die Messdaten 

graphisch dargestellt, falls noch Rechenzeit übrig sein sollte. Schwellenwertbedingungen, 

sog. ” 

threshold trigger events“, werden ebenfalls im zweiten Prozess berechnet. 

Falls ein Stimulations-Trigger-Ereignis auftritt, wird eine Unterbrechung (interrupt) 

ausgelöst, die die Stimulationssoftware aktivieren kann. In Abbildung 4.19 ist die 

Oberfläche der Aufnahmesoftware dargestellt. 

Abb. 4.19: Aufnahmesoftware 

Die Datenaufnahme arbeitet mit einem kleinen Aufnahmebuffer von 40 Byte 

pro Kanal. Der daraus resultierende Aufnahmebuffer von 2560 Byte wird durch 

die Analog-Digital-Wandlerkarte mit einer Samplefrequenz von 1,25 MS/s (≡ 2,5 

MB/s) gefüllt. Innerhalb von 1 ms ist dieser Buffer voll und kann von der Applikation 

ausgelesen werden. Durch die hohe Systempriorität besitzt die Applikation 

genug Rechenzeit diese Operation durchzuführen. Direkt darauffolgende Berechnungen 

(Peak-Analyse) ermöglichen eine Reaktion auf ein Signal innerhalb von 2 ms 

nach dessen Auftreten. 

4.1.5.2 Stimulationssoftware 

Mit der Stimulationssoftware können Stimulationsmuster erstellt und ausgegeben 

werden. Es gibt drei Grundformen von Stimulationsmustern: 

• Berechnete Kurven 

• Aus WAV-Dateien eingeladene diskrete Wertemengen 

• 2D-Muster (Graustufenbilder)


Die Ausgabe von berechneten Kurven ermöglicht die klassische Reizung von neuronalen 

Netzen durch vordefinierte Stimulationsmuster. Die Applikation stellt Grundformen 

wie z.B. ” 

Sinus-Welle”, ” 

Rechteck-Puls”und ” 

Sägezahn”in einer Auswahlliste 

zur Verfügung. Durch Angabe von Dauer, Amplitude und Anzahl von Wiederholungen 

kann ein individuelles Stimulationsmuster erstellt werden (Abb. 4.20). 

Abb. 4.20: Stimulationssoftware: Berechnete Kurven 

Für bestimmte Anwendungen ist es hilfreich, vorberechnete WAV-Dateien ausgeben 

zu können. Durch Angabe eines Zeit- und Amplitudenskalierungsfaktors können 

die WAV-Dateien als angepasstes Stimulationsmuster ausgegeben werden (siehe Abbildung 

4.21). 

Ein weiteres Aufgabenfeld besteht in der Mustererkennung durch natürliche neuronale 

Netze. Der Menüpunkt 2D-Muster realisiert diese Variante (siehe Abbildung 

4.22). Durch verschiedene Farben werden unterschiedliche Stimulationsmuster dargestellt, 

die verschiedene Graustufen eines Bildes wiederspiegeln.


Abb. 4.21: Stimulationssoftware: WAV-Abspielung 

Abb. 4.22: Stimulationssoftware: 2D-Muster


4.2 Zellaktivität 

Hühnereier wurden präpariert und auf MEAs und Petrischalen ausplatiert. Die Petrischalen 

dienen als Kontrollkulturen. Nach 14 Tagen im Inkubator sollten die Zellen 

vernetzt und elektrisch aktiv sein. Hierbei traten mehrere Probleme auf: 

1. Die Kulturen waren kontaminiert (Bakterien oder Pilze). 

2. Die Neurone starben nach kurzer Zeit. 

3. Die Zellen differenzierten sich nicht, d.h. sie vernetzten sich nicht. 

4. Die Zellen wuchsen nicht auf den Elektroden. 

Kontaminierte Zellkulturen können nur durch sterile Arbeitstechniken verhindert 

werden. Durch die Komplexität der Präparation könnte die Kontamination von vielen 

Quellen stammen. Durch Veränderungen in der Vorgehensweise wurde die Kontaminationsquelle 

in einer Flasche MEM-Medium gefunden. Durch Wechsel auf ein 

neues Medium verschwand die Kontamination. 

Zellen benötigen physiologische Bedingungen um überleben zu können. Mögliche 

Faktoren für einen verfrühten Zelltod sind: 

• ungeeignetes oder falsches Nährmedium 

• zu später Tausch von verbrauchtem Nährmedium 

• pH-Wert weicht relativ stark von 7,4 ab 

• fehlende Vernetzung 

• ungünstiger Untergrund 

Durch Experimente mit unterschiedlichen Nährmedien konnte festgestellt werden, 

dass D-MEM und Neurobasal ähnlich gute Ergebnisse erzielen. MEM-Medium dagegen 

scheint ungeeignet, da sich die Zellen mit MEM-Medium nicht entwickeln. 

Als Serumzusatz stellten sich fötales Kälberserum und Hühnchenserum als günstig 

dar. Pferdeserum sollte erst in einem späten Kulturstadium (nach einigen Wochen) 

verwendet werden, da die Zellentwicklung sehr schlechte Resultate mit Pferdeserum 

zeigt. 

Besonders der Untergrund ist sowohl für das Wohlbefinden der Zellen als auch für 

die Differenzierung sehr wichtig. Die Adhäsionsvermittler Laminin, Poly-L-Ornithin 

(PO), Matrigel (BD Biosciences), Polyethylenimin (PEI) und Nitrozellulose wurden 

getestet. Sowohl Matrigel als auch eine Mischung aus PO, Laminin und PEI zeigten 

gute Resultate. 

Als MEAs standen bereits oft verwendete planare Elektrodenfelder zur Verfügung. 

Ältere MEAs haben den Nachteil, dass entweder die Impedanz der Elektroden und 

ihrer Zuleitungen extrem hoch ist oder dass die isolierende Schicht über den Leitungen 

sich aufgelöst hat und somit kein Kontakt zu den Elektroden mehr hergestellt 

werden kann.


Abb. 4.23: Elektrode mit Zellteppich. 

Bei den meisten MEAs konnten keine Messungen gemacht werden, da durch fehlende 

Verbindung mit den Elektroden kein Signal aufnehmbar war. Bei einem MEA 

mit noch einigen existierenden Verbindungen bildete eine Kultur einen Teppich von 

Neuronen über wenige Elektroden (siehe Abbildung 4.23). Da zur diesem Zeitpunkt 

noch kein AD-Wandler vorhanden war, wurde ein 100-fach Verstärker nachgeschaltet 

und per Oszilloskop aufgenommen. Eine zweite Elektrode wurde als Vergleichselektrode 

aufgenommen, um Umwelteinflüsse als Differenz der beiden aufgenommenen 

Signale herausrechnen zu können. Auf eine dritte Elektrode in der Mitte zwischen 

den beiden Elektroden wurden Spannungspulse variabler Pulshöhe gegeben. Bei der 

Aufnahme dieser Kultur zeigte sich ein Signal (Abb. 4.24). 

Da es sich um eine 100.000-fache Verstärkung handelte, ist eine Spannung von 8 V 

gleich einem Signal auf der Elektrode von 80 µV. Dies liegt prinzipiell im Rahmen 

typischer Zellsignale. Allerdings ist es ein relativ großes Signal, was man von einem 

alten MEA mit relativ schlechter Impedanz nicht erwarten würde. Auffällig sind die 

beiden glockenförmigen Erhöhungen vor und nach dem Stimulationspuls, die etwa 

20 ms außeinander liegen. Dies sind vermutlich nicht gefilterte Anteile der 50 Hz 

Netzspannung (50 Hz = 20 ms). 

Fraglich ist die relativ schnelle Reaktion auf die Stimulation innerhalb von 2 ms. 

Antworten auf einen Stimulationspuls haben aufgrund der Erregungsweiterleitungsgeschwindigkeiten 

und der relativen Refraktärperiode die größte Wahrscheinlichkeit 

in Bezug auf die Reaktioszeit zwischen 5 und 10 ms. Weiterhin muss beachtet werden, 

dass die Reaktion etwa 8 ms lange dauert. Ein Aktionspotential dauert jedoch 

nur 1 bis 2 ms. Es könnte sich jedoch um beobachtete Diffusionsprozesse handeln, 

die um die Zelle nach einem Aktionspotential auftreten (Ionenausgleich). 

Paulo Bonifazi (SISSA, Triest, Italien) stellte Daten einer neuronalen Mäusekultur, 

gemessen mit einem Verstärkersystem von Multichannelsystems zur Verfügung.


Abb. 4.24: Fragliches Zellsignal. Bei einer Messung mit Stimulation zeigte sich dieses 

Signal. 

Ein Vergleich zeigt (s. Abb. 4.25), dass Zeitskalen von 10 ms durchaus realistisch 

sind. Die Kurven liegen gut übereinander. 

Durch eine Abschwächung des Stimulationspulses verschwand das Signal unter einer 

Schwelle von ca. 600 mV. Die Messung konnte mehr als eine Stunde lang durchgeführt 

werden. Auf anderen Elektrodenkombinationen konnte kein vergleichbares 

Signal aufgenommen werden. Die genannten Indizien sprechen dafür, dass Zellaktivität 

aufgenommen wurde. Diese Kultur wurde im Inkubator aufbewahrt und kein 

HEPES für die Messung zugegeben. Aufgrund des geringen Kohlendioxidgehaltes in 

der Luft veränderte sich der pH-Wert der Kultur während der Messung. Nach über 

einer Stunde wurde das Signal schwächer und verschwand. Die Kultur wurde zurück 

in den Inkubator gelegt. Nach einigen Stunden konnten unter dem Mikroskop nur 

noch tote, abgelöste Zellen beobachtet werden. Dadurch war keine weitere Messung 

mit dieser Kultur möglich. 

Die folgenden Kulturen überlebten entweder nicht länger als eine Woche oder es 

bildeten sich keine Zellteppiche auf den Elektroden. 

Es wurden neue MEAs mit Glasringen versehen und in einem Ozonbad sterilisiert. 

Die Kulturen auf diesen neuen MEAs entwickelten sich sehr gut. Nach einer Kontrollmessung 

mit den Multichannelsystems Verstärkersystem konnte jedoch kein Signal 

aufgenommen werden, da die Elektroden und Zuleitungen scheinbar durch das Ozon 

so sehr angegriffen wurden, dass sich die Impedanz zwischen Referenzelektrode und 

einer Elektrode des MEAs von etwa 1 MΩ auf über 20 MΩ verschlechtert hatte. Bei 

diesen hohen Impedanzen ist keine Messung mehr möglich. 

Aufgrund der hier geschilderten Umstände konnten daher leider keine Verifikationsmessungen 

durchgeführt werden. Weitere geplante Experimente (siehe Ausblick) 

konnten aufgrund von fehlenden Kulturen nicht durchgeführt werden.

4. Durchführung, Experimente und Ergebnisse 60 

Abb. 4.25: Vergleich des gemessenen Signals mit einem Zellsignal einer Mäusekultur 

(aufgenommen mit MCS-Verstärker von Paolo Bonifazi, SISSA-Institut 

in Triest, Italien) 

4.3 Vergleich mit MCS-System 

Aufgrund der wenigen Zellmessungen kann ein Vergleich zwischen dem in dieser 

Arbeit erstellten System und dem MCS-System nur in sehr eingeschränkter Weise 

vorgenommen werden. Betrachtet man zunächst einmal nur die praktischen Aspekte 

der beiden Geräte, so hat das in dieser Arbeit präsentierte Gerät den Vorteil, dass 

Adapter für die Kontaktierung von MEAs sowohl auf der Ober- als auch auf der Unterseite 

befestigt werden können. Dadurch kann das hier präsentierte Gerät sowohl 

auf normalen als auch inversen Mikroskopen mit dem passenden Adapter eingesetzt 

werden. 

Die Stimulation ist ein entscheidender Aspekt in dieser Arbeit. Wie bereits erwähnt 

dauert ein Stimulationsartefakt etwa 2 ms in dem hier präsentierten Gerät. 

Das Multichannelsystems-Gerät hat Artefakte von etwa 10 ms bei gleichen Bedingungen. 

Das Rauschen kann nicht direkt verglichen werden, da die Filtereigenschaften unterschiedlich 

sind. Bei einem MCS-System mit 10 Hz bis 5000 Hz Filterbereich liegt 

das Rauschen zwischen 5 µV und 20 µV, je nach verwendeter Schirmung und MEA. 

Dies ist ein wenig besser als die 15 µV des hier präsentierten Gerätes. Durch ein multilayer-SMD-Layout 

sollten jedoch hier noch Verbesserungsmöglichkeiten liegen. 

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass beide Geräte vergleichbar sind. 

Auf Basis der Stimulation liegen leichte Vorteile auf dem hier präsentierten Gerät. 

Allerdings könnten durch Anpassung des MCS-Gerätes die geschilderten Nachteile 

vermutlich umgangen werden.

Teil IV 

Zusammenfassung und Ausblick

5 Zusammenfassung und Ausblick 

5.1 Zusammenfassung 

Das Aufgabengebiet dieser Diplomarbeit teilt sich in viele Bereiche. Auf Seite der 

Biologie ist ein Grundverständnis über Zellen und deren Wechselwirkungen mit der 

Umwelt notwendig, das im ersten Teil dieser Arbeit zusammengefasst wurde. 

Grundlage der Aufnahme von Zellsignalen ist die Verstärkungselektronik, deren 

Theorie ebenfalls im ersten Teil dargestellt wurde. Eine geeignete Schaltung wurde 

entworfen, die Zellsignale aufnehmen und auf beliebige Kombinationen von Elektroden 

unterschiedliche Stimulationsmuster ausgeben kann. Die Schaltung funktioniert 

mit extrem kurzen Stimulationsartefakten, die es ermöglicht, kurz nach der Stimulation 

bereits zuverlässige Daten zu messen. Die AD-Wandlung der Daten im 

Computer und Aufnahme der Daten durch ein Messprogramm wurden realisiert. 

Durch Charakterisierungsmessungen konnte die Funktionsweise der Elektronik im 

Elektroniklabor bestätigt werden. Die experimentelle Bestätigung der Aufnahmeeinheit 

in Verbindung mit Nervenzellen konnte nur in einer Messung überprüft werden. 

Weitere Messungen waren nicht möglich, da die Zellkulturen entweder abgestorben 

waren, bevor sie einen ausreichenden Vernetzungszustand hatten, oder die MEAs 

nicht funktionsfähig waren. Brauchbare MEAs waren erst in den letzten zwei Monaten 

dieser Arbeit verfügbar. Durch einen Sterilisierungsprozess mit Ozon wurde die 

Impedanz dieser MEAs jedoch negativ beinflusst, so dass auch hiermit keine weiteren 

Messungen möglich waren. Weitere Experimente sind zur Charakterisierung und 

Optimierung der Elektronik nötig. 

Aufgrund der fehlenden Zellkulturen konnten auch keine Experimente mit neuronalen 

Netzen durchgeführt werden. Die Vorteile des Systems konnten dadurch leider 

nicht herausgestellt und experimentell bestätigt werden. 

Die Vorteile des hier präsentierten Messaufbaus liegen in der Stimulation. Durch 

eine integrierte elektronische Umschaltung zwischen Aufnahme und Stimulation sind 

wissenschaftlich sehr interessante Experimente möglich, die mit den kommerziell 

erhältlichen Systemen derzeit noch nicht möglich sind. 

5.2 Ausblick 

Mit gut vernetzten Kulturen könnten neurophysiologische Untersuchungen gemacht 

werden. Ein erstes Experiment wäre die Aufnahme spontaner Aktivität von Neuronen. 

Hierzu wird das MEA in den Verstärker eingespannt und ohne Stimulation

5. Zusammenfassung und Ausblick 63 

aufgenommen. Dieses Experiment könnte durch Aktivierung einer Stimulationselektrode 

erweitert werden. Die Reaktion der Zellen auf den Spannungspuls sollte sich 

durch eine verstärkte Aktivität ausdrücken. 

Die Temperaturabhängigkeit der Netzwerkaktivität ist ein weiteres einfach zu realisierendes 

Experiment. Als Heizung wird ein Peltier-Element eingesetzt, das die 

MEA-Kultur auf definierte Temperaturen abkühlt. Durch die niedrigeren Umgebungstemperaturen 

sinkt die Rate der spontanen Aktivitätsspikes. 

Durch Zugabe von Neurotransmittern oder -inhibitoren, wie z.B. Tetrodotoxin 

(TTX) oder Nikotin, können weitere interessante Statistiken über Netzwerkaktivität 

aufgezeichnet werden. 

Wissenschaftlich interessant sind Untersuchungen von Lernverhalten und neuronalem 

Code. Ein erster Schritt könnte eine Wiederholung des Shahaf und Marom”- 

” 

Experimentes sein [Shahaf und Marom, 2001]. Bei diesem Experiment werden so 

lange Stimulationspulse auf eine Elektrode gegeben, bis eine bestimmte Netzwerkantwort 

aufgenommen wird. Nach einer kurzen Pause beginnt die Stimulation von vorne. 

Untersucht wird die Zeitspanne zwischen Anfang der Stimulation und der korrekten” 

Netzwerkantwort. Shahaf fand heraus, dass diese Zeitspanne kürzer wird, um ” 

so länger das Experiment dauert. Das Netzwerk hat sozusagen diesen Zustand” ” 

gelernt. 

Solche Experimente könnten beliebig ausgedehnt werden. Eine der wichtigsten 

Fragestellungen ist die des neuronalen Codes. Denkbar ist, dass Informationen spannungscodiert 

oder frequenzcodiert übertragen werden. Bei der Spannungscodierung 

werden unterschiedlich hohe Spannungspulse auf das Netzwerk gegeben. Fraglich ist 

hierbei, warum Neuronen unterschiedliche Spannungen als Informationen akzeptieren 

sollten, da sie entweder ein Aktionspotential auslösen können oder keines. An 

dieser Stelle könnte argumentiert werden, dass an den Synapsen viele Axone zusammenkommen 

und somit zu einer Integration dieser einzelnen Aktionspotentiale zu 

einer Gesamtspannung führen. Eine andere Idee besteht in der Frequenzcodierung, 

d.h. in der zeitlichen Abfolge von Aktionspotentialen. Durch ein auf mehrere Zustände 

erweitertes Shahaf und Marom”-Experiment könnte untersucht werden, wie 

” 

die Zellen auf verschiedene Codierungsarten reagieren. Eine mögliche Variante wären 

zwei unterschiedliche Frequenzen, für die unterschiedliche Stop”-Bedingungen 

” 

definiert werden. Diese Variante erscheint für einen Erfolg als wesentlich wahrscheinlicher. 

Denkbar wären auch virtuelle Umgebungen, in denen über die Elektroden Einund 

Ausgabeinformationen für Sensoren definiert werden. Eingabekanäle wären z.B. 

” Augen” oder Ohren”. Ausgabekanäle wären z.B. motorische Bewegungen. Das neuronale 

Netz könnte sich dann in seiner eigenen Welt bewegen. Solche Ansätze wer- 

” 

den derzeit vom Animat-Projekt [DeMarse u.a., 2001] und dem NeuroBIT-Projekt 

(Projektleiter: Sergio Martinoia) verfolgt. Ein solches Experiment ohne Lehrer”, ” 

d.h. ohne direkte Wissenseinspeicherung von außen, könnte mit Digitalen Signal- 

Prozessoren (DSP) realisiert werden. Diese autonomen Ein-Chip-Computersysteme 

auf Mikrochip-Basis haben integrierte Datenaufnahme und -analysefunktionen. DSPs 

sind in der Lage, eigenständig Stimulationssignale auszugeben. Dieser Chip könnte 

eine künstliche Welt für das MEA ausgeben. Über eine vordefinierte Topologie


könnte der DSP auf Aktivität des Netzwerks mit Stimulationspulsen antworten. 

Durch das Aufnahmesystem könnten Veränderungen im Verhalten des Netzwerks 

protokolliert werden, um so Hinweise auf einen neuronalen Code zu erhalten. 

Auf technischer Seite sind viele Entwicklungen denkbar. Eine Vereinfachung für 

Routineuntersuchungen würde eine Kontaktierung durch pin grid array-Stecksockel 

(PGA) darstellen, auf die das MEA mit Leitsilber verklebt wird. Der Sockel wird 

auf einem ” 

zero insertion force”-Sockel (ZIF) aufgelegt und mit einem kräftefreien 

Hebel (zero insertion foce = ZIF) befestigt (siehe Abbildung 5.1). Dadurch kann das 

MEA innerhalb von Sekunden gewechselt werden. Durch eine integrierte Heizung im 

PGA kann das MEA sogar außerhalb des Inkubators aufbewahrt werden. 

Abb. 5.1: Befestigung des MEAs auf einem pin-grid-array-Sockel (PGA). 

Eine Reduktion von Stimulationsartefakten könnte mit einem Dreistufenschalter 

erreicht werden. Statt einer direkten Abkopplung der Stimulation von den Elektroden 

kann eine Zwischenschaltstufe als Masseverbindung genutzt werden. Dadurch 

können Spannungsüberhöhungen der Aufnahmekanäle über die Masseleitung abfließen. 

Eine zweite Möglichkeit besteht in der Anpassung des Stimulationspulses an die 

Eigenschaften der Verstärkerelektronik. Werden gezielt Gegenladungen eingebracht, 

so kann dem Aufladungseffekt entgegengewirkt werden. Durch Messungen, bei denen 

das Stimulationsartefakt direkt wieder aufgenommen wird und der Stimulationspuls 

so lange verändert wird (Längen- und Amplitudenmodulation), bis ein minimales Artefakt 

verbleibt, kann die Totzeit minimiert werden. Ein Optimierungsalgorithmus 

könnte die optimale Pulsform durch eine Kombination von Analyse und Versuchen 

herausfinden. Durch ein automatisiertes Suchen der Kontrollparameter mittels Optimierungsalgorithmen 

würde dieser Prozess vereinfacht. Denkbar wären genetische 

Algorithmen in Kombination mit künstlichen neuronalen Netzen. 

Die Stimulationsmodule könnten an das MCS-Verstärkersystem angepasst werden. 

Durch eine neue Software (z.B. auf Basis von MEA-Bench von Daniel Waagenar 

und Linux-RT) könnte dann aus dem MCS-System ebenfalls ein Echtzeit- 

Stimulationssystem hergestellt werden. 

Durch Integration der Filtermodule in PCMCIA-Steckkarten würde die Auswahl 

der Filterbereiche stark vereinfacht. Durch eine zweiseitige SMD-Bestückung auf 

multilagen-Platinen, die in der Elektronikwerkstatt der Universität Kaiserslautern 

nicht möglich ist, könnten die Ausmaße des Messaufbaus enorm verkleinert wer-


den. In Verbindung mit einem DSP-Prozessor könnte ein portabler Neurosensor aus 

diesem Aufbau hergestellt werden. 

Auf dem Gebiet der natürlichen neuronalen Netze in Verbindung mit Multi- 

Elektroden-Arrays sind noch viele interessante Experimente möglich und nötig. Mit 

dem in dieser Arbeit präsentierten Messaufbau sind erste Untersuchungen von Lernphänomenen 

möglich. Interessante Fragestellungen warten auf ihre Realisierung.

Teil V 

Anhang

6 Anhang 

6.1 Elektronik 

6.1.1 Matrix-Schalter zur Kanalauswahl 

Zu Beginn eines Experimentes ist meistens noch nicht bekannt, welche Kanäle stimuliert 

werden sollen, da die Zellen an manchen Stellen besser auf Stimuli reagieren, 

als an anderen Stellen 1 . Außerdem könnten für Konditionierungsversuche bestimmte 

Elektrodenkonfigurationen zur Stimulation erforderlich sein. Benötigt wird also 

eine dynamische Auswahlmöglichkeit der Stimulationskanäle. 

Dies ermöglichen Matrixschalter-IC’s, die ein oder zwei Kanäle auf bis zu vier oder 

acht andere Kanäle verteilen (ADG728 / ADG729 bzw. AD 75019, Analog Devices). 

Mittels eines solchen Bausteines können 4 bis 16 analoge Stimulationskanäle beliebig 

auf 64 Elektroden verteilt werden. Die Auswahl der Stimulationskanäle erfolgt 

über einen seriellen Bus des Computers (z.B. Parallel-Port, USB, oder der Digitalausgang 

der AD-DA-Karte). Die Programmierung des Matrix-Schalter-Bausteins ist 

in Abbildung 6.1 dargestellt. Die 256 Schalter auf einem AD75019 Baustein werden 

seriell über einen Datenbus (DIN) bitweise programmiert, wobei jedes bit für einen 

Schalter im Matrix Schalter steht (bit=1 heißt Schalter an). Parallel zu den Daten 

gibt eine Taktleitung (SCLK) die Programmiergeschwindigkeit vor. Über eine 

Synchronisationsleitung (SYNC) wird der Programmierprozess initiiert. 

Abb. 6.1: Programmiersequenz des AD75019 Bausteins. Erklärung siehe Text. Abbildung 

aus Datenblatt AD75019, Analog Devices 

Die Bausteine sind auf einer 19”-Einschubplatine integriert und können beliebig 

erweitert werden. Auf der Platine sind 4 Bausteine mit jeweils 16×16-Kanälen integriert. 

Damit können bis zu 16 Kanäle auf 64 Elektroden verteilt werden. Durch 

1 Ein Auswahlkriterium besteht in der spontanen Aktivität einzelner Elektroden.

6. Anhang 68 

ein einfaches Hintereinanderschalten mehrerer 19”-Module können mehr Elektroden 

oder auch mehr Stimulationskanäle verknüpft werden. 

6.1.2 Platinenlayouts 

Es folgen auf den nächsten Seiten die Platinenlayouts zur Photoreproduktion.

6. Anhang 69

Temperatursteuerung 

Layout oben 

Layout unten 

6. Anhang 70

6. Anhang 71 

Heizspirale 

Heizspirale - oben 

Heizspirale - unten

6. Anhang 72 

Verstärkerstufe 1 - Übersicht

6. Anhang 73 

Verstärkerstufe 1 - oben

6. Anhang 74 

Verstärkerstufe 1 - unten

6. Anhang 75 

Verstärkerstufe 2+3 - Übersicht 

Verstärkerstufe 2+3 - oben 

Verstärkerstufe 2+3 - unten

6. Anhang 76 

Filter - Übersicht 

Filter - oben 

Filter - unten 

Filtermodule 1 - 3

6. Anhang 77 

Stimulation (Übersicht, oben, unten) 

Crosspoint Switch 16x64

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Danksagung 84 

Danksagung 

Mein Dank gilt folgenden Menschen: 

• Frau Prof. Dr. Christane Ziegler für die Überlassung des interessanten Themas 

dieser Arbeit, die sehr guten Arbeitsbedingungen und die hervorragende 

Betreuung. 

• Juniorprof. Dr. Axel Blau für die Zweitkorrektur, die immer hilfreichen Diskussionen 

und der hervorragenden Betreuung. Ich danke auch für stets gute 

Ideen und der tollen Arbeitsatmosphäre. 

• Hartmut Stadler für die Programmierung des HP VEE Programms zur Steuerung 

des Netzwerkanalysators, für die vielen Diskussionen und Auflockerung 

der langen Nächte im Labor. 

• Alexander Vidic für Rat und Tat in Werkstatt, stets einer guten Idee für Elektronik 

und Computer und für die anregenden Gespräche in allen Lebenslagen, 

inbesondere in den langen Labornächten. 

• Matthias Mondon für abwechslungsreiche Diskussionen, immer guter Laune 

und für die Einführung in AFM und die Kräuterkunde. 

• Dirk Then für die Arbeitsgruppenbegrünung. 

• Der lustigen Truppe aus Bau 46 für nervenaufreibende Pausen. Gretchen, Waldumgang, 

Otgorma und Dr. No strike back. 

• David Prantl für immer gute Ideen, Netzwerkangelegenheiten, Motivation und 

gute Laune. 

• Manfred Strack für die technische Unterstützung in allen Bereichen. 

• Elektronikwerkstatt für wertvolle Elektroniktips (Dipl.-Ing. Henno Heintz), für 

die schnelle und zuverlässige Erstellung der Leiterplatinen (Manfred Schlägel) 

und die Bestückung der SMD-Platinen. Der Metallwerkstatt für die Herstellung 

des Gehäuses. 

• Silvia Christoffel für die Hilfe bei Planung von Workshops und Seminaren. 

• Der gesamten AG Ziegler für die gute Atmosphäre und immer hilfreichen Diskussionen. 

• Den Firmen Analog Devices, Texas Instruments, KWHM, Shin Etsu Polymers, 

Fujipoly, Maxim-IC und Molex für kostenlose Produktproben 

• Nicole Schmidt für die Präparation der Zellen, das Durchlesen des Skriptes 

und moralische Unterstützung.

Danksagung 85 

• Meinen Eltern für die breite Unterstützung (geistig, moralisch, finanziell), ohne 

die mein Studium nicht möglich gewesen wäre. Die vielen Kerzen haben doch 

was genutzt :-) 

• Allen nicht genannten Personen, die mich in meinem Studium und meiner 

Arbeit unterstützt haben.

Aufbau eines 60-Kanal Aufnahme - Fachbereich Physik der ...

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