Aufbau eines 60-Kanal Aufnahme - Fachbereich Physik der ...
Aufbau eines 60-Kanal Aufnahme - Fachbereich Physik der ...
Aufbau eines 60-Kanal Aufnahme - Fachbereich Physik der ...
Erfolgreiche ePaper selbst erstellen
Machen Sie aus Ihren PDF Publikationen ein blätterbares Flipbook mit unserer einzigartigen Google optimierten e-Paper Software.
<strong>Aufbau</strong> <strong>eines</strong> <strong>60</strong>-<strong>Kanal</strong> <strong>Aufnahme</strong>- und<br />
Stimulationssystems<br />
zur Untersuchung neuronaler Aktivität<br />
Diplomarbeit<br />
im Fach<br />
Angewandte <strong>Physik</strong><br />
Universität Kaiserslautern<br />
<strong>Fachbereich</strong> <strong>Physik</strong><br />
Patrick Hellwig<br />
Erstprüfer:<br />
Zweitprüfer:<br />
Prof. Dr. C. Ziegler<br />
Juniorprof. Dr. A. Blau<br />
Angefertigt in <strong>der</strong> Zeit vom 15. Januar 2002 bis 24. Dezember 2002<br />
Kaiserslautern, Dezember 2002
Inhaltsverzeichnis<br />
1 Einleitung 1<br />
I Literatur- und Theorieteil 3<br />
2 Literatur- und Theorieteil 4<br />
2.1 Biologische Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4<br />
2.1.1 Ruhe- und Aktionspotentiale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4<br />
2.1.2 Die Nervenzelle (Das Neuron) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5<br />
2.1.3 Reizweiterleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7<br />
2.1.4 Künstliche Reizung des Neurons . . . . . . . . . . . . . . . . . 7<br />
2.2 Elektronische Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8<br />
2.2.1 Einleitung und Motivation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8<br />
2.2.2 Anfor<strong>der</strong>ungen an die Elektronik . . . . . . . . . . . . . . . . 8<br />
2.2.3 Operationsverstärker . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8<br />
2.2.4 Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9<br />
2.2.4.1 Verstärkungsfaktor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10<br />
2.2.4.2 Differenzverstärkung <strong>eines</strong> Operationsverstärkers (open<br />
loop gain) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10<br />
2.2.4.3 Rückkopplung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10<br />
2.2.4.4 Offset . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11<br />
2.2.4.5 Bandbreite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11<br />
2.2.4.6 Stabilitätskriterien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12<br />
2.2.4.7 Eingangsruhestrom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13<br />
2.2.4.8 Eingangswi<strong>der</strong>stand . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13<br />
2.2.4.9 Anstiegsgeschwindigkeit (slew rate) . . . . . . . . . . 14<br />
2.2.5 Zusammenfassung Verstärkerbaustein-Kriterien . . . . . . . . 14<br />
2.2.6 Filter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14<br />
2.3 Elektroden zur <strong>Aufnahme</strong> von Zellsignalen . . . . . . . . . . . . . . . 16<br />
2.3.1 Einzelne Ableitungs- und Stimulationselektroden . . . . . . . 16<br />
2.3.2 patch-clamp Technik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17<br />
2.3.3 Mikroelektrodenfel<strong>der</strong> . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17<br />
2.3.4 CMOS Neurochips . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18<br />
2.3.5 Optische <strong>Aufnahme</strong>methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19<br />
2.4 <strong>Aufnahme</strong>systeme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Inhaltsverzeichnis<br />
ii<br />
2.4.1 MEA basierte Systeme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21<br />
2.4.1.1 Multichannelsystems . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21<br />
2.4.1.2 Panasonic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21<br />
2.4.1.3 Plexon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22<br />
2.4.1.4 Nippon Telegraph & Telephone (NT&T) . . . . . . . 22<br />
2.4.2 CMOS basierte Systeme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22<br />
2.4.2.1 Andreas Offenhäusser . . . . . . . . . . . . . . . . . 22<br />
2.4.2.2 INPRO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22<br />
2.5 Experimente und Anwendungen zellbasierter Systeme . . . . . . . . . 23<br />
2.5.1 Dissoziierte Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23<br />
2.5.1.1 Modelle <strong>der</strong> Wirklichkeit . . . . . . . . . . . . . . . . 23<br />
2.5.1.2 Lernen und Gedächtnis . . . . . . . . . . . . . . . . 23<br />
2.5.1.3 Neuronaler Code . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24<br />
2.5.1.4 Datenverarbeitung - Parallel Processing und Data<br />
Mining . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24<br />
2.5.1.5 Neuro-Interfaces . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24<br />
2.5.1.6 Biosensoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24<br />
2.5.2 Gehirnschnitte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25<br />
II Materialien und Methoden 26<br />
3 Materialien und Methoden 27<br />
3.1 Messaufbau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27<br />
3.1.1 <strong>Aufnahme</strong>elektronik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28<br />
3.1.1.1 Verstärkereinheit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28<br />
3.1.1.2 Filtereinheit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29<br />
3.1.1.3 Analog-Digital-Wandlung . . . . . . . . . . . . . . . 30<br />
3.1.2 Stimulationselektronik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31<br />
3.1.3 Charakterisierung <strong>der</strong> Elektronik . . . . . . . . . . . . . . . . 33<br />
3.1.3.1 Transferfunktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33<br />
3.1.3.2 Rauschen und Zeitcharakteristiken . . . . . . . . . . 33<br />
3.1.4 Peripherie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34<br />
3.1.4.1 Gehäuse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34<br />
3.1.4.2 Mechanoelektrische Kopplung . . . . . . . . . . . . . 34<br />
3.1.4.3 Heizung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36<br />
3.1.4.4 Flusskammer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36<br />
3.1.5 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37<br />
3.2 Zellkulturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37<br />
3.2.1 Chemikalien und Medien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37<br />
3.2.1.1 Medien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37<br />
3.2.1.2 Antibiotika . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38<br />
3.2.2 Präparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38<br />
3.2.2.1 Dissoziierte Neuronen . . . . . . . . . . . . . . . . . 38<br />
3.2.2.2 Herzmuskelzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
Inhaltsverzeichnis<br />
iii<br />
3.3 Sonstiges . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39<br />
3.3.1 Herstellung <strong>der</strong> Platinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39<br />
III Experimentelle Durchführung 40<br />
4 Durchführung, Experimente und Ergebnisse 41<br />
4.1 Messaufbau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41<br />
4.1.1 <strong>Aufnahme</strong>- und Stimulationselektronik . . . . . . . . . . . . . 41<br />
4.1.2 Filtereinheit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43<br />
4.1.2.1 Gehäuse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44<br />
4.1.3 Charakterisierung <strong>der</strong> Elektronik . . . . . . . . . . . . . . . . 44<br />
4.1.3.1 Verstärkungsfaktor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44<br />
4.1.3.2 Übersprechen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47<br />
4.1.3.3 Rauschen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48<br />
4.1.3.4 Schaltverhalten <strong>der</strong> Stimulationselektronik . . . . . . 49<br />
4.1.3.5 Leitgummis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50<br />
4.1.4 Peripherie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51<br />
4.1.4.1 Heizung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51<br />
4.1.4.2 Flusskammer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52<br />
4.1.5 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54<br />
4.1.5.1 <strong>Aufnahme</strong> . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54<br />
4.1.5.2 Stimulationssoftware . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54<br />
4.2 Zellaktivität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57<br />
4.3 Vergleich mit MCS-System . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . <strong>60</strong><br />
IV Zusammenfassung und Ausblick 61<br />
5 Zusammenfassung und Ausblick 62<br />
5.1 Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62<br />
5.2 Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62<br />
V Anhang 66<br />
6 Anhang 67<br />
6.1 Elektronik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67<br />
6.1.1 Matrix-Schalter zur <strong>Kanal</strong>auswahl . . . . . . . . . . . . . . . . 67<br />
6.1.2 Platinenlayouts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68<br />
Literaturverzeichnis 78<br />
Danksagung 84
Abbildungsverzeichnis<br />
2.1 Än<strong>der</strong>ung des Membranpotentials als Funktion <strong>der</strong> Leitfähigkeit <strong>der</strong><br />
Zellmembran für Natrium(g Na )- und Kaliumionen(g K ) und daraus resultierendes<br />
Aktionspotential (Erklärung im Text). Abbildung: [Silbernagl<br />
und Despopoulos, 4.Auflage, 1991] . . . . . . . . . . . . . . . 5<br />
2.2 Aktionspotentiale von Nervenzellen, quergestreifter Muskulatur und<br />
Herzmuskelzellen unterscheiden sich in ihrem Aussehen. Abbildung<br />
angelehnt an: [Silbernagl und Despopoulos, 4.Auflage, 1991] . . . . . 6<br />
2.3 Neuron und Synapse. Abbildung: [Silbernagl und Despopoulos, 4.Auflage,<br />
1991] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6<br />
2.4 Synapse, synaptischer Spalt und synaptische Signalübertragung. Abbildung:<br />
[Silbernagl und Despopoulos, 4.Auflage, 1991] . . . . . . . . 7<br />
2.5 Schaltsymbol des Operationsverstärkers. Zwischen den beiden Eingängen<br />
( ”<br />
+“ und ”<br />
-“) liegt die Differenzspannung U D an. U P und U N<br />
sind die Spannungen zwischen <strong>der</strong> Referenz und den beiden Eingängen.<br />
Der Operationsverstärker gibt die verstärkte Spannung U a aus.<br />
Abbildung: [Tieze und Schenk, 1989] . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9<br />
2.6 Rückkopplungsverstärkung beim a) invertierenden und b) nicht-invertierenden<br />
Verstärker. Abbildung: [Tieze und Schenk, 1989] . . . . . 11<br />
2.7 Typischer Frequenzgang <strong>der</strong> Differenzverstärkung ohne Gegenkopplung.<br />
Abbildung: [Tieze und Schenk, 1989] . . . . . . . . . . . . . . . 12<br />
2.8 Erhöhung <strong>der</strong> Bandbreite durch Gegenkopplung. Abbildung: [Tieze<br />
und Schenk, 1989] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13<br />
2.9 Tiefpassfilter erster und zweiter Ordnung. Der Wi<strong>der</strong>stand R 1 lässt<br />
alle Frequenzen passieren. Über die Kapazität werden die hochfrequenten<br />
Anteile über die Masse vermin<strong>der</strong>t. . . . . . . . . . . . . . . 15<br />
2.10 Hochpassfilter erster und zweiter Ordnung. Die Kapazität lässt nur<br />
hohe Frequenzen passieren. Über den Wi<strong>der</strong>stand können eventuelle<br />
Gleichstromanteile zwischen <strong>der</strong> Kapazität und dem Verstärker abfließen.<br />
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15<br />
2.11 Schematische Darstellung <strong>der</strong> prinzipiellen Möglichkeiten <strong>der</strong> Signalerfassung<br />
an (Nerven-) Zellen und <strong>der</strong> zu erwartenden Signaltypen.<br />
Abbildung: [Blau, 1995] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16<br />
2.12 Ein <strong>60</strong>-Elektroden Mikroelektrodenarray (MEA). Abbildung: MCS . . 18
Abbildungsverzeichnis<br />
v<br />
2.13 Bildlicher Vergleich von planarem Elektrodentyp (links) und 3D-Fakir<br />
Elektrodentyp (rechts). Die planaren Elektroden werden für dissoziierte<br />
Zellkuluren und die 3D-Elektroden für Gehirnschnitte eingesetzt.<br />
Abbildung: Marc Heuschkel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19<br />
2.14 <strong>60</strong>-<strong>Kanal</strong>verstärker von Multichannelsystems. . . . . . . . . . . . . . 21<br />
3.1 Schematische Darstellung des Messaufbaus (Erklärung im Text) . . . 27<br />
3.2 Schematische Darstellung <strong>eines</strong> Verstärkerkanals. Das Eingangssignal<br />
(IN) wird mittels <strong>eines</strong> Instrumentenverstärkers (InstAmp IC2) 10-<br />
fach verstärkt und dem ersten Operationsverstärker (OpAmp IC1A)<br />
zugeführt, <strong>der</strong> mittels Rückkopplung <strong>der</strong> beiden Wi<strong>der</strong>stände R1 und<br />
R2 das Signal wie<strong>der</strong>um 10-fach verstärkt. Der zweite Operationsverstärker<br />
(IC1B) führt das Signal durch die Rückkopplung (Wi<strong>der</strong>stände<br />
R3 und R4) mittels 10-facher Verstärkung zur 1000-fachen<br />
Endverstärkung am Ausgang (OUT). . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28<br />
3.3 Schematische Darstellung <strong>eines</strong> Filterkanals. Das Eingangssignal (IN)<br />
durchläuft die Tiefpass-Filterstufe (IC1B) auf <strong>der</strong> linken Seite, gelangt<br />
zur Hochpass-Filterstufe (IC2B) auf <strong>der</strong> rechten Seite und wird am<br />
Ausgang (OUT) als gefiltertes Signal ausgegeben. . . . . . . . . . . . 30<br />
3.4 Berechneter Verlauf <strong>eines</strong> Butterworth-Tiefpass-Filters zweiter Stufe<br />
mit einer Grenzfrequenz von 10 kHz und <strong>eines</strong> nachgeschalteten<br />
Butterworth-Hochpass-Filters zweiter Stufe mit einer Grenzfrequenz<br />
von 100 Hz. Die Berechnungen wurden mit ”<br />
Filter Free” von Nuhertz<br />
Technologies durchgeführt. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31<br />
3.5 Programmierung des ADG715 über den seriellen I 2 C-Bus. Nach <strong>der</strong><br />
Start-Bedingung wird eine für einen Schalterbaustein spezifische Identifikationsadresse<br />
übertragen, <strong>der</strong> ein Datenbyte folgt. Je<strong>der</strong> Baustein<br />
beinhaltet 8 Schalter. Jedes Bit des Datenbytes repräsentiert einen<br />
Schalter. Sobald die Stop-Bedingung nach dem Datenbyte übertragen<br />
ist, schaltet <strong>der</strong> Baustein die soeben übertragene Schalterkonfiguration. 32<br />
3.6 Schematischer <strong>Aufbau</strong> zur Messung <strong>der</strong> Transferfunktion einer Elektronik<br />
mit einem Netzwerkanalysator. Erklärung im Text. . . . . . . . 33<br />
3.7 Schematische Darstellung <strong>der</strong> Peripherie (Erklärung im Text) . . . . . 35<br />
3.8 Ein Leitgummi besteht aus abwechselnd leitenden (schwarze Bereiche)<br />
und nicht-leitenden Bereichen (weisse Bereiche). . . . . . . . . . 36<br />
3.9 Schematische Schaltung <strong>der</strong> Heizungssteuerung. Die beiden Potentiometer<br />
arbeiten als Spannungsteiler. Daher sind keine Angaben über<br />
Wi<strong>der</strong>stände nötig. In dieser Arbeit wurden Potentiometer von 0 bis<br />
100 Ω verwendet. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37<br />
4.1 Fotos <strong>der</strong> Verstärkereinheiten. A) Erste Verstärkerstufe. B) Ein Modul<br />
<strong>der</strong> zweiten und dritten Verstärkungsstufe. C) Zusammengebaute<br />
Verstärkerplatine. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
Abbildungsverzeichnis<br />
vi<br />
4.2 Links: Ein Stimulationsmodul ist auf die Basisplatine gesteckt. Rechts:<br />
Foto <strong>der</strong> 16-<strong>Kanal</strong> Entkopplungsschalterplatine. In <strong>der</strong> Mitte befinden<br />
sich die beiden 8-<strong>Kanal</strong>-Schalterbausteine vom Typ AFDG715.<br />
Die beiden 16-poligen Buchsenleisten sind die Ein- und Ausgänge. Die<br />
beiden 2-poligen Buchsenleisten dienen <strong>der</strong> Spannungsversorgung und<br />
als Steuerleitungen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42<br />
4.3 Die <strong>Aufnahme</strong>- und Stimulationselektronik sind in einem Metallgehäuse<br />
zusammengefasst. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42<br />
4.4 16 <strong>Kanal</strong> Filtermodul. Die Buchsenleiste links oben ist <strong>der</strong> Signaleingang.<br />
Es folgen oben zwei Steckmodule, die für die Eigenschaften des<br />
Tiefpass-Filters zuständig sind. Unten befindet sich das Steckmodul<br />
für die Eigenschaften des Hochpass-Filters. Der Ausgang ist die oben<br />
rechts schräg stehende Buchsenleiste. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43<br />
4.5 Die 64 Filterkanäle befinden sich in einem 19” Einschubgehäuse. Der<br />
Ein- und Ausgang wird durch ein SCSI-Kabel verbunden. . . . . . . . 43<br />
4.6 Links: Die Alu-Basisplatte, in die das MEA eingelegt wird, enthält<br />
auch die Heizung und den Temperatursensor. Rechts: Die schwarzen<br />
Leitgummis sind quadratisch angeordnet und werden auf das MEA<br />
gelegt, so dass sie genau auf den Elektrodenflächen liegen. . . . . . . 44<br />
4.7 Beispiel <strong>eines</strong> nichtlinearen Sinus-Kurvenfits des Ein- und Ausgangssignals<br />
<strong>eines</strong> Verstärkerkanals. Der Fit wurde mit Origin 7.0 Professional<br />
<strong>der</strong> Firma OriginLab durchgeführt. . . . . . . . . . . . . . . . . 45<br />
4.8 Verstärkungsfaktoren <strong>der</strong> 64 Kanäle des Verstärkers. . . . . . . . . . . 46<br />
4.9 Transferfunktionen <strong>der</strong> Filtereinheit im 19”-Gehäuse. Gezeigt sind jeweils<br />
die Mittelwerte über die 16 Kanäle <strong>der</strong> vier Filtermodule. . . . . 46<br />
4.10 Untersuchung <strong>der</strong> Frequenzparameter des Netzwerkanalysators. Frequenzen<br />
unter 10 Hz sind wegen <strong>der</strong> Netzwerkanalysator-Filtereinstellung<br />
nicht messbar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47<br />
4.11 Untersuchung des Übersprechens <strong>eines</strong> <strong>Kanal</strong>s gegenüber den an<strong>der</strong>en.<br />
Auf <strong>Kanal</strong> 13 wurde eine Sinusförmige Wellenform gelegt. . . . . 48<br />
4.12 Untersuchung des Rauschens des Verstärkersystems. Links: Masseleitung<br />
und Elektrode sind direkt verbunden. Rechts: In das Messgerät<br />
wurde ein MEA mit Medium eingelegt. Das Medium wurde mit Masse<br />
über eine in das Bad getauchte Elektrode kontaktiert. . . . . . . . . . 49<br />
4.13 Stimulationsartefakte entstehen durch die Aufladung von Kondensatoren<br />
in <strong>der</strong> Verstärkerschaltung. Der Artefakt beeinträchtigt die<br />
Messung nach <strong>der</strong> Stimulation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49<br />
4.14 <strong>Aufbau</strong> zur Messung <strong>der</strong> Impedanz <strong>eines</strong> Leitgummis: Das Leitgummi<br />
ist zwischen zwei Kupferplatten befestigt. Mit einem Netzwerkanalysator<br />
kann dann die Frequenzabhängigkeit des Leitgummis bestimmt<br />
werden. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50<br />
4.15 Gemessene Transferfunktion des Leitgummis aus einer Mischung aus<br />
Silikon / Graphit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51<br />
4.16 Links: Die Heizspirale beherbergt einen Temperatursensor in <strong>der</strong><br />
Mitte. Rechts: Fertiges 19” Temperatursteuermodul. . . . . . . . . . 52
Abbildungsverzeichnis<br />
vii<br />
4.17 Links: Flusskammer aus PDMS. Zu sehen ist <strong>der</strong> Durchflusskanal<br />
in <strong>der</strong> Mitte. Rechts und links sind Zu- und Ableitung für Medium<br />
und Neuropharmaka. Die verwendeten Luer-Klemmen sind im Originalzustand<br />
und für das Experiment zurechtgeschnitten dargestellt.<br />
Rechts: Mittels zweier Spritzen, die miteinan<strong>der</strong> verklebt sind, kann<br />
gleichzeitig exakt die gleiche Menge Medium aus <strong>der</strong> Flusskammer<br />
gesaugt werden, wie in sie hereingepumpt wird. Dadurch verringern<br />
sich die auftretenden Druckdifferenzen. . . . . . . . . . . . . . . . . . 53<br />
4.18 Die Software NeuroNI Feeding Assistant”kontrolliert den Zufluss von<br />
”<br />
Medium über ein 8-Wege-Ventil, das per seriellem Port des Computers<br />
gesteuert wird. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53<br />
4.19 <strong>Aufnahme</strong>software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54<br />
4.20 Stimulationssoftware: Berechnete Kurven . . . . . . . . . . . . . . . . 55<br />
4.21 Stimulationssoftware: WAV-Abspielung . . . . . . . . . . . . . . . . . 56<br />
4.22 Stimulationssoftware: 2D-Muster . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56<br />
4.23 Elektrode mit Zellteppich. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58<br />
4.24 Fragliches Zellsignal. Bei einer Messung mit Stimulation zeigte sich<br />
dieses Signal. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59<br />
4.25 Vergleich des gemessenen Signals mit einem Zellsignal einer Mäusekultur<br />
(aufgenommen mit MCS-Verstärker von Paolo Bonifazi, SISSA-<br />
Institut in Triest, Italien) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . <strong>60</strong><br />
5.1 Befestigung des MEAs auf einem pin-grid-array-Sockel (PGA). . . . . 64<br />
6.1 Programmiersequenz des AD75019 Bausteins. Erklärung siehe Text.<br />
Abbildung aus Datenblatt AD75019, Analog Devices . . . . . . . . . 67
1 Einleitung<br />
Neurons are the fundamental units,<br />
”<br />
or building blocks, of the brain.<br />
Our task is to learn the meaning<br />
behind their signaling.“<br />
John G. Nicholls, From Neuron to Brain<br />
Eines <strong>der</strong> Ziele <strong>der</strong> Biowissenschaften war es schon immer gewesen, das Geheimnis<br />
des Lebens zu lüften. Je detaillierter sich <strong>der</strong> menschliche Körper untersuchen<br />
ließ, um so differenzierter wurde die Interpretation <strong>der</strong> Vorgänge, die das Phänomen<br />
Leben“ steuern. Beson<strong>der</strong>e Aufmerksamkeit galt schon sehr früh <strong>der</strong> Suche nach<br />
”<br />
<strong>der</strong> Quelle <strong>der</strong> Kreativität und Individualität <strong>der</strong> Menschen, die im Gehirn vermutet<br />
und lokalisiert wurde. Allerdings ist die Funktionsweise des Gehirns bis heute<br />
nur teilweise verstanden. Es besteht aus einer unvorstellbar hohen Zahl an Gehirnzellen<br />
(ca. 10 14 ), den sog. Neuronen, die über jeweils Tausende von Verknüpfungen<br />
miteinan<strong>der</strong> kommunizieren können.<br />
Ein möglicher Schritt zum Verständnis des Gehirns ist es, den Zellen gezielt Fragen“<br />
stellen zu können und die Antwort“ <strong>der</strong> Neuronen aufzunehmen. Hodgkin<br />
”<br />
”<br />
lokalisierte 1952 mit Hilfe von invasiven Zelluntersuchungen mit Glaselektroden den<br />
Ursprung <strong>der</strong> elektrischen Aktivität durch Ionenkanäle in <strong>der</strong> Zellmembran [Hodgkin<br />
und Huxley, 1952]. Diese konnten durch die Einführung <strong>der</strong> Patch-Clamp Technik<br />
durch [Neher und Sakmann, 1976] und [Hamill u.a., 1981] genau untersucht werden.<br />
Ein Problem dieser Technik ist es, dass beim Einsatz <strong>der</strong> Glaselektroden die Zellen<br />
auf lange Sicht zerstört werden. Diesen Nachteil konnten [Gross u.a., 1977], [Pickard,<br />
1979] und [Gross u.a., 1995] mittels Metallelektroden umgehen, die eine extrazelluläre<br />
kapazitive Signalaufnahme erlaubten. Diese in Dünnschichttechnologie hergestellten<br />
Elektroden werden Multi-Elektroden-Arrays“ (MEAs) o<strong>der</strong> auch Multi-<br />
”<br />
Mikroelektroden-Platten (MMEPs) genannt. Dem Gehirn entnommene Neuronen<br />
können in vitro 1 auf solchen Mikroelektrodenfel<strong>der</strong>n kultiviert werden [Hämmerle<br />
u.a., 1994], [Nisch u.a., 1994]. In <strong>der</strong> Regel bilden sie untereinan<strong>der</strong> Verbindungen<br />
aus und verschalten sich zu einem neuronalen Netz, das neuronalen Verknüpfungsmustern<br />
im Gehirn ähneln könnte [Habets u.a., 1987], [Corner und Ramakers, 1991],<br />
[Gross u.a., 1993]. Über die Elektroden lassen sich einerseits die elektrischen Signale<br />
<strong>der</strong> Neurone auslesen; an<strong>der</strong>erseits können die Neurone durch elektrische Pulse<br />
mittels einer Stimulationselektronik auch gereizt werden.<br />
1 In vitro: Im Reagenzglas
1. Einleitung 2<br />
In dieser Diplomarbeit wird die Entwicklung <strong>eines</strong> Messaufbaus zur <strong>Aufnahme</strong><br />
und Stimulation neuronaler Aktivität beschrieben. Grundlage dieser Messungen sind<br />
oben genannte Mikroelektrodenfel<strong>der</strong>, die über eine elektromechanische Kopplung<br />
mit einer Verstärker-, <strong>Aufnahme</strong>- und Stimulationselektronik verbunden werden.<br />
Der <strong>Aufbau</strong> gestattet, mit artifiziellen Signalmustern Lern- und Konditionierungsexperimente<br />
durchzuführen.<br />
Zum Test des Systems wurden Experimente mit differenzierten neuronalen Zellen<br />
und Herzmuskelzellen durchgeführt [Banker und Goslin, 1998]. Für an<strong>der</strong>e Fragestellungen<br />
ließen sich auch Gehirnschnitte o<strong>der</strong> Retinagewebe verwenden.<br />
Mit einem solchem <strong>Aufbau</strong> können beispielsweise folgende Fragestellungen untersucht<br />
werden:<br />
• Konditionierung ( ”<br />
Pawlowscher Hund“): Lassen sich Zellen gezielt trainieren?<br />
Ist Lernen in den sich selbstorganisierenden Netzwerken möglich ? Wenn ja,<br />
wie ? [Hasselmo und McClelland, 1999], [Kalvas und Nakamura, 1999], [Tateno<br />
und Jimbo, 1999], [Shahaf und Marom, 2001]<br />
• ”<br />
Neurocomputer“ : Kann einem solchen Netzwerk künstlich eine Art Rechenvorschrift<br />
einprogrammiert (gelehrt) werden, um Aufgaben wie z.B. Mustererkennung<br />
o<strong>der</strong> Bildmanipulation durchzuführen ? [Potter, 2001], [DeMarse u.a.,<br />
2001]<br />
• ”<br />
Neurosensor“ : Wie reagieren die Zellen auf verschiedene chemische Substanzen<br />
? Ließen sie sich zur Detektion neurotoxischer Substanzen o<strong>der</strong> zur Beurteilung<br />
neuroaktiver Pharmaka verwenden ? [Pancrazio u.a., 1998], [O’Connor<br />
u.a., 2000], [Stenger u.a., 2001]<br />
Im ersten Teil <strong>der</strong> vorliegenden Arbeit werden die Grundlagen <strong>der</strong> Neurobiologie<br />
und Elektronik dazu verhelfen, die Brücke zwischen diesen beiden sehr verschiedenen<br />
Gebieten zu schlagen. Anschließend werden die gefor<strong>der</strong>ten Eigenschaften des<br />
Systems skizziert, um zuverlässig Aktivität von elektrogenen Zellen aufnehmen und<br />
stimulieren zu können. Im folgenden Literaturteil werden existierende Lösungen vorgestellt<br />
und untereinan<strong>der</strong> verglichen.<br />
Im Abschnitt ”<br />
Materialien und Methoden“ wird <strong>der</strong> Messaufbau und dessen Komponenten<br />
beschrieben. Im Teil ”<br />
Ergebnisse und Resultate“ wird er charakterisiert<br />
und mit den existierenden Systemen verglichen. Dort werden auch die biologischen<br />
Experimente vorgestellt und diskutiert.<br />
In <strong>der</strong> abschließenden Zusammenfassung werden alle Ergebnisse zusammengestellt<br />
und in Bezug zu weiteren Experimenten und Fragestellungen gesetzt.<br />
Im Anhang finden sich die ausführlichen Beschreibungen für die Herstellung <strong>der</strong><br />
Elektronik und Rezepte <strong>der</strong> benutzten Nährstoffmedien.
Teil I<br />
Literatur- und Theorieteil
2 Literatur- und Theorieteil<br />
2.1 Biologische Grundlagen<br />
Nervenzellen (Neuronen) sind sehr komplex in ihrem Bau und ihrer Funktionsweise.<br />
Ein ganzer Zweig <strong>der</strong> Biologie beschäftigt sich mit <strong>der</strong> Beschreibung und Untersuchung<br />
dieser Zellen. Detaillierte Beschreibungen finden sich z.B. in den Lehrbüchern<br />
von [Campbell, 1998], [Silbernagl und Despopoulos, 4.Auflage, 1991], [Schmidt u.a.,<br />
28. Auflage, 2000] und [Klinke und Silbernagl, 2. Auflage, 2000].<br />
Beim Menschen finden sich drei Arten von elektrisch erregbaren Zellen, die auf<br />
einen Reiz mit einer Än<strong>der</strong>ung ihrer elektrischen Membraneigenschaften reagieren:<br />
• Nervenzellen: Erzeugung, Übertragung und Modifikation von Impulsen<br />
• Muskelzellen: Kontraktion aufgrund <strong>eines</strong> eingehenden Impulses<br />
• β−Zellen <strong>der</strong> Langerhans Inseln: Stimulation <strong>der</strong> Insulinsekretionsdrüse [Dean<br />
und Matthews, 1968], [Schuhmacher, 1997]<br />
Ziel dieser Diplomarbeit ist die Verarbeitung elektrischer Nervensignale. Zum Austausch<br />
von Informationen besitzen Neurone sowohl passive als auch spannungsgesteuerte<br />
Ionenkanäle, die durch elektrochemische Reizweiterleitung (Depolarisierung<br />
<strong>der</strong> Zellmembran in Form von sog. ”<br />
Aktionspotentialen”) die Kommunikation zwischen<br />
mehreren Zellen ermöglichen. Diese Aktionspotentiale bieten eine mögliche<br />
Schnittstelle zum Ableiten von elektrischen Zellsignalen. Es folgt eine Beschreibung<br />
<strong>der</strong> Eigenschaften des intrazellulären Informationsaustausches.<br />
2.1.1 Ruhe- und Aktionspotentiale<br />
Mittels aktiver und passiver Transportvorgänge durch die Zellmembran werden geladene<br />
Stoffe zwischen Zellinnerem und –äußerem verschoben. Die Konzentrationsunterschiede<br />
einzelner Ionensorten zwischen dem Zellinneren und dem Außenraum<br />
erzeugen eine elektrische Potentialdifferenz über <strong>der</strong> Zellmembran, das sog. Ruhemembranpotential.<br />
Bei Muskel- und Nervenzellen liegt diese Potentialdifferenz zwischen<br />
50-100 mV, wobei das Zellinnere negativ geladen ist.<br />
Wird eine elektrisch erregbare Zelle gereizt, än<strong>der</strong>t sich die Ionenleitfähigkeit <strong>der</strong><br />
Membran und dadurch ihr Potential. Bei genügend großen Reizen überschreitet das<br />
Membranpotential einen Schwellenwert, wodurch es zur Erregungsweiterleitung in<br />
einer Nervenzelle über ein sog. Aktionspotential (AP) bzw. zur Kontraktion einer
2. Literatur- und Theorieteil 5<br />
Muskelzelle kommt. Durch den Reiz wird das im Inneren <strong>der</strong> Zelle negative Ruhemembranpotential<br />
in positive Richtung umgepolt. Man spricht von ”<br />
Depolarisation“.<br />
Die Erzeugung des Aktionspotentials kann wie folgt beschrieben werden: Wird das<br />
sog. Schwellenpotential – eine Grenzspannung – überschritten, so werden lokal Na + -<br />
Kanäle aktiviert. Das Ruhemembranpotential bricht lokal sehr rasch zusammen (Depolarisationsphase<br />
des Aktionspotentials) und erreicht positive Werte (Overshoot).<br />
Die Na + -Durchlässigkeit sinkt nach < 0,1 ms wie<strong>der</strong>, die K + -Leitfähigkeit <strong>der</strong> Membran<br />
steigt jedoch gleichzeitig langsam an, was zum Wie<strong>der</strong>aufbau des Ruhemembranpotentials<br />
(Repolarisationsphase) führt. Wegen <strong>der</strong> erhöhten K + -Leitfähigkeit<br />
kommt es allerdings vorübergehend zu einer sogenannten Hyperpolarisation, die jedoch<br />
nach etwa 5-10 ms wie<strong>der</strong> abgebaut wird, da sich die K + -Kanäle wie<strong>der</strong> schließen<br />
und die ursprüngliche Ionenverteilung durch Ionenpumpen wie<strong>der</strong>hergestellt<br />
wird. Der typische Verlauf <strong>eines</strong> Aktionspotentials ist in Abbildung 2.1 dargestellt.<br />
Nach <strong>der</strong> Reizung in <strong>der</strong> Anfangsphase <strong>der</strong> Repolarisation ist die Zelle für eine kurze<br />
Zeitspanne (absolute Refraktärperiode) nicht erregbar und danach für eine weitere<br />
kurze Zeitspanne nur durch einen stärkeren Reiz erregbar (relative Refraktärperiode).<br />
Abb. 2.1: Än<strong>der</strong>ung des Membranpotentials als Funktion <strong>der</strong> Leitfähigkeit <strong>der</strong> Zellmembran<br />
für Natrium(g Na )- und Kaliumionen(g K ) und daraus resultierendes<br />
Aktionspotential (Erklärung im Text). Abbildung: [Silbernagl und<br />
Despopoulos, 4.Auflage, 1991]<br />
Die Aktionspotentiale von Nerv und quergestreiftem Muskel (Skelettmuskulatur)<br />
unterscheiden sich kaum, die Aktionspotentiale von Herzmuskeln zu Nerven jedoch<br />
sehr (Abbildung 2.2).<br />
2.1.2 Die Nervenzelle (Das Neuron)<br />
Ein typisches (motorisches) Neuron (siehe Abbildung 2.3) besteht aus einem Zellkörper<br />
(Soma), einem Axon (Neurit) und Dendriten. Das Axon bildet oft Nebenäste
2. Literatur- und Theorieteil 6<br />
Abb. 2.2: Aktionspotentiale von Nervenzellen, quergestreifter Muskulatur und Herzmuskelzellen<br />
unterscheiden sich in ihrem Aussehen. Abbildung angelehnt<br />
an: [Silbernagl und Despopoulos, 4.Auflage, 1991]<br />
(Kollaterale), die sich am Ende nochmals aufteilen und in sog. Endknöpfen (Synapsen)<br />
enden. Das Axon nimmt Verbindung zu den Dendriten, Somata, Axonen o<strong>der</strong><br />
Synapsen an<strong>der</strong>er Zellen auf. Ein einzelnes Neuron kann Tausende solcher Kontakte<br />
herstellen.<br />
Abb. 2.3: Neuron und Synapse. Abbildung: [Silbernagl und Despopoulos, 4.Auflage,<br />
1991]<br />
Die Zellmembran des Somas setzt sich als Axolemma entlang des Axons fort, das<br />
im zentralen Nervensystem (ZNS) von Oligodendrozyten, im peripheren Nervensystem<br />
(PNS) von Schwannschen Zellen umgeben ist (Axon + Hülle = Nervenfaser).<br />
Schwannsche Zellen bilden konzentrische Schichten um das Axon herum, die sog.<br />
Myelin- o<strong>der</strong> Markscheide. Sie wirkt als elektrischer Isolator (hydrophobes Lipoprotein)<br />
und ist entlang des Axons ca. alle 1,5 mm an den sog. Ranvierschen Schnürringen<br />
unterbrochen. Das Axon ist für die Reizweiterleitung zuständig.<br />
Die Synapse ist die Kontaktstelle des Axons einer Nervenzelle zu einem an<strong>der</strong>en<br />
Neuron, aber auch zu Muskel- und Drüsenzellen. Bei den Säugern findet an<br />
<strong>der</strong> Synapse (mit wenigen Ausnahmen) keine elektrische, son<strong>der</strong>n nur eine chemische<br />
Signalübertragung statt: Durch das elektrische Signal im Axon wird aus Vesikeln<br />
(Bläschen) an <strong>der</strong> präsynaptischen Membran (≡ Membran <strong>der</strong> Sen<strong>der</strong>zelle)<br />
ein Überträgerstoff (Neurotransmitter) freigesetzt, <strong>der</strong> durch den synaptischen Spalt<br />
(10-40 nm) zur postsynaptischen Membran (≡ Membran <strong>der</strong> Empfängerzelle) dif-
2. Literatur- und Theorieteil 7<br />
fundiert und dort elektrische Verän<strong>der</strong>ungen bewirkt (siehe Abbildung 2.4). Je nach<br />
Art des Überträgerstoffes führt die synaptische Übertragung zu einer Hemmung<br />
o<strong>der</strong> Erregung des Empfängerneurons. Da die postsynaptische Membran keine Neurotransmitter<br />
entsenden kann, lassen Synapsen das Signal nur in einer Richtung<br />
durch, d.h. sie haben Ventilfunktion, ohne die eine gerichtete Informationsübertragung<br />
nicht möglich wäre.<br />
Abb. 2.4: Synapse, synaptischer Spalt und synaptische Signalübertragung. Abbildung:<br />
[Silbernagl und Despopoulos, 4.Auflage, 1991]<br />
2.1.3 Reizweiterleitung<br />
Axone dienen <strong>der</strong> Erregungssweiterleitung zwischen den Neuronen. Die elektrochemische<br />
Weiterleitung des Signals erfolgt durch andauernde Neubildung des Aktionspotentials<br />
entlang <strong>der</strong> Nervenfaser. Ein Unterschied in <strong>der</strong> Leitungsgeschwindigkeit<br />
besteht zwischen marklosen Nervenfasern (ca. 1 m/s) und markhaltige Nervenfasern<br />
(ca. 120 m/s). Die Myelinscheide isoliert die Faser gegenüber <strong>der</strong> Umgebung elektrisch<br />
ab; dadurch kann das elektrische Feld über größere Distanzen (ca. 1,5 mm)<br />
wirken. Das Aktionspotential wird also ”<br />
sprunghaft“ von Schnürring zu Schnürring<br />
weitergeleitet.<br />
2.1.4 Künstliche Reizung des Neurons<br />
Nervenzellen können von außen elektrisch gereizt werden, indem mit einem Spannungspuls<br />
von bis zu 800 mV <strong>der</strong> Nerv depolarisiert wird. Fraglich ist hierbei jedoch,<br />
inwieweit die künstlichen Spannungsstöße sich von den ”<br />
natürlichen“ Reizen unterscheiden.
2. Literatur- und Theorieteil 8<br />
2.2 Elektronische Grundlagen<br />
2.2.1 Einleitung und Motivation<br />
Die Kommunikation zwischen Neuronen verläuft mittels elektrochemischer Reizweiterleitung.<br />
Ein wichtiger Schritt zum Verständnis neuronaler Information ist die<br />
Möglichkeit Signale von Nervenzellen aufnehmen zu können, um sie dann im Computer<br />
zu analysieren. Die Zellen werden auf Glasplatten kultiviert, auf die Goldelektroden<br />
mit einem Durchmesser zwischen 10 und 30 µm aufgebracht sind. Erzeugt<br />
eine Zelle, die auf einer solchen Goldelektrode liegt, ein Aktionspotential, so kann<br />
durch kapazitive Wechselwirkung auf <strong>der</strong> Goldelektrode ein Spannungswechsel von<br />
wenigen 10 µV gemessen werden. Über dünne Leiterbahnen gelangt das Signal zu<br />
einer 2×3 mm 2 großen Goldelektrode. Dort wird das Signal über einen Kontakt abgegriffen<br />
und über weitere Leiterbahnen bis zur <strong>Aufnahme</strong>elektronik weitergeleitet.<br />
Von <strong>der</strong> Zellmembran bis zur Elektronik entsteht dadurch ein Wi<strong>der</strong>stand von bis zu<br />
einigen MΩ. Um von außen kommende Störeinflüsse zu minimieren, ist eine Impedanzwandlung<br />
unumgänglich. Da typische Datenaufnahmekarten für den Computer<br />
Spannungen im Volt-Bereich aufnehmen, müssen die Signale zusätzlich verstärkt<br />
werden.<br />
In diesem Teil <strong>der</strong> vorliegenden Diplomarbeit werden die Rahmenbedingungen<br />
für die <strong>Aufnahme</strong>elektronik definiert. Zusammen mit den kompakt dargestellten<br />
Elektronik-Grundlagen kann ein Gesamtkonzept erarbeitet werden, das die endgültige<br />
Form <strong>der</strong> <strong>Aufnahme</strong>elektronik beschreibt. Der eigentliche <strong>Aufbau</strong> <strong>der</strong> Geräte<br />
wird im Teil ”<br />
Material und Methoden“ beschrieben.<br />
2.2.2 Anfor<strong>der</strong>ungen an die Elektronik<br />
Die Eigenschaften <strong>der</strong> neuronalen Zellen auf dem MEA lassen sich wie folgt zusammenfassen:<br />
Eigenschaft<br />
Dauer <strong>eines</strong> Aktionspotentials<br />
Amplitude <strong>eines</strong> kapazitiv aufgenommenen<br />
Signals <strong>eines</strong> Neurons<br />
Amplitude <strong>eines</strong> kapazitiv aufgenommenen<br />
Signals einer Herzmuskelzelle<br />
Impedanz zwischen Zelle und Verstärker<br />
Spannungsbereich <strong>der</strong> Computermesskarte<br />
Bedingung<br />
1 ms – 10 ms<br />
0 – 100 µV (hängt vom Abstand<br />
<strong>der</strong> Zelle zur Elektrode ab)<br />
0 – 10 mV (hängt vom Abstand<br />
<strong>der</strong> Zelle zur Elektrode ab)<br />
0,2 – 2 MΩ<br />
Von ± 0,1 V bis ± 10 V<br />
(beliebig einstellbar)<br />
2.2.3 Operationsverstärker<br />
Integrierte Verstärkerbausteine werden in <strong>der</strong> Elektronik Operationsverstärker genannt<br />
[Tieze und Schenk, 1989], [Wupper, 1994], [Diedrich, 2000]. In den folgenden
2. Literatur- und Theorieteil 9<br />
Abschnitten werden die jeweils beschriebenen Grundlagen mit den oben beschriebenen<br />
Eigenschaften in Verbindung gebracht. Primär handelt es sich um die folgenden<br />
Punkte:<br />
• Verstärkungsfaktor: Faktor, um den das Eingangssignal verstärkt wird<br />
• Bandbreite: Frequenzbereich, in dem <strong>der</strong> Verstärker arbeitet<br />
• Eingangswi<strong>der</strong>stand: Eigenimpedanz des Verstärkereingangs<br />
• Anstiegsrate: Geschwindigkeit, mit <strong>der</strong> <strong>der</strong> Verstärker Spannungswechsel verstärken<br />
kann<br />
2.2.4 Grundlagen<br />
Ziel <strong>eines</strong> Verstärkerbausteins ist die lineare Verstärkung (≡ Erhöhung <strong>der</strong> Amplitude)<br />
<strong>eines</strong> Eingangssignals um einen definierten Skalierungsfaktor. Das in <strong>der</strong><br />
Elektronik typische Schaltsymbol <strong>eines</strong> Operationsverstärkers (OPV) ist in Abbildung<br />
2.5 zu sehen. Statt einem einzigen Signaleingang besitzt <strong>der</strong> OPV aus technischen<br />
Gründen einen invertierenden Eingang ”<br />
–“ (positive Eingangsspannungen<br />
bewirken negative Ausgangsspannung) und einen nicht-invertierenden Eingang ”<br />
+“<br />
(die Polarität <strong>der</strong> Eingangsspannungen bleibt bei <strong>der</strong> Ausgangsspannung erhalten).<br />
Weitere Anschlüsse sind eine symmetrischen Spannungsversorgung (meist ±15 V)<br />
und ein Ausgang. Erweiterte Modelle besitzen Anschlüsse für z. B. Offset-Korrektur<br />
und Frequenzgang-Korrektur. Die typische native Verstärkung liegt zwischen 1000×<br />
bis 100.000× und kann über Rückkopplung des Ausgangs mit einem Eingang auf<br />
beliebige kleinere Verstärkungen eingestellt werden.<br />
Abb. 2.5: Schaltsymbol des Operationsverstärkers. Zwischen den beiden Eingängen<br />
( ”<br />
+“ und ”<br />
-“) liegt die Differenzspannung U D an. U P und U N sind die<br />
Spannungen zwischen <strong>der</strong> Referenz und den beiden Eingängen. Der Operationsverstärker<br />
gibt die verstärkte Spannung U a aus. Abbildung: [Tieze<br />
und Schenk, 1989]
2. Literatur- und Theorieteil 10<br />
2.2.4.1 Verstärkungsfaktor<br />
Das neuronale Signal von ca. 100 µV muss um einen Faktor 1000 – 10000 verstärkt<br />
werden, um auf ein Ausgangssignal von 100 mV – 1 V zu kommen. Da man auch in<br />
<strong>der</strong> Lage sein möchte, Herzmuskelzellen untersuchen zu können, die Amplituden bis<br />
zu 10 mV erzeugen, beschränkt man die Verstärkung auf 1000-fach.<br />
2.2.4.2 Differenzverstärkung <strong>eines</strong> Operationsverstärkers (open loop gain)<br />
Die native Verstärkung ohne Rückkopplung (≡ Gegenkopplung) nennt man Differenzverstärkung<br />
A D o<strong>der</strong> auch offene Verstärkung“ (open loop gain). Sie liegt<br />
”<br />
typischerweise im Bereich 10 4 ..10 5 . Bei realen Schaltungen werden aus technischen<br />
Gründen (z.B. Bandbreite, siehe weiter unten) jedoch selten die vollen Verstärkungsfaktoren<br />
benutzt. Daher müssen Rückkopplungsaspekte berücksichtigt werden, die<br />
in den folgenden Paragraphen behandelt werden.<br />
2.2.4.3 Rückkopplung<br />
Um die Verstärkung auf einen definierten Wert zu setzen, koppelt man über einen<br />
Wi<strong>der</strong>stand R N einen definiert abgeschwächten Teil des Ausgangssignals in den invertierten<br />
Eingang ein. Die resultierende Verstärkung ist eine Funktion von Rückkopplungswi<strong>der</strong>stand<br />
R N und Wi<strong>der</strong>stand R 1 . Eine detailliertere Darstellung <strong>der</strong><br />
mathematischen Beziehungen ist bei [Tieze und Schenk, 1989] zu finden. Man spricht<br />
von Gegenkopplung bzw. Rückkopplung. Hierbei gibt es zwei Möglichkeiten:<br />
1. Invertieren<strong>der</strong> Verstärker: Als Eingang wird <strong>der</strong> invertierende Eingang benutzt<br />
(s. Abb. 2.6a). Das verstärkte Signal ist invertiert. Für die Verstärkung A gilt:<br />
A = − R N<br />
R 1<br />
(2.1)<br />
2. Nicht-invertieren<strong>der</strong> Verstärker: Als Eingang wird <strong>der</strong> nicht-invertierende Eingang<br />
benutzt (s. Abb. 2.6b). Das verstärkte Signal bleibt bei seiner Polarität.<br />
Für die Verstärkung A gilt:<br />
A = 1 + R N<br />
R 1<br />
(2.2)<br />
Durch Variation <strong>der</strong> Rückkopplungstechnik können verschiedene anwendungsrelevante<br />
Effekte hervorgerufen werden:<br />
• Spannungsteiler: linearer Verstärker<br />
• Wi<strong>der</strong>stands-Kondensator (RC)-Netzwerke: aktiver Filter<br />
• Nichtlineare Elemente: nichtlineare Rechenoperationen<br />
Ein Operationsverstärker mit Rückkopplung kann also sowohl als linearer Verstärker,<br />
als auch als aktiver Filter verwendet werden.
2. Literatur- und Theorieteil 11<br />
Abb. 2.6: Rückkopplungsverstärkung beim a) invertierenden und b) nicht-invertierenden<br />
Verstärker. Abbildung: [Tieze und Schenk, 1989]<br />
2.2.4.4 Offset<br />
Bei realen Operationsverstärkern ist die Verstärkungskurve um ein sog. Offset U 0 im<br />
µV- bis mV-Bereich verschoben (input offset voltage). Temperaturschwankungen,<br />
Betriebsspannungsschwankungen und Laufzeiteffekte rufen weitere Offset-Effekte<br />
hervor. Die Offset-Effekte lassen sich zusammenfassen:<br />
Offsetspannung<br />
U 0 : native Spannungsdifferenz<br />
Temperaturdrift<br />
∂U 0<br />
∂T<br />
≈ 3..10 µV K<br />
Langzeitdrift<br />
Betriebsspannungsschwankungen<br />
∂U 0<br />
∂t<br />
≈ ...<br />
∂U 0<br />
∂U D<br />
µV<br />
Monat<br />
≈ 10..100 µV V<br />
Für einen ”<br />
idealen“ Verlauf muss diese Spannungsabweichung korrigiert werden.<br />
Da für die in dieser Arbeit verwendeten kommerziellen OPV die Offsetwerte vernachlässigbar<br />
klein sind, kann angenommen werden: U 0 = 0 V. Es folgt, dass die<br />
Ausgangsspannung U a proportional zur Eingangsspannung U D ist. Das verstärkte<br />
Signal ist ein lineares Abbild des ursprünglichen Signals. Eine Signalverfälschung<br />
findet nicht statt.<br />
2.2.4.5 Bandbreite<br />
Ein Verstärker muss die neuronalen Signale im Bereich von 1 ms – 10 ms Dauer<br />
verstärken können. Umgerechnet in Frequenzen sind das 1 kHz – 100 Hz. Idealerweise<br />
filtert die Elektronik Frequenzen von 50 Hz (Netzrauschen) und Frequenzen oberhalb<br />
von 10 kHz (Hochfrequenz-Störfel<strong>der</strong>, z.B. Computer) aus dem Signal. Hierzu werden<br />
aktive Filter eingesetzt, die in Abschnitt 2.2.6 besprochen werden.
2. Literatur- und Theorieteil 12<br />
2.2.4.6 Stabilitätskriterien<br />
Der Frequenzgang <strong>der</strong> Differenzverstärkung beschränkt den Verstärkungsfrequenzbereich<br />
<strong>eines</strong> OPV. Um einen OPV stabil zu halten, muss ein Tiefpass sehr niedriger<br />
Grenzfrequenz in die Schaltkreise des OPV integriert werden. Man nennt die<br />
Frequenz f T , bei <strong>der</strong> ein OPV instabil wird, Transitfrequenz. Man spricht auch vom<br />
Verstärkungs-Bandbreite-Produkt (gain bandwidth product). Der typische Frequenzgang<br />
<strong>eines</strong> unmodifizierten Verstärkers ist in Abbildung 2.7 dargestellt. Bis zu einer<br />
Frequenz von wenigen Hertz ist die Verstärkung konstant und nimmt dann kontinuierlich<br />
ab. Von Verstärkerbausteinen werden konstante Verstärkungswerte über ein<br />
breites Frequenzspektrum erwartet.<br />
Abb. 2.7: Typischer Frequenzgang <strong>der</strong> Differenzverstärkung ohne Gegenkopplung.<br />
Abbildung: [Tieze und Schenk, 1989]<br />
Der Frequenzverlauf än<strong>der</strong>t sich mit Gegenkopplung. Die Verstärkung ist weitgehend<br />
unabhängig von <strong>der</strong> nativen Verstärkung A D , solange <strong>der</strong> durch Rückkopplung<br />
eingestellte Verstärkungsfaktor viel kleiner als die native Verstärkung ist. Durch die<br />
Gegenkopplung ist man in <strong>der</strong> Lage, einen über ein breites Frequenzspektrum konstanten<br />
Verstärkungsfaktor einzustellen. Die Abbildung 2.8 stellt diese Zusammenhänge<br />
graphisch dar. Durch eine geeignete Einstellung <strong>der</strong> Wi<strong>der</strong>stände wird <strong>der</strong><br />
Faktor 1 definiert, <strong>der</strong> gleich dem Verstärkungsfaktor ist:<br />
k<br />
1<br />
k := (R 1 + R N )<br />
= A (2.3)<br />
R 1<br />
Die Herabsetzung <strong>der</strong> nativen Verstärkung auf eine gegengekoppelte Verstärkung<br />
nennt man Schleifenverstärkung g:<br />
g = k · A D (2.4)<br />
Da Signale von Gehirnzellen im kHz-Bereich liegen, muss für die <strong>Aufnahme</strong> von<br />
neuronaler Aktivität ein Operationsverstärker mindestens eine gewisse Transitfrequenz<br />
übertreffen. Dies ist ein erstes Auswahlkriterium für Operationsverstärker.<br />
Bei Signalen im kHz-Bereich und A D = 10 5 sollte die Bandbreite größer als einige<br />
100 kHz sein.
2. Literatur- und Theorieteil 13<br />
Abb. 2.8: Erhöhung <strong>der</strong> Bandbreite durch Gegenkopplung. Abbildung: [Tieze und<br />
Schenk, 1989]<br />
2.2.4.7 Eingangsruhestrom<br />
Der Eingangsruhestrom (input bias current) ist relativ groß (bipolare OPVs: 20..200<br />
nA, Feldeffekttransistor-OPVs: pA). Deswegen entsteht ein Eingangsoffsetstrom,<br />
das einen Spannungsabfall in <strong>der</strong> Spannungsquelle erzeugt. Deswegen nutzt man<br />
Feldeffekttransistor-OPV (FET-OPV), die einen niedrigen Eingangsruhestrom besitzen.<br />
2.2.4.8 Eingangswi<strong>der</strong>stand<br />
Für die beiden Gegenkopplungsformen ergeben sich unterschiedliche Eingangswi<strong>der</strong>stände:<br />
(a) Nicht-invertieren<strong>der</strong> Verstärker: Der Differenzeingangswi<strong>der</strong>stand r D wird<br />
durch die Gegenkopplung um den Faktor g hochtransformiert (Elektrometer Gegenkopplung).<br />
Anwendung: Das MEA habe eine Impedanz von r g =1 MΩ. Der Verstärkungsfehler<br />
solle kleiner als 0,1% betragen. Daraus errechnet sich, dass <strong>der</strong> Eingangswi<strong>der</strong>stand<br />
r gl größer als 1 GΩ sein muss.<br />
(b) Invertieren<strong>der</strong> Verstärker:<br />
Der Eingangswi<strong>der</strong>stand ergibt sich zu:<br />
r e = R 1 (2.5)<br />
Da <strong>der</strong> Wi<strong>der</strong>stand R 1 zwischen Verstärker und MEA geschaltet werden muss,<br />
kann kein zu großer Wi<strong>der</strong>stand genommen werden. Damit ist diese Schaltung als<br />
erste Verstärkerstufe ungeeignet.<br />
Aufgrund <strong>der</strong> hohen Impedanz <strong>der</strong> Mikroelektrodenarrays muss auf einen hohen<br />
Eingangswi<strong>der</strong>stand geachtet werden. Feldeffekttransistoren bieten ausser den<br />
niedrigen Eingangsruheströmen noch sehr hohe Eingangswi<strong>der</strong>stände, ein niedriges
2. Literatur- und Theorieteil 14<br />
Rauschen und sehr hohe Verstärkungsbandbreiten. Wie in 2.2.4.7 und 2.2.4.8 diskutiert,<br />
steht das zweite Auswahlkriterium für Operationsverstärker fest: Sie müssen<br />
mit Feldeffekttransistoren aufgebaut sein und <strong>der</strong> Kontakt mit dem MEA sollte von<br />
einer nicht-invertierenden Verstärkerstufe wegen des höheren Eingangswi<strong>der</strong>standes<br />
übernommen werden. Der Eingangswi<strong>der</strong>stand sollte größer als 1 GΩ sein (siehe<br />
Anwendung weiter oben).<br />
2.2.4.9 Anstiegsgeschwindigkeit (slew rate)<br />
Neuronale Signale besitzen Signale von 1 ms Dauer und ca. 100 µV Amplitude. Ein<br />
Verstärker muss in <strong>der</strong> Lage sein, die Flanken des Signals schnell genug verstärken zu<br />
können, damit die neuronale Information möglichst unverfälscht bis zum Computer<br />
gelangen kann. Damit ergibt sich die maximale Frequenz, die ohne Verzerrungen verstärkt<br />
werden kann (Sinus-Schwingung angenommen) durch die Anstiegsgeschwindigkeit<br />
dUa <strong>der</strong> Ausgangsspannung <strong>eines</strong> Operationsverstärkers:<br />
dt<br />
dU a<br />
dt<br />
∣ = 2πfÛa (2.6)<br />
max<br />
Nimmt man für Signale eine maximale Frequenz von f max = 10 kHz an, so ergibt<br />
sich eine Anstiegsgeschwindigkeit von 0,6 V/µs. Dies ist die dritte Anfor<strong>der</strong>ung an<br />
einen Operationsverstärker, <strong>der</strong> als MEA-Verstärker eingesetzt werden kann. Auch<br />
bei <strong>der</strong> Anstiegsgeschwindigkeit haben Feldeffekttransistoren sehr gute Eigenschaften.<br />
2.2.5 Zusammenfassung Verstärkerbaustein-Kriterien<br />
Zusammenfassend konnten folgende Kriterien gefunden werden:<br />
Bedingung<br />
Transitfrequenz<br />
Eingangswi<strong>der</strong>stand<br />
Verstärkeraufbau<br />
Wert<br />
einige 100 kHz<br />
> 1 GΩ ≡ 10 9 Ω<br />
FET (Feldeffekttransistoren)<br />
Anstiegsgeschwindigkeit > 0,6 V µs<br />
2.2.6 Filter<br />
Da Störsignale von Spannungsnetz und Computer die schwachen neuronalen Signale<br />
überdecken o<strong>der</strong> nicht existierende Informationen vortäuschen könnten, ist<br />
man daran interessiert, diese Störungen herauszufiltern. Für diese Zwecke nutzt<br />
man Operationsverstärker mit RC-Kopplung. Je nach Verschaltung <strong>der</strong> Kapazitäten<br />
und Wi<strong>der</strong>stände entstehen Hochpass-, Tiefpass- o<strong>der</strong> Bandpassfilter. Für die<br />
50Hz-Netzspannung benötigt man einen Hochpassfilter, <strong>der</strong> bei etwa 100 Hz seine<br />
Grenzfrequenz hat. Für das störende Hochfrequenz-Rauschen benötigt man einen<br />
Tiefpass mit etwa 10 – 20 kHz Grenzfrequenz.
2. Literatur- und Theorieteil 15<br />
Die Stärke <strong>der</strong> Abschwächung <strong>der</strong> ungewünschten Frequenzen <strong>eines</strong> Filters hängt<br />
von <strong>der</strong> Anzahl <strong>der</strong> Filterstufen ab, die hintereinan<strong>der</strong>geschaltet werden. Man spricht<br />
von <strong>der</strong> sog. Filterordnung. In den Abbildungen 2.9 und 2.10 sind die ersten beiden<br />
Ordnungen <strong>eines</strong> Tiefpass- und Hochpassfilters dargestellt. Der in den Schaltungen<br />
enthaltene Verstärker dient jeweils <strong>der</strong> Impedanzwandlung von Ein- und Ausgang.<br />
Abb. 2.9: Tiefpassfilter erster und zweiter Ordnung. Der Wi<strong>der</strong>stand R 1 lässt alle<br />
Frequenzen passieren. Über die Kapazität werden die hochfrequenten<br />
Anteile über die Masse vermin<strong>der</strong>t.<br />
Abb. 2.10: Hochpassfilter erster und zweiter Ordnung. Die Kapazität lässt nur hohe<br />
Frequenzen passieren. Über den Wi<strong>der</strong>stand können eventuelle Gleichstromanteile<br />
zwischen <strong>der</strong> Kapazität und dem Verstärker abfließen.
2. Literatur- und Theorieteil 16<br />
2.3 Elektroden zur <strong>Aufnahme</strong> von Zellsignalen<br />
Zur Ableitung neuronaler Signale werden Elektroden benötigt. Für verschiedenste<br />
Anwendungsgebiete wurden unterschiedliche Elektrodenformen entwickelt, die im<br />
Folgenden beschrieben werden. Eine Übersicht über die meistgenutzten <strong>Aufnahme</strong>techniken<br />
ist in Abbildung 2.11 dargestellt.<br />
pA<br />
Patch-clamping<br />
mV<br />
50<br />
Intrazelluläre<br />
Nadelelektroden<br />
offen<br />
geschlossen 0<br />
0<br />
Schwellenwert<br />
Ruhepotential<br />
µV<br />
0<br />
Extrazelluläre<br />
Nadelelektroden<br />
2<br />
B<br />
4 ms<br />
2 4<br />
C<br />
A D<br />
ms<br />
rel. Intensität<br />
Optische <strong>Aufnahme</strong><br />
Intrinsische Signale<br />
(Reflexion), Farbstoffe: relative<br />
Absorption o<strong>der</strong> Fluoreszenz<br />
1<br />
2<br />
s<br />
Gegen-<br />
Referenz<br />
elektrode<br />
E<br />
µV<br />
100<br />
0<br />
2<br />
4<br />
ms<br />
Extrazelluläre<br />
Mikroelektrodenfel<strong>der</strong><br />
(MEAs, MMEPS)<br />
Basislinie<br />
2<br />
4<br />
ms<br />
Abb. 2.11: Schematische Darstellung <strong>der</strong> prinzipiellen Möglichkeiten <strong>der</strong> Signalerfassung<br />
an (Nerven-) Zellen und <strong>der</strong> zu erwartenden Signaltypen. Abbildung:<br />
[Blau, 1995]<br />
2.3.1 Einzelne Ableitungs- und Stimulationselektroden<br />
Erste Zellableitungen an Neuronen wurden mit Metallmikroelektroden durchgeführt.<br />
Mit zwei Elektroden wurde die Potentialdifferenz zwischen Zellinnerem und<br />
-äußerem gemessen. Die maximale Messzeit ist beschränkt, da die Zelle durch das<br />
Anstechen mit <strong>der</strong> Metallelektrode innerhalb von Minuten bis Stunden stirbt. Die<br />
Untersuchung extrazellulärer Signale von Nervenbündeln wurde mit kurzen zylin<strong>der</strong>förmigen<br />
Manschettenelektroden durchgeführt, die auch in das Gewebe implantiert<br />
werden können.
2. Literatur- und Theorieteil 17<br />
in-vivo Elektroden<br />
Eine weitere Klasse von Elektroden sind die in-vivo Elektroden, bei denen Elektroden<br />
direkt in den Körper implantiert werden [Kim und Kim, 2000], [Hofmann u.a.,<br />
2000] und [Folkers und Hofmann]. Sie eignen sich zum Studium und zur Steuerung<br />
von Gehirnbereichen [Nicolelis, 2001], [Henze u.a., 2000] o<strong>der</strong> als Interface zwischen<br />
biologischem Gewebe und Elektronik. Durch unterschiedliche Anwendungsfel<strong>der</strong> entstanden<br />
verschiedenste Elektrodenformen [Blau, 1995].<br />
2.3.2 patch-clamp Technik<br />
Traditionelle elektrophysiologische Ableitungen von Zellen wurden mittels Glasmikropipettenelektroden<br />
realisiert [Neher und Sakmann, 1976], [Land u.a., 2001]. Diese<br />
Methode ermöglicht in-vitro-Experimente mit Einzelzellen, bei denen die Eigenschaften<br />
<strong>der</strong> Neuronen, <strong>der</strong>en Ionenkanäle und ihrer Synapsen erforscht werden können<br />
[Fitzsimonds u.a., 1997]. Die Aktivität einzelner Ionenkanäle lässt sich mit den Strömen<br />
messen, die durch eine konstant angelegte Spannung hervorgerufen werden. Die<br />
Mikropipette wird konzentrisch um einen Ionenkanal angebracht und mit einem<br />
leichten Unterdruck an <strong>der</strong> Membran <strong>der</strong> Zelle festgesaugt. Dadurch wird <strong>der</strong> Ionenkanal<br />
gegenüber <strong>der</strong> Extrazellulärflüssigkeit isoliert. Der Ionenstrom durch den<br />
<strong>Kanal</strong> wird messbar. Da mit dieser Technik nur wenige Einzelzellen unter hohem<br />
Zeitaufwand per Mikromanipulator kontaktiert werden können, sind Untersuchungen<br />
des Netzwerkverhaltens jedoch nicht möglich.<br />
2.3.3 Mikroelektrodenfel<strong>der</strong><br />
Extrazelluläre Ableitungen mit Multielektrodenarrays (MEA) ermöglichen die gleichzeitige<br />
<strong>Aufnahme</strong> <strong>der</strong> Netzwerkaktivität von Hun<strong>der</strong>ten von Neuronen. Thomas<br />
[Thomas u.a., 1972] nutzte Elektrodenarrays um Feldpotentiale von spontan kontrahierenden<br />
Herzmuskelzellen untersuchen zu können. Die <strong>Aufnahme</strong> von Einzelzellaktivität<br />
war allerdings nicht möglich. Gross [Gross, 1979] und Pine [Pine, 1980]<br />
entwickelten unabhängig voneinan<strong>der</strong> Elektrodenfel<strong>der</strong>, die gleichzeitig viele Einzelzellmessungen<br />
von neuronalen Netzwerken erlaubten. Es entstand eine Vielzahl<br />
verschiedener Elektrodenformen, unterschiedliche Hardwaresysteme und Software<br />
[Eggers u.a., 1990], [Novak und Wheeler, 1986], [Gross und Schwalm, 1994], [Pine,<br />
1987], [Jimbo und Kawana, 1992].<br />
Multielektrodenarrays (siehe Abbidlung 2.14) mit mindestens <strong>60</strong> Elektroden sind<br />
jetzt kommerziell von Multichannelsystems [MCS], Panasonic [Panasonic] und Günter<br />
Gross [CNNS] erhältlich. Die MEAs bestehen meist aus planaren Elektroden<br />
von 10 – 100 µm Durchmesser, die auf einem Substrat aus Glas o<strong>der</strong> Silizium aufgebracht<br />
sind. Als Elektrodenmaterial wird Gold o<strong>der</strong> durchsichtiges Indium-Zinn-<br />
Oxid (ITO) verwendet. Um die Kapazität <strong>der</strong> Elektroden zu verbessern, kann poröses<br />
Platin ( ”<br />
platinum black“) elektrochemisch abgeschieden werden, das aufgrund<br />
einer dreidimensionalen Topographie eine große Oberfläche besitzt. Zur Verbesserung<br />
<strong>der</strong> Impedanz kann Iridium-Oxid [Blau u.a., 1997] o<strong>der</strong> Titan-Nitrid [Egert
2. Literatur- und Theorieteil 18<br />
Abb. 2.12: Ein <strong>60</strong>-Elektroden Mikroelektrodenarray (MEA). Abbildung: MCS<br />
u.a., 1998] aufgesputtert werden. Die Isolierung <strong>der</strong> Leiterbahnen wird typischerweise<br />
mit Polyimid o<strong>der</strong> Siliziumnitrid/-oxid vorgenommen. Verbesserungen <strong>der</strong> Kultivierungsbedingungen<br />
ermöglichen es, die Zellen über lange Zeit am Leben und<br />
elektrisch aktiv zu halten [Potter und DeMarse, 2001]. Auch an<strong>der</strong>e Zelltypen können<br />
untersucht werden, z.B. Retinagewebe [Stett u.a., 2000] o<strong>der</strong> Herzmuskelzellen<br />
(HMZ) [Thomas u.a., 1972]. Für Gehirnschnitte (slices) wurden dreidimensionale<br />
Fakir” MEAs entwickelt [Heuschkel u.a., 2001], die in Abbildung 2.13 mit planaren<br />
”<br />
Elektroden verglichen werden, da die durch die Präparation abgestorbenen äußeren<br />
Zellschichten von <strong>der</strong> spitzen Elektrode durchbohrt werden.<br />
Marc Heuschkel bietet mit Ayanda Biosystems MEAs an, die kompatibel zum<br />
MCS System sind. Im Unterschied zu MCS benutzt Heuschkel Elektrodenarrays, die<br />
in einem photolitographischen Prozess erstellt und auf eine Trägerplatinen gebondet<br />
wurden.<br />
Glas-Multielektrodenfel<strong>der</strong> führen die Elektrodenfel<strong>der</strong> auf Gold- o<strong>der</strong> ITO-Leiterbahnen<br />
an die Elektronik, was bei einer Erhöhung <strong>der</strong> Elektrodenzahl wegen zu<br />
großen Übersprechens und zu langen Leitungen auf Grenzen stößt.<br />
2.3.4 CMOS Neurochips<br />
[Fromherz und Stett, 1995] und [Offenhäusser u.a., 1997] benutzen auf Feld-Effekt-<br />
Transistoren basierende Neurochips statt <strong>der</strong> Elektroden auf Glassubstrat, bei denen<br />
die Zellen auf dem Gate des Transistors kultiviert werden.
2. Literatur- und Theorieteil 19<br />
Abb. 2.13: Bildlicher Vergleich von planarem Elektrodentyp (links) und 3D-Fakir<br />
Elektrodentyp (rechts). Die planaren Elektroden werden für dissoziierte<br />
Zellkuluren und die 3D-Elektroden für Gehirnschnitte eingesetzt. Abbildung:<br />
Marc Heuschkel<br />
Weitere Untersuchungen des Netzwerkverhaltens von neuronalen Zellen erfor<strong>der</strong>n<br />
eine Erhöhung <strong>der</strong> Elektrodenanzahl. Nisch stellt in [Bucher u.a., 2001] lichtaddressierbare<br />
MEAs vor, die bis zu 3<strong>60</strong>0 sub-µm Elektroden haben. Allerdings lassen sich<br />
die Elektroden nur seriell auslesen.<br />
Das europäische INPRO-Projekt hat die Erstellung von CMOS-Chips mit etwa<br />
1000 Elektroden und integrierter Verstärker-, Stimulations- und Datenübertragungselektronik<br />
zum Ziel. Dieses Projekt wird unter 2.4.2.2 näher beschrieben.<br />
CMOS Chips eigenen sich für hohe Elektrodenanzahl durch die Integration <strong>der</strong><br />
Verstärkerelektronik und <strong>der</strong> Analog-Digital-Wandlung auf dem Chip. Dadurch müssen<br />
nur wenige Datenleitungen nach außen geführt werden. CMOS-Chips sind günstig<br />
und durch die Wafer-Technik in großen Stückzahlen produzierbar.<br />
2.3.5 Optische <strong>Aufnahme</strong>methoden<br />
Einen komplett an<strong>der</strong>en Ansatz ohne Elektroden verfolgen Arbeitsgruppen, die mit<br />
spannungsabhängigen Farbstoffen arbeiten [Wu u.a., 1998], [Hüser u.a., 1996]. Probleme<br />
bereiten hier das schnelle Ausbleichen <strong>der</strong> Farbstoffe (bleaching) und die dabei<br />
entstehenden toxischen Stoffe. Die <strong>Aufnahme</strong> neuronaler Aktivität erfor<strong>der</strong>t eine<br />
technisch hochwertige Ausrüstung, da ein Aktionspotential eine Lichtintensitätsverän<strong>der</strong>ung<br />
von ca. 1% hervorruft und damit das Signal- zu Rauschverhältnis sehr<br />
schlecht ist. Weiterhin benötigt man eine hohe Auflösung, um auch Details auf <strong>der</strong><br />
Zellmembran erkennen zu können. Damit Aktionspotentiale zeitlich aufgelöst wer-
2. Literatur- und Theorieteil 20<br />
den können, muss eine Bildwie<strong>der</strong>holrate im sub-Millisekundenbereich durch teure<br />
CCD-Hochgeschwindigkeitskameras erkauft werden.<br />
Die Stimulation <strong>der</strong> Zellen kann entwe<strong>der</strong> elektrisch über konventionelle Elektroden<br />
erfolgen o<strong>der</strong> per Laserstrahl über die Aktivierung von Neurotransmittern per<br />
uncaging”-Technik, bei <strong>der</strong> modifizierte Neurotransmitter mittels Laserlicht gezielt<br />
”<br />
freigesetzt werden können [Park u.a., 2002], [Caucheteux-Silberzan u.a., 1993].
2. Literatur- und Theorieteil 21<br />
2.4 <strong>Aufnahme</strong>systeme<br />
2.4.1 MEA basierte Systeme<br />
2.4.1.1 Multichannelsystems<br />
Multichannelsystems (MCS) bietet ein <strong>60</strong>-<strong>Kanal</strong> Verstärkersystem für MEAs des<br />
Naturwissenschaftlichen und Medizinischen Institutes an <strong>der</strong> Universität Tübingen<br />
(NMI) an. Die 1200-fache Verstärkung ist mit einem integrierten Frequenzfilter verbunden,<br />
<strong>der</strong> fest verdrahtet im Bereich zwischen 1 Hz und 5000 Hz ausgeliefert werden<br />
kann. Zur <strong>Aufnahme</strong> dient ein Computer mit einer Analog-Digital-Wandlerkarte<br />
(AD-Karte) und <strong>der</strong> Software MC Rack.<br />
Die Stimulation erfolgt getrennt von <strong>der</strong> <strong>Aufnahme</strong>-Hard- und -Software durch<br />
eine Stimulationseinheit mit einem bis acht Kanälen. Die stimulierten Elektroden<br />
werden mittels Kabel auf einen deaktivierten <strong>Kanal</strong> des Verstärkers gesteckt. Mit<br />
jedem Stimulationskanal geht ein <strong>Aufnahme</strong>kanal verloren. Aufgrund <strong>der</strong> technischen<br />
Eigenschaften ist damit eine dynamische Auswahl von Stimulationskanälen<br />
nicht möglich. Auch das direkte Aufnehmen <strong>eines</strong> stimulierten <strong>Kanal</strong>s kann nicht<br />
vorgenommen werden.<br />
Abb. 2.14: <strong>60</strong>-<strong>Kanal</strong>verstärker von Multichannelsystems.<br />
2.4.1.2 Panasonic<br />
Panasonic bietet ein 64-<strong>Kanal</strong> Verstärkersystem für Pansonic-spezifische MEAs an.<br />
Diese sind nicht MCS-kompatibel. Die 1000-fache Verstärkung erfolgt in einem externen<br />
Verstärkersystem, das sich in einem 19” Rack befindet. Die Kontaktierung<br />
mit dem MEA ist passiv und beinhaltet keine Vorverstärkung, was durch lange Kabellängen<br />
Rauschen mit sich bringt. Die Daten werden mit einem Computer und
2. Literatur- und Theorieteil 22<br />
<strong>der</strong> Software ”<br />
Performer” aufgenommen. Eine Stimulationsmöglichkeit ist nicht vorgesehen,<br />
was den Einsatzbereich einschränkt.<br />
2.4.1.3 Plexon<br />
Die Firma Plexon vertreibt einen Verstärker, <strong>der</strong> mit MEAs von Günter Gross<br />
(CNNS, U. of N. Texas) zusammenarbeitet. Im Gegensatz zu den an<strong>der</strong>en Systemen<br />
arbeitet das Plexon-System mit digitalen Signal Prozessoren (DSP), die die<br />
Analog-Digital-Wandlung vornehmen und eine erste Vorverarbeitung ermöglichen.<br />
Die <strong>Aufnahme</strong> <strong>der</strong> Daten erfolgt mit einem Computer.<br />
Eine Stimulationsmöglichkeit ist nicht vorgesehen.<br />
2.4.1.4 Nippon Telegraph & Telephone (NT&T)<br />
NT&T in Japan arbeitet mit Jimbo in den Kawana-Laboratorien zusammen. Das<br />
von Jimbo entwickelte Gerät ist nicht kommerziell erhältlich.<br />
2.4.2 CMOS basierte Systeme<br />
Die Zellen werden auf CMOS-Chips mit Feldeffekttransistoren (FET) kultiviert.<br />
Der Vorteil bei diesen Systemen ist die Nähe <strong>der</strong> Verstärkerelektronik zu den Zellen.<br />
Statt auf einer Elektrode sitzen die Zellen auf einem Transistor, <strong>der</strong> die erste<br />
Verstärkungsstufe darstellt. Das Signal zu Rausch Verhältnis ist dadurch sehr gut<br />
im Vergleich zu den reinen Elektroden-MEAs. Weiterhin ist die Produktion dieser<br />
CMOS Chips wesentlich günstiger.<br />
2.4.2.1 Andreas Offenhäusser<br />
[Krause u.a., 2000] beschreibt ein CMOS basiertes System, das im Max-Planck-<br />
Institut für Polymerforschung in Mainz unter Wolfgang Knoll entwickelt wurde.<br />
Dieses System ermöglicht keine direkte extrazelluläre Stimulation.<br />
2.4.2.2 INPRO<br />
Zielsetzung des europäischen ”<br />
INformation PROcessing by Natural Neural networks”<br />
-Projektes (INPRO) ist die parallele Datenverarbeitung mit neuronalen Zellen. In<br />
einem ersten Schritt sollen Tiefpass-Filtereigenschaften <strong>der</strong> Zellen verifiziert werden,<br />
die in eine Mustererkennung münden. Den Zellen wird ein S/W-Bild unter<br />
Annahme <strong>eines</strong> neuronalen Codes präsentiert, die dieses Bild mit vorher gelernten<br />
Bil<strong>der</strong> vergleichen und charakterisieren sollen. Grundlage bildet ein von <strong>der</strong><br />
ETH Zürich entwickeltes CMOS-MEA mit integrierter Verstärker-, Stimulationsund<br />
Datenübertragungsstufe. Die Nährstoff- und Neuropharmakaversorgung wird<br />
mittels <strong>eines</strong> Flusskammersystems <strong>der</strong> Universität Neuchâtel gesichert. Biokompatibilität<br />
und Datenauswertealgorithmen werden von <strong>der</strong> Universität Kaiserslautern<br />
getestet. Die theoretischen Grundlagen werden vom SISSA-Institut <strong>der</strong> Universität<br />
Triest entwickelt. Geplant ist ein Array von etwa 1000 Elektroden.
2. Literatur- und Theorieteil 23<br />
2.5 Experimente und Anwendungen zellbasierter<br />
Systeme<br />
Der Einsatz von MEAs bietet ein weitreichendes Einsatzgebiet:<br />
• Pharmascreening: Schnelle, einfache, kostengünstige und reproduzierbare Untersuchungen<br />
von pharmakologischen Substanzen. Dadurch sind weniger ethisch<br />
bedenkliche Tierexperimente nötig.<br />
• Parallele Datenverarbeitung: Viele Daten des neuronalen Netzes können gleichzeitig<br />
ausgelesen werden. Dadurch können viele Daten in kurzer Zeit charakterisiert<br />
werden. Beson<strong>der</strong>s für Datenextraktion ist diese Anwendung interessant,<br />
da <strong>der</strong>zeitige Computerchips diese Aufgaben aufgrund ihres seriellen<br />
Vorgehens nur sehr mangelhaft lösen können.<br />
• Physiologische Untersuchungen: Die Analyse von verteilten Codes des Gehirns<br />
[Singer, December 2000] wird durch Messung von Korrelationseffekten von<br />
mehreren neuronalen Antworten gleichzeitig möglich.<br />
• Histologische Untersuchungen: Mittels Gehirnschnitten und Fakirelektroden<br />
können histologische Fragestellungen untersucht werden.<br />
2.5.1 Dissoziierte Zellen<br />
2.5.1.1 Modelle <strong>der</strong> Wirklichkeit<br />
Die Multielektrodentechnik erleichtert die Suche nach einer Theorie <strong>der</strong> Zell-Zell-<br />
Interaktion [Singer, December 2000]. Untersucht werden die Potentialformen <strong>der</strong><br />
Neuronen, die sogenannten Feldpotentiale. In Kombination mit Modellrechnungen<br />
werden Theorien zum <strong>Aufbau</strong> und <strong>der</strong> Funktionsweise von Neuronen aufgestellt<br />
und verfeinert. Durch Ersatzschaltbil<strong>der</strong> und Modellsysteme können Zellmembran,<br />
Medium und Ionenkanäle simuliert und nachgebildet werden, um die <strong>Physik</strong> und<br />
Physiologie <strong>der</strong> Zellen besser verstehen zu können.<br />
2.5.1.2 Lernen und Gedächtnis<br />
Durch Langzeituntersuchungen mit kombinierten Stimulationen können Lernphänomene<br />
untersucht werden. Hierbei handelt es sich um Verän<strong>der</strong>ungen in <strong>der</strong> Aktivierungsbarriere<br />
für Aktionspotentiale. Man spricht von Long Term Potentiation<br />
(LTP) für eine Herabsenkung <strong>der</strong> Aktivierungsschwelle und von Long Term Depression<br />
(LTD) für eine Anhebung <strong>der</strong> Aktivierungsschwelle. Von physiologischer Seite<br />
interessiert man sich für die Verän<strong>der</strong>ungen innerhalb <strong>der</strong> Zelle bei diesen Phänomenen<br />
1 . Fraglich ist, ob sich nur Än<strong>der</strong>ungen auf <strong>der</strong> Zellmembran ergeben o<strong>der</strong> ob<br />
sich auch <strong>der</strong> Zellmetabolismus än<strong>der</strong>t.<br />
1 Die Häufigkeitsverteilung <strong>der</strong> Proteine in <strong>der</strong> Zellmembran könnte sich verän<strong>der</strong>t haben.
2. Literatur- und Theorieteil 24<br />
Shahaf [Shahaf und Marom, 2001] stellte ein erstes Experiment vor, bei dem ein<br />
neuronales Netz gezielt so lange stimuliert wurde, bis eine definierte Antwortsequenz<br />
gemessen wurde. Es konnte gezeigt werden, dass die Zellen nach einer gewissen Zeit<br />
auf das Signal reproduzierbar antworten.<br />
2.5.1.3 Neuronaler Code<br />
Bis heute ist die Sprache, mit <strong>der</strong> die Neuronen kommunizieren, nicht verstanden.<br />
Dieser ”<br />
Neuronale Code” wird daher von vielen Arbeitsgruppen untersucht [Meister<br />
und II, 1999].<br />
Aus <strong>der</strong> Aktivität <strong>der</strong> Neuronen versucht man durch definierte Stimulationsanfragen<br />
mittels Korrelationsfunktionen, Wavelettanalyse und stochastische Resonanzmethoden<br />
Antwortmuster zu erkennen. Beson<strong>der</strong>e Aufmerksamkeit wird bei <strong>der</strong> Analyse<br />
des Neuronalen Codes den Spikes gewidmet ( ”<br />
burst analysis”). Neuropharmaka<br />
führen Än<strong>der</strong>ungen <strong>der</strong> Signale herbei, die mit Modellen erklärt werden können. Dadurch<br />
wird das Herausfinden von Regelmäßigkeiten und Zeitkonstanten vereinfacht.<br />
2.5.1.4 Datenverarbeitung - Parallel Processing und Data Mining<br />
Ein weiteres fruchtbares Anwendungsfeld besteht in <strong>der</strong> parallelen Datenverarbeitung<br />
(Parallel Processing). Vernetzte Gehirnzellen sind für die Auswertung verrauschter<br />
Daten, massive parallele Datenverarbeitung und für die Untersuchung<br />
versteckter Zusammenhänge (Data Mining) in Daten ideal geeignet. Vergleichbar<br />
hiermit sind die Bemühungen <strong>der</strong> künstlichen Intelligenz [Fayyad u.a., 1996].<br />
2.5.1.5 Neuro-Interfaces<br />
Menschen, die ein teilweise durchtrenntes Rückenmark besitzen o<strong>der</strong> denen Körperteile<br />
fehlen, besitzen meist im Gehirn noch die vollen Fähigkeiten zur Kontrolle dieser<br />
Organe. Die Sensorinformationen und motorischen Steuersignale kommen nicht<br />
mehr an <strong>der</strong> für sie bestimmten Stelle an. Durch geeignete Platzierung von Elektroden<br />
können neue Signalpfade mittels einer Elektronik künstlich hergestellt werden<br />
und neue Lebensqualität durch diese ”<br />
Neuroimplantate” erzielt werden [Nicolelis,<br />
2001]. Probleme bereitet beson<strong>der</strong>s die Schnittstelle zwischen den Zellen und <strong>der</strong><br />
Elektronik [Rutten u.a., 2001]. Daher wurden Zell-Substrat-Adhäsionsvermittler,<br />
biokompatible Materialien und geeignete Beschichtungen untersucht [Blau, 1995],<br />
[Blau, 1999].<br />
2.5.1.6 Biosensoren<br />
Ziegler beschreibt in einem Review-Artikel [Ziegler, 2000] die Anwendungen zellbasierter<br />
Systeme als Biosensoren. Neuronen können in pharmakologische Screeningverfahren<br />
einbezogen werden, um die Wirksamkeit von Substanzen testen zu können.<br />
Weiterhin eignen sich die Zellen als Sensoren für toxische Stoffe. Diese Klasse von<br />
Zellsensoren werden ”<br />
Cell Monitoring System“ (CMS) genannt und sind für spezielle<br />
Anwendungen, z.B. pH-Messungen bereits realisiert [Baumann u.a., 1999].
2. Literatur- und Theorieteil 25<br />
2.5.2 Gehirnschnitte<br />
Die Untersuchung <strong>der</strong> Funktionsweise verschiedener Gehirnregionen und <strong>der</strong>en Interaktion<br />
erfor<strong>der</strong>t Gehirnschnitte, <strong>der</strong>en Struktur in zwei Dimensionen erhalten bleibt.<br />
Dadurch sind definierte Input/Output-Stellen von verschiedensten Gehirnregionen<br />
erreichbar. Durch die Präparation <strong>der</strong> Gehirnschnitte sterben die äußersten Zelllagen<br />
ab. Bei <strong>der</strong> <strong>Aufnahme</strong> und Stimulation <strong>der</strong> verbleibenden lebenden Neuronen<br />
sind die abgestorbenen Zelllagen im Weg und verschlechtern das Signal-zu-Rausch-<br />
Verhältnis. Heuschkel [Heuschkel u.a., 2001] beschreibt eine 3D-Elektrodenform, die<br />
mit räumlich strukturierten Elektrodenspitzen durch die tote Zelllage hindurchgehen<br />
und direkt an den lebenden Zellschichten ableiten. Weiterhin können durch die<br />
Dicke <strong>der</strong> Gehirnschnitte (engl.: slices) von einigen Zelllagen (Bereich 100 - 200 µm)<br />
die Neuronen schlecht mit Nährstoffen versorgt werden. Derzeit sind daher poröse<br />
Mikroelektrodenstrukturen in Entwicklung.<br />
[Fromherz, 2002] stellt ein Modell vor, dass Gehirnschnitte auf MEAs simuliert.<br />
Es basiert auf dem von [Hodgkin und Huxley, 1952] vorgeschlagenen Modell.
Teil II<br />
Materialien und Methoden
3 Materialien und Methoden<br />
3.1 Messaufbau<br />
Der Messaufbau dient <strong>der</strong> <strong>Aufnahme</strong> und Stimulation neuronaler Signale. Eine schematische<br />
Skizze <strong>der</strong> Apparatur ist in Abbildung 3.1 zu sehen. Das Zellsignal wird<br />
durch die <strong>Aufnahme</strong>elektronik verstärkt und in einem Computer aufgenommen (oberer<br />
Teil <strong>der</strong> Abbildung). Die Reizung <strong>der</strong> Zellen findet durch die Stimulationselektronik<br />
statt (unterer Teil <strong>der</strong> Abbildung). In <strong>der</strong> Darstellung sind die Lebenserhaltungssysteme<br />
für die Zellen nicht dargestellt. Primär handelt es sich um eine Heizung, die<br />
physiologische Temperaturen um 37 ◦ C im Nährmedium konstant hält. Diese Geräte<br />
werden im Abschnitt 3.1.4 beschrieben.<br />
N<br />
N<br />
N<br />
N 8 A H I J H A H<br />
* = @ F = I I . E J A H<br />
) , = H J A<br />
A A <br />
- A J H @ A<br />
2 +<br />
F F K C I I ? D = J A H , ) = H J A<br />
Abb. 3.1: Schematische Darstellung des Messaufbaus (Erklärung im Text)<br />
In den folgenden Abschnitten werden die verwendeten Bauteile und Methoden<br />
beschrieben. Wichtigster Teil des Messaufbaus ist <strong>der</strong> Verstärker, <strong>der</strong> die schwer<br />
messbare neuronale Netzwerkaktivität so verstärkt, dass sie von einer Computer-<br />
Messkarte detektierbar ist. Dies wird im Teil ”<br />
<strong>Aufnahme</strong>lektronik” behandelt. Die<br />
Informationen werden von einer Analog-Digital-Wandlerkarte im PC aufgenommen<br />
und mit einer in C++ programmierten Software ausgewertet.<br />
Der Teil ”<br />
Stimulationselektronik”beschreibt die künstliche Reizung <strong>der</strong> Nervenzellen<br />
durch eine Digital-Analog-Wandlerkarte im PC, <strong>der</strong>en Signale über elektronische<br />
Schalter auf die einzelnen Elektroden eingekoppelt werden können. Die Steuerung<br />
<strong>der</strong> Stimulation findet synchron in Verbindung mit <strong>der</strong> <strong>Aufnahme</strong>software statt.
3. Materialien und Methoden 28<br />
Auf die Lebenserhaltungssysteme wie z.B. Heizung wird im Abschnitt ”<br />
Peripherie”<br />
eingegangen. Die eigentliche Präparation <strong>der</strong> Zellen wird im Abschnitt ”<br />
Zellkulturen”<br />
beschrieben.<br />
3.1.1 <strong>Aufnahme</strong>elektronik<br />
3.1.1.1 Verstärkereinheit<br />
Typische Analog-Digital-Wandlerkarten (A/D-Wandler) für den Computer zur <strong>Aufnahme</strong><br />
von analogen Signalen können Spannungsbereiche zwischen -10 V bis +10 V<br />
aufnehmen. Mit einer Auflösung von 12-bit wird dieser Spannungsbereich linear in<br />
2 12 ( = 4096) Teile aufgeteilt. Dadurch können Spannungsdifferenzen von etwa 5 mV<br />
aufgelöst werden. Da typische neuronale Signale im Bereich weniger µV liegen, muss<br />
zwischen den Zellen und dem A/D-Wandler ein Verstärker die Spannungsamplitude<br />
vergrößern. Bei einem Verstärkungsfaktor von 1000-fach können Signale mit µV Stufen<br />
aufgenommen werden, wenn <strong>der</strong> A/D-Wandlerbereich zwischen -10 V und +10 V<br />
liegt. Maximale Signale von neuronalen Zellen auf MEAs liegen bei etwa 100 µV.<br />
Denkbar wäre also eine 10.000-fache Verstärkung, bei <strong>der</strong> das Signal zwischen -1 V<br />
und +1 V liegen sollte. Dann wäre allerdings eine <strong>Aufnahme</strong> von Herzmuskelzellen<br />
nicht mehr möglich, die ein deutlich stärkeres Signal von einigen mV abgeben. Aus<br />
diesen Gründen wird eine 1000-fache Verstärkung in dieser Arbeit realisiert. Durch<br />
Wahl <strong>eines</strong> A/D-Wandlers mit kleinerem <strong>Aufnahme</strong>bereich kann die Auflösung weiter<br />
verbessert werden.<br />
Aufgrund <strong>der</strong> im Literatur- und Theorieteil besprochenen Bandbreiteverkleinerung<br />
durch schlechtes Signal- zu Rauschverhältnis bei zu starker Verstärkung müssen<br />
mehrere Verstärkerstufen in einer Kaskadenschaltung von jeweils 10-facher Verstärkung<br />
hintereinan<strong>der</strong>geschaltet werden (siehe Abbildung 3.2).<br />
Abb. 3.2: Schematische Darstellung <strong>eines</strong> Verstärkerkanals. Das Eingangssignal (IN)<br />
wird mittels <strong>eines</strong> Instrumentenverstärkers (InstAmp IC2) 10-fach verstärkt<br />
und dem ersten Operationsverstärker (OpAmp IC1A) zugeführt,<br />
<strong>der</strong> mittels Rückkopplung <strong>der</strong> beiden Wi<strong>der</strong>stände R1 und R2 das Signal<br />
wie<strong>der</strong>um 10-fach verstärkt. Der zweite Operationsverstärker (IC1B) führt<br />
das Signal durch die Rückkopplung (Wi<strong>der</strong>stände R3 und R4) mittels 10-<br />
facher Verstärkung zur 1000-fachen Endverstärkung am Ausgang (OUT).
3. Materialien und Methoden 29<br />
Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Recherche über die auf dem Markt erhältlichen<br />
Operationsverstärker durchgeführt. Die hier präsentierten und verwendeten<br />
Bausteine bieten die beste Übereinstimmung mit den im Theorieteil besprochenen<br />
Anfor<strong>der</strong>ungen in Relation zu Preis, Größe des Bausteins und einfacher praktischer<br />
Anwendbarkeit.<br />
Da beson<strong>der</strong>s die erste Stufe wegen des noch sehr kleinen Signals von wenigen µV<br />
sehr rauschempfindlich ist, wird hier ein hochwertiger Instrumentenverstärker vom<br />
Typ INA2141 (Texas Instruments) eingesetzt. Instrumentenverstärker sind eine spezielle<br />
Unterart von Operationsverstärkern, die auf Messsignalverstärkung optimiert<br />
sind. Ausgegeben wird die Spannungsdifferenz zwischen den beiden Eingängen, d.h.<br />
intern findet eine Gegenkopplung statt. Einer <strong>der</strong> beiden Eingänge wird jeweils mit<br />
einer MEA-Elektrode verbunden, <strong>der</strong> an<strong>der</strong>e Eingang mit einer für alle Kanäle gleichen<br />
Referenzelektrode, die in das Medium getaucht wird. Da je<strong>der</strong> Baustein zwei<br />
Verstärker enthält, werden 32 Bausteine für 64 Kanäle verwendet. Das Eigenrauschen<br />
des Bausteins liegt unter 0,6 µV Spitze-Spitze [INA]. Der Eingangswi<strong>der</strong>stand<br />
ist größer als 10 10 Ω. Die Anstiegsgeschwindigkeit ist 4 V/µs. Alle Kriterien des<br />
Theorieteils sind somit für diesen Baustein erfüllt.<br />
Die zweite und dritte Stufe <strong>der</strong> Kaskade aus 10-fach Verstärkern wird durch<br />
einen vierfach-Operationsverstärker vom Typ TLC074 (Texas Instruments) realisiert.<br />
Durch Rückkopplung mit einer Kombination aus 1 kΩ- und 10 kΩ-Wi<strong>der</strong>ständen<br />
ist <strong>der</strong> Verstärkungsfaktor auf 10-fach eingestellt (siehe Abbildung 3.2). Das Eingangsrauschen<br />
liegt unter 1 µV Spitze-Spitze [TLC]. Der Eingangswi<strong>der</strong>stand ist<br />
größer als 10 10 Ω. Die Anstiegsgeschwindigkeit ist 4 V/µs. Auch bei diesem Baustein<br />
sind alle Kriterien erfüllt.<br />
3.1.1.2 Filtereinheit<br />
Elektrische Leitungen fangen elektrische Fel<strong>der</strong> <strong>der</strong> Umgebung wie eine Antenne<br />
ein. Beson<strong>der</strong>s die sinusförmige 50 Hz Wechselspannung und hochfrequente Signale<br />
<strong>der</strong> Computer könnten ”<br />
empfangen” werden. Diese Beeinflussungen aus <strong>der</strong> Umwelt<br />
überlagern sich mit dem Originalsignal als unerwünschtes Rauschen. Eine nachträgliche<br />
Signalverarbeitung in Form <strong>eines</strong> Filters kann solche Störeinflüsse minimieren.<br />
Um die Beeinflussung des schwachen Signals so gering wie möglich zu halten,<br />
werden in den Verstärkerstufen keine zusätzlichen Bauteile zur Signalverarbeitung<br />
integriert. Erst eine dem Verstärker nachgeschaltete Stufe modifiziert das Originalsignal,<br />
indem unerwünschte Frequenzen herausgefiltert werden. Dieses Vorgehen hat<br />
den großen Vorteil, mit den Verstärkerstufen auch Gleichstromsignale aufnehmen zu<br />
können. In <strong>der</strong> Filterstufe befinden sich zwei aktive Filter, die einen Bandpass-Filter<br />
formen (siehe Abbildung 3.3). Ein Bandpass-Filter wird durch die Zusammenschaltung<br />
<strong>eines</strong> Tiefpass- und <strong>eines</strong> Hochpass-Filters vom Typ Buttworth zweiter Stufe<br />
realisiert [Tieze und Schenk, 1989].<br />
Ein Tiefpassfilter lässt tiefe Frequenzen passieren und schwächt hohe Frequenzen<br />
ab. Dies wird durch eine Kombination aus Wi<strong>der</strong>ständen und Kondensatoren<br />
realisiert. In Abbildung 3.3 ist auf <strong>der</strong> linken Seite ein Tiefpassfilter schematisch<br />
dargestellt. Das Signal durchläuft zwei Wi<strong>der</strong>stände (R1 und R2) bis zum Eingang
3. Materialien und Methoden 30<br />
Abb. 3.3: Schematische Darstellung <strong>eines</strong> Filterkanals. Das Eingangssignal (IN)<br />
durchläuft die Tiefpass-Filterstufe (IC1B) auf <strong>der</strong> linken Seite, gelangt zur<br />
Hochpass-Filterstufe (IC2B) auf <strong>der</strong> rechten Seite und wird am Ausgang<br />
(OUT) als gefiltertes Signal ausgegeben.<br />
<strong>eines</strong> Operationsverstärkers, <strong>der</strong> als Impedanzwandler arbeitet, d.h. die Verstärkung<br />
ist 1. Der hochfrequente Teil des Signals kann teilweise durch den Kondensator C2<br />
über Masse abfließen und wird dadurch nicht verstärkt. Der Teil des hochfrequenten<br />
Signals, <strong>der</strong> nicht über Masse abgeflossen ist, geht durch den Operationsverstärker<br />
und wird über den Kondensator C1 zwischen die beiden Wi<strong>der</strong>stände R1 und R2<br />
zurückgeführt. Dadurch kann ein weiterer Teil des Signals über den Kondensator<br />
C2 über Masse abfließen. Insgesamt wird dadurch <strong>der</strong> nie<strong>der</strong>frequente Teil des Signals<br />
unbeeinflusst durchgelassen und <strong>der</strong> hochfrequente Teil zu einem großen Teil<br />
gefiltert.<br />
Der Ausgang des Tiefpassfilters ist mit dem Eingang <strong>eines</strong> Hochpassfilters (rechte<br />
Seite in Abbildung 3.3) verbunden. Dieser besteht aus zwei Kondensatoren (C3<br />
und C4) in Folge, die nur den hochfrequenten Teil des Signals passieren lassen.<br />
Analog zum Tiefpassfilter werden hohe Frequenzen ungehin<strong>der</strong>t durchgelassen und<br />
tiefe Frequenzen durch den Wi<strong>der</strong>stand R4 über Masse abgezweigt.<br />
Durch geeignete Wahl <strong>der</strong> Kondensatoren und Wi<strong>der</strong>stände kann so ein Bandpassfilter<br />
realisiert werden. Die Parameter wurden mittels des Programms ”<br />
Filter Free”<br />
von Nuhertz Technologies so berechnet, dass Frequenzen von 500 Hz bis 10 kHz im<br />
Bandpass-Bereich liegen. In Abbildung 3.4 ist <strong>der</strong> berechnete Verlauf für die in <strong>der</strong><br />
schematischen Filterschaltung angegebenen Kondensatoren dargestellt.<br />
Als Impedanzwandler wurden MC33274 Operationsverstärker (Motorola) mit jeweils<br />
vier Kanälen verwendet. Die Frequenzbereiche <strong>der</strong> Filter werden über die beiden<br />
Kondensatoren (C1, C2 bzw. C3, C4) in <strong>der</strong> Schaltung definiert. Durch Trennung<br />
<strong>der</strong> Kondensatoren von <strong>der</strong> Filterplatine (Operationsverstärker und Wi<strong>der</strong>stände) in<br />
Form von Kondensator-Modulen, kann <strong>der</strong> Frequenzbereich nachträglich verän<strong>der</strong>t<br />
werden. In jedem Experiment kann <strong>der</strong> Frequenzbereich für jeweils 16 Kanäle durch<br />
Einstecken <strong>eines</strong> entsprechenden Filtermoduls beliebig gewählt werden.<br />
3.1.1.3 Analog-Digital-Wandlung<br />
Zur Datenaufnahme im Computer wird ein A/D-Wandler DAQ-2204 (Adlink) verwendet.<br />
Er nimmt Spannungen von 64 Kanälen mit 1,2 MHz Summen-Samplingrate
3. Materialien und Methoden 31<br />
Abb. 3.4: Berechneter Verlauf <strong>eines</strong> Butterworth-Tiefpass-Filters zweiter Stufe mit<br />
einer Grenzfrequenz von 10 kHz und <strong>eines</strong> nachgeschalteten Butterworth-<br />
Hochpass-Filters zweiter Stufe mit einer Grenzfrequenz von 100 Hz. Die<br />
Berechnungen wurden mit ”<br />
Filter Free” von Nuhertz Technologies durchgeführt.<br />
in wählbaren Bereichen von -0,1 . . . +0,1 V bis -10 . . . +10 V auf. Damit ergibt<br />
sich eine Samplefrequenz von 18 kHz pro <strong>Kanal</strong>. Bei einem eingestellten Spannungsbereich<br />
von -0,1 . . . +0,1 V nimmt die Karte bei einer Auflösung von 12-bit Spannungsdifferenzen<br />
von 5 µV auf. Dadurch ist das verstärkte Zellsignal mit einer hohen<br />
Auflösung detektierbar. Die Karte kann über eine dynamic link library-Systemdatei<br />
(DLL) aus je<strong>der</strong> Programmiersprache gesteuert werden.<br />
Ein 68-poliges Very High Density Cable Interconnect-Kabel (VHDCI) verbindet<br />
die Messkarte mit <strong>der</strong> Filtereinheit o<strong>der</strong> dem Verstärker. Die Karte wird im sogenannten<br />
double-buffer-mode (Zwischenspeicher) betrieben, wodurch die Datentransferraten<br />
von 2,4 MB/s für alle 64 Kanäle problemlos vom Computer verarbeitet<br />
werden können. Das schematisches Datenflussdiagramm ist wie folgt:<br />
Elektrode → Analog-Digital-Wandler → Zwischenspeicher → Applikation<br />
3.1.2 Stimulationselektronik<br />
Es gibt verschiedene Wege die Zellen zu stimulieren:<br />
• Chemisch durch Neuropharmaka<br />
• Elektrisch durch patch clamp Technik<br />
• Elektrisch durch eine externe Mikroelektrode<br />
• Elektrisch durch die MEA-Elektroden<br />
Da elektrische Stimulation wegen ihrer Einfachheit beson<strong>der</strong>s attraktiv ist, bietet<br />
es sich an, eine Stimulationselektronik für <strong>60</strong> Kanäle zu entwerfen. Ein Aktionspotential<br />
kann durch einen künstlichen Spannungspuls ausgelöst werden. Die Stimulationseinheit<br />
sollte in <strong>der</strong> Lage sein, eine o<strong>der</strong> mehrere Elektroden beliebig auswählen
3. Materialien und Methoden 32<br />
zu können und ein Stimulationsmuster in Form einer Spannungsfolge auf den ausgewählten<br />
Elektroden ausgeben zu können.<br />
Die Erzeugung des Stimulationssignals geschieht durch eine Digital-Analog-Wandlerkarte<br />
(D/A-Wandler) vom Typ PD2-AO-32/16 (United Electronic Industries). Sie<br />
besitzt 32 Kanäle, die in 16-bit Auflösung Stimulationsmuster mit einer Datenrate<br />
von 100.000 Wertän<strong>der</strong>ungen pro Sekunde (Samples/sec) beliebige Signalformen<br />
ausgeben kann. Um auf allen <strong>60</strong> Kanälen stimulieren zu können, werden zwei Karten<br />
des gleichen Typs eingesetzt. Die Steuerung <strong>der</strong> Karte übernimmt eine in Visual<br />
Studio (Microsoft) programmierte Software.<br />
Zur Auswahl <strong>der</strong> zu stimulierenden Elektroden des MEAs werden Entkopplungsschalter<br />
ADG715 (Analog Devices) eingesetzt. Bei <strong>der</strong> Stimulation ergibt sich das<br />
prinzipielle Problem, dass die Stimulation über die gleichen Elektroden auf dem<br />
MEA erfolgt, wie die <strong>Aufnahme</strong>. Man muss also die Leitungen <strong>der</strong> Stimulation von<br />
den Leitungen <strong>der</strong> <strong>Aufnahme</strong> abkoppeln, solange nicht stimuliert wird. Ansonsten<br />
würden sich die verlängerten Signalwege und Eigenschaften <strong>der</strong> Stimulationselektronik<br />
durch ein viel größeres Rauschen in <strong>der</strong> <strong>Aufnahme</strong>leitung negativ auswirken.<br />
Ideal wäre eine galvanische Trennung <strong>der</strong> beiden Kanäle. In dieser Arbeit werden<br />
elektronische Schalter sehr nahe den Elektrodenkontakten platziert, die über den<br />
PC ein- und ausgeschaltet werden können (siehe Abbildung 3.1 unterer Teil). Diese<br />
Bausteine werden mit Modulplatinen auf <strong>der</strong> ersten Stufe des Verstärkers aufgesetzt.<br />
Die Schalter werden per seriellem I 2 C-Bus 1 gesteuert.<br />
Der Baustein wird über zwei Kontrollleitungen programmiert. Eine <strong>der</strong> beiden Leitungen<br />
ist eine Taktleitung (SCL), die an<strong>der</strong>e eine Datenleitung (SDA). Übertragen<br />
wird immer ein Byte, also 8 Bits in serieller Folge. Eine Programmierfolge besteht<br />
aus mehreren aufeinan<strong>der</strong>folgenden Bytes. Die Datenübermittlung wird durch eine<br />
Start-Sequenz begonnen und durch eine Stop-Sequenz beendet. Die genaue Spezifikation<br />
ist in Abbildung 3.5 dargestellt.<br />
Abb. 3.5: Programmierung des ADG715 über den seriellen I 2 C-Bus. Nach <strong>der</strong> Start-<br />
Bedingung wird eine für einen Schalterbaustein spezifische Identifikationsadresse<br />
übertragen, <strong>der</strong> ein Datenbyte folgt. Je<strong>der</strong> Baustein beinhaltet 8<br />
Schalter. Jedes Bit des Datenbytes repräsentiert einen Schalter. Sobald die<br />
Stop-Bedingung nach dem Datenbyte übertragen ist, schaltet <strong>der</strong> Baustein<br />
die soeben übertragene Schalterkonfiguration.<br />
1 http://www.semiconductors.philips.com/buses/i2c/
3. Materialien und Methoden 33<br />
3.1.3 Charakterisierung <strong>der</strong> Elektronik<br />
3.1.3.1 Transferfunktionen<br />
Die Frequenzabhängigkeit <strong>der</strong> Verstärker wird durch die Transferfunktion beschrieben.<br />
Gemessen wird <strong>der</strong> Verstärkungsfaktor in Abhängigkeit von <strong>der</strong> Frequenz. Ein<br />
Netzwerkanalysator vom Typ R3753AH (Advantest) wird durch ein Programm 2 unter<br />
<strong>der</strong> Programmierumgebung VEE Pro 6.0 (Agilent) ferngesteuert. Frequenzen von<br />
5 Hz bis 2 MHz werden mit einem Sinussignal durchgefahren und <strong>der</strong> Verstärkungsfaktor<br />
durch einen Vergleich von eingespeister Leistung zu ausgegebener Leistung<br />
bestimmt. Eine schematische Darstellung ist in Abbildung 3.6 zu sehen. Hierzu sind<br />
<strong>der</strong> Ausgangskanal 1 des Netzwerkanalysators mit dem Elektronik-Eingang und <strong>der</strong><br />
Ausgangskanal 2 des Analysators mit seinem Referenzeingang verbunden. Der Eingangskanal<br />
des Netzwerkanalysators ist mit dem Ausgang <strong>der</strong> Elektronik gekoppelt.<br />
Der Netzwerkanalysator vergleicht die ausgegebene Leistung (Referenzeingang) mit<br />
<strong>der</strong> durch die Elektronik verstärkten Leistung.<br />
Netzwerkanalysator<br />
Ausgang<br />
1 2<br />
Eingang<br />
Ref<br />
Eingang Ausgang<br />
Elektronik<br />
Abb. 3.6: Schematischer <strong>Aufbau</strong> zur Messung <strong>der</strong> Transferfunktion einer Elektronik<br />
mit einem Netzwerkanalysator. Erklärung im Text.<br />
3.1.3.2 Rauschen und Zeitcharakteristiken<br />
Die obere Rauschgrenze wird mit einem Oszilloskop vom Typ LT264M (LeCroy)<br />
bestimmt. Durch Abmessung <strong>der</strong> Peak- zu Peakspannung V pkpk des Verstärkerausgangs<br />
und Einbeziehung des Verstärkungsfaktors VF aus <strong>der</strong> Transferfunktion kann<br />
eine obere Grenze des Rauschens bestimmt werden.<br />
V Rauschen ≤ V pkpk<br />
(3.1)<br />
VF<br />
Weitere wichtige Eigenschaften sind die Zeitcharakteristiken <strong>der</strong> Elektronik. Fragestellungen,<br />
wie schnell Schalter programmiert werden können und wann die <strong>Aufnahme</strong>elektronik<br />
nach einem Stimulationspuls wie<strong>der</strong> störungsfrei funktioniert, werden<br />
mit dem Oszilloskop dokumentiert.<br />
2 Das Programm wurde von Herrn Dr. Hartmut Stadler programmiert und zur Verfügung gestellt.
3. Materialien und Methoden 34<br />
3.1.4 Peripherie<br />
In diesem Abschnitt wird die Peripherie des Messaufbaus beschrieben. Eine schematische<br />
Darstellung <strong>der</strong> verwendeten Komponenten ist in Abbildung 3.7 gezeigt.<br />
Hierzu gehören:<br />
1. Gehäuse <strong>der</strong> Elektronik als Schutz vor mechanischen Einflüssen und als elektrische<br />
Abschirmung (siehe Abbildung 3.7 Bereich 2)<br />
2. Elektromechanische Kopplung des MEAs mit <strong>der</strong> Elektronik (nicht in <strong>der</strong> Abbildung<br />
dargestellt)<br />
3. Materialien und Geräte zur Umweltkontrolle<br />
• Automatisierte Mediumversorgung (siehe Abbildung 3.7 Bereich 1 + 2)<br />
• Heizung (siehe Abbildung 3.7 Bereich 3)<br />
3.1.4.1 Gehäuse<br />
Das Gehäuse muss mehrere Funktionen erfüllen (siehe Abbildung 3.7 Bereich 2):<br />
• Einfacher MEA-Wechsel: Um Routineuntersuchungen an MEAs durchzuführen,<br />
muss ein schneller und einfacher Austausch <strong>der</strong> Proben möglich sein.<br />
Gleichzeitig muss eine gute elektrische Kontaktierung gewährleistet sein.<br />
• Elektrische Abschirmung: Die Experimente sollten gut vor elektromagnetischer<br />
Strahlung geschützt sein.<br />
• Temperaturregelung: Das MEA muss auf physiologischen Temperaturen gehalten<br />
werden.<br />
• Nährstoff- und Pharmakaversorgung: Das Gehäuse sollte die Möglichkeit einer<br />
Zufuhr von Flüssigkeiten in das MEA bieten.<br />
• Mechanischer Schutz: Die Messungen sollten durch leichte Stöße und Vibrationen<br />
nicht gestört werden.<br />
3.1.4.2 Mechanoelektrische Kopplung<br />
Die Goldkontaktstellen <strong>der</strong> MEAs müssen mit <strong>der</strong> Elektronik verbunden werden.<br />
Denkbar sind Metallzungen, die auf die Elektroden pressen [MCS]. Diese Verbindung<br />
kann jedoch unzuverlässig sein, da die Auflagefläche <strong>der</strong> Abgreifstifte sehr<br />
gering ist. Kleine Partikel und Staubkörner können die Verbindung erheblich stören.<br />
Einen alternativen Ansatz bieten anisotrope Leitgummis (elastomeric connectors).<br />
Es handelt sind um Silikonstreifen, die schichtweise aus unbehandeltem und mit
3. Materialien und Methoden 35<br />
Bereich 1: automatisierte Versorgung<br />
Medium Pumpe Ventil<br />
Bereich 2: Flusskammer<br />
Gehäuse<br />
Flusskammer<br />
Zellen<br />
MEA<br />
37,0 o<br />
C<br />
Abfall<br />
Bereich 3: Heizung<br />
Abb. 3.7: Schematische Darstellung <strong>der</strong> Peripherie (Erklärung im Text)
3. Materialien und Methoden 36<br />
Abb. 3.8: Ein Leitgummi besteht aus abwechselnd leitenden (schwarze Bereiche) und<br />
nicht-leitenden Bereichen (weisse Bereiche).<br />
Graphit o<strong>der</strong> Goldkügelchen behandeltem Material hergestellt werden (siehe Abbildung<br />
3.8). Dadurch entsteht ein Wechsel von leitenden und nichtleitenden Silikonschichten.<br />
Werden diese Gummis auf die Kontaktstellen gepresst, ergibt sich eine<br />
wesentlich größere Kontaktfläche.<br />
Verwendet werden ”<br />
s-type” Leitgummis (Shin Etsu Polymers) 3 . Die Abmessungen<br />
wurden auf die Elektrodenflächen des MEAs abgestimmt. Als pitch, d.h. als Abstand<br />
zwischen leitendem und nicht-leitendem Material, standen 0,05 mm und 0,25 mm<br />
zur Verfügung.<br />
3.1.4.3 Heizung<br />
Neuronen aus Säugetieren benötigen Körpertemperatur zum Überleben. Während<br />
<strong>der</strong> Kultivierung liegen die Zellen in einem CO 2 -Brutschrank (Biosafe eco, Integra<br />
Biosciences), in dem die Temperatur konstant auf 37,0 ◦ C und <strong>der</strong> CO 2 -Gehalt zur<br />
pH-Pufferung auf 5% gehalten wird. Während <strong>der</strong> Experimente befinden sich die<br />
Kulturen außerhalb des Brutschranks im Verstärkergehäuse. Während dieser Zeit<br />
könnten die Kulturen zu kalt werden und die Zellen absterben. Deswegen werden sie<br />
während <strong>der</strong> gesamten Messzeit mit einer Heizung auf Körpertemperatur gehalten<br />
(siehe Abbildung 3.7 Bereich 3). Zur Stabilisierung des pH-Wertes im Kulturmedium<br />
muss ein CO 2 -unabhängiges Puffersystem zum Einsatz kommen.<br />
Ein Regelkreis hält die Temperatur konstant [Blau, 1999]. Die schematische Schaltung<br />
ist in Abbildung 3.9 dargestellt. Ein Leistungs-Operationsverstärker gibt Spannungen<br />
abhängig von <strong>der</strong> Differenz <strong>der</strong> Spannung zwischen Soll- und Ist-Eingang aus.<br />
Dadurch wird die Heizung bei zu niedriger Temperatur mit einem Strom solange<br />
durchflossen, bis die Temperatur den Soll-Wert erreicht hat.<br />
3.1.4.4 Flusskammer<br />
Um die neuronalen Zellen mit Nährstoffen und Neuropharmaka zu versorgen, muss<br />
Nährmedium zugeführt werden. Prinzipiell können die Zellen mit einer Eppendorf-<br />
Pippette alle zwei Tage manuell gefüttert werden. Um diesen sehr zeitaufwendigen<br />
Prozess zu vereinfachen, bietet es sich an, Zellen in einer Flusskammer zu kultivieren,<br />
3 Die Leitgummis wurden freundlicherweise als Proben von <strong>der</strong> Firma MH&W und <strong>der</strong> Firma Shin<br />
Etsu Polymers bereitgestellt.
3. Materialien und Methoden 37<br />
Abb. 3.9: Schematische Schaltung <strong>der</strong> Heizungssteuerung. Die beiden Potentiometer<br />
arbeiten als Spannungsteiler. Daher sind keine Angaben über Wi<strong>der</strong>stände<br />
nötig. In dieser Arbeit wurden Potentiometer von 0 bis 100 Ω verwendet.<br />
durch die automatisiert Medium ausgetauscht werden kann (siehe Abbildung 3.7<br />
Bereich 1 und 2).<br />
3.1.5 Software<br />
Für die Datenaufnahme und -analyse wird eine Software benötigt. Als Programmierumgebung<br />
wurde Visual Studio (Microsoft) verwendet. Die Software muss folgende<br />
Eigenschaften erfüllen:<br />
• <strong>Aufnahme</strong><br />
– Datenaufnahme mit <strong>der</strong> maximalen Datenrate <strong>der</strong> AD-Karte<br />
– Abspeicherung <strong>der</strong> Daten auf Festplatte<br />
– Darstellung einer Übersicht <strong>der</strong> aktuell aufgenommenen Daten<br />
• Stimulation<br />
– Ausgabe von Stimulationsmustern auf bis zu 64 Kanälen<br />
– Der Start <strong>der</strong> Stimulation sollte durch die <strong>Aufnahme</strong>software auslösbar<br />
sein<br />
3.2 Zellkulturen<br />
3.2.1 Chemikalien und Medien<br />
3.2.1.1 Medien<br />
Zur Zellkultivierung wurden MEM-Medium (SIGMA), Neurobasal (Gibco 10888-<br />
022) und Dulbecco’s MEM (Gibco 10567-014) eingesetzt. Es handelt sich um vorgefertigte<br />
Nährstoffmischungen, die aus Aminosäuren, Salzen, Vitaminen, sonstigen
3. Materialien und Methoden 38<br />
Substanzen und einer anorganischen Puffersubstanz (NaHCO 3 ) bestehen. Als Serum<br />
wurden Pferdeserum (Gibco 1<strong>60</strong>50-122), fötales Kälberserum (Gibco 10270-098,<br />
LOT 40Q3614K) und die Serum-Ersatz- und Ergänzungsmedien B27 (Gibco 17504-<br />
044) und F12 (Sigma) verwendet. Der physiologische pH-Wert von 7,4 wurde durch<br />
Zugabe von NaOH nach <strong>der</strong> Mischung von Medium, Serum und sonstigen Zusätzen<br />
mit einer pH-Sonde vom Typ 252 (Testo) für den Einsatz im Inkubator eingestellt.<br />
Ein Wirkungsvergleich <strong>der</strong> verschiedenen Medien wurde mit 24-fachen Multischalen<br />
(24-Well, Falcon) durchgeführt, in <strong>der</strong>en Schalen unterschiedliche Medien verteilt<br />
wurden. Nach einigen Tagen in Kultur wurden mit dem Mikroskop <strong>Aufnahme</strong>n <strong>der</strong><br />
Zell-Netzwerkstrukturen gemacht.<br />
Durch Einsatz einer HEPES-Pufferlösung 4 kann ein physiologischer pH-Wert auch<br />
außerhalb des Inkubators stabilisiert werden. Hierzu wird dem Medium HEPES in<br />
einer Konzentration von 10 mM zugegeben und mittels einer pH-Sonde <strong>der</strong> physiologische<br />
Wert 7,4 durch Zugabe von NaOH eingestellt.<br />
3.2.1.2 Antibiotika<br />
Durch Zugabe einer Penicillin- / Streptomycin-Mischung können die Kulturen auch<br />
unter unsterilen Bedingungen gehalten werden. Dazu werden 100 µg/ml Streptomycin<br />
und 100 U/ml Penicillin gemischt und im Medium gelöst. Penicillin bleibt 3 Tage<br />
in wässriger Lösung aktiv. Zu beachten ist jedoch, dass diese Mischung nur gegen<br />
Bakterien, nicht jedoch gegen Pilzsporen aktiv ist [Lindl, 2000].<br />
3.2.2 Präparation<br />
3.2.2.1 Dissoziierte Neuronen<br />
Zur Präparation <strong>der</strong> neuronalen Zellen werden 9 bis 11 Tage alte Embryos (E9<br />
- E11) aus Hühner-Eiern verwendet 5 . Das steril entnommene Embryogehirn wird<br />
vorsichtig zerteilt und für 10 Minuten in einer Trypsin-Lösung (0,25 % Trypsin (Sigma),<br />
0,1 % EDTA (Fluka) auf 20ml Medium (Neurobasal, D-MEM o<strong>der</strong> MEM))<br />
im Brutschrank bei 37˚C Temperatur und 5 % CO 2 -Gehalt in einem Zentrifugenröhrchen<br />
inkubiert. Die in <strong>der</strong> Zellsuspension befindlichen Neuronen werden von <strong>der</strong><br />
Trypsin-Lösung durch 5-minütiges Zentrifugieren auf Stufe 5 getrennt. Das Gewebe<br />
wird mit einer langen Pipettenspitze abgesaugt und in ein frisches Röhrchen mit<br />
Medium überführt. Der Zellhaufen wird in einzelne Neurone mit einer feuerpolierten<br />
Pasteurpipette durch Einsaugen und Herausdrücken mechanisch separiert. Die<br />
Zelldichte wird durch Auszählen in einer Neubauer Zählkammer und Zugabe von<br />
Medium auf einen gewünschten Wert gebracht (meist etwa 10 5 Zellen/ml). Die Zellsuspension<br />
wird auf Kulturschalen und MEAs mit einer Eppendorfpipette zu je 50 µl<br />
verteilt und mit 2 ml Medium aufgefüllt. Nach 4 – 5 Tagen werden durch Absaugen<br />
von 1 ml Medium und Hinzugeben von 1 ml frischem Medium die Zellen mit neuem<br />
Medium versorgt.<br />
4 HEPES: N-2-Hydroxyethylpiperazin-N’-2-Ethansulfonsäure<br />
5 Z.B. E9: Es handelt sich um Embryos, die nach Befruchtung 9 Tage bebrütet worden sind. E11<br />
= 11 Tage.
3. Materialien und Methoden 39<br />
3.2.2.2 Herzmuskelzellen<br />
Zur Präparation <strong>der</strong> Herzmuskelzellen werden E7-Embryos aus Hühner-Eiern verwendet.<br />
Das schlagende Herz wird mit einem Binokular-Mikroskop gesucht und mit<br />
einer Pinzette und einem Skalpell vom restlichen Körper getrennt. Übrig gebliebenes<br />
Blut und Fremdkörper werden mit einer Phosphat-gepufferten Saline-Lösung (PBS)<br />
abgespült. Das in mehrere Segmente geteilte Herz wird mit einer Trypsin-Lösung<br />
(0,25 % Trypsin (Sigma), 0,1 % EDTA (Fluka) auf 20ml MEM-Medium) im Brutschrank<br />
bei 37˚C Temperatur und 5 % CO 2 Gehalt in einem Zentrifugenröhrchen<br />
für 15 Minuten inkubiert und anschließend für 5 Minuten bei Stufe 5 zentrifugiert.<br />
Der Zellhaufen wird aufgesaugt und in frisches Medium gegeben. Die Dichte <strong>der</strong><br />
Herzmuskelzellen wird durch Auszählen in <strong>der</strong> Neubauer Zählkammer und Zugeben<br />
von Medium auf einen gewünschten Wert von etwa 5×10 5 Zellen/ml gebracht. Die<br />
Zellsuspension wird in 50 µl Portionen auf Kulturschalen ausplattiert und mit 2 ml<br />
Medium aufgefüllt. Täglich werden durch Austausch von 1 ml Medium mit frischem<br />
Medium die Herzmuskelzellen mit neuen Nährstoffen versorgt.<br />
3.3 Sonstiges<br />
3.3.1 Herstellung <strong>der</strong> Platinen<br />
Für die Herstellung <strong>der</strong> Platinen werden handelsübliche 1,5 mm Epoxy-Kupfer-<br />
Platinen (Conrad) mit einer Photolackschicht verwendet. Nach 5-minütiger Belichtung<br />
mit einem Dia-Betrachtungsgerät werden die Platinen in einem Fotoentwickler<br />
(Conrad) entwickelt. Nachdem sich die belichteten Bereiche komplett abgelöst haben,<br />
wird die Platine in ein Ätzbad (Conrad) gelegt. Zur Vergütung <strong>der</strong> Leiterbahnen<br />
wird die Platine in ein Zinnbad gelegt und anschließend mit Lötlack besprüht.<br />
Die Platinen wurden teilweise von Herrn Schlägel in <strong>der</strong> Elektronikwerkstatt <strong>der</strong><br />
Universität Kaiserslautern hergestellt.<br />
Die Bestückung <strong>der</strong> SMD-Platinen (Filtereinheit, Stimulationseinheit) erfolgte<br />
mit Lötpaste (Conrad) und einem Lötkolben (Weller). Die Verstärkerplatinen wurden<br />
von Herrn Stücki in <strong>der</strong> Elektronikwerkstatt <strong>der</strong> Universität Kaiserslautern mit<br />
einem halbautomatischen SMD-Heißluft-Bestückungsgerät gelötet. Zur Entfernung<br />
von Flussmitteln legte Herr Stücki die Platinen in ein Ultraschallbad.<br />
Durchkontaktierungen und Dual-Inline-Package (DIP)-Bausteine wurden mit einem<br />
Lötkolben (Weller) und Lötzinn (Staniol) durchgeführt bzw. aufgelötet.
Teil III<br />
Experimentelle Durchführung
4 Durchführung, Experimente und<br />
Ergebnisse<br />
4.1 Messaufbau<br />
4.1.1 <strong>Aufnahme</strong>- und Stimulationselektronik<br />
Das zweiseitige Platinenlayout <strong>der</strong> <strong>Aufnahme</strong>elektronik wurde mit <strong>der</strong> Software Eagle<br />
4 (CadSoft) entworfen. Die Layouts zur Fotoreproduktion sind im Anhang abgebildet.<br />
Die Bausteine sind per surface mount device-Technik (SMD) verlötet worden.<br />
Die erste Verstärkerstufe besteht aus einer einzelnen quadratischen Platine für alle<br />
64 Kanäle (Abbildung 4.1A). Die quadratische Aussparung in <strong>der</strong> Mitte, unter <strong>der</strong><br />
sich das MEA befindet, ermöglicht ein gleichzeitiges Mikroskopieren während <strong>der</strong><br />
Messungen. Auf je<strong>der</strong> Seite befinden sich acht INA2141 Bausteine. Die Stufen 2 und<br />
3 sind auf einer einzelnen Platine zu jeweils 16 MEA-Kanälen mit Bausteinen vom<br />
Typ TLC074 zusammengefasst, die auf den Ausgang <strong>der</strong> ersten Stufe gesteckt wird<br />
(Abbildung 4.1B). Die komplette Verstäkereinheit ist in Abbildung 4.1C dargestellt.<br />
A) Stufe 1 (10x) B) Stufe 2 & 3 (100x)<br />
C) Verstärker<br />
4x<br />
Abb. 4.1: Fotos <strong>der</strong> Verstärkereinheiten. A) Erste Verstärkerstufe. B) Ein Modul<br />
<strong>der</strong> zweiten und dritten Verstärkungsstufe. C) Zusammengebaute Verstärkerplatine.
4. Durchführung, Experimente und Ergebnisse 42<br />
Die Ausgänge <strong>der</strong> dritten Stufe sind über ein Flachbandkabel (Conrad) mit einem<br />
68-poligen SCSI-3 Stecker (79059, Molex) verbunden, <strong>der</strong> am Gehäuse des Verstärkers<br />
befestigt ist. Die verbleibenden 4 A<strong>der</strong>n des 68-poligen Kabels werden für<br />
Spannungsversorgung und Masse genutzt.<br />
Die Entkopplungsschalter <strong>der</strong> Stimulationseinheit sind auf einer separaten Platine<br />
mit ebenfalls 16 Kanälen pro Platine zusammengefasst (Abbildung 4.2). Je<strong>der</strong><br />
ADG715-Baustein ist ein Thin Shrink Small Outline Package-SMD-Chip (TSSOP).<br />
Dies ist eine extrem kleine Bauform und ermöglicht eine sehr nahe Platzierung an<br />
den Elektrodenkontakten. Da eine halbautomatische Bestückung <strong>der</strong> Platinen mit<br />
TSSOP-Bausteinen aufgrund sehr kleiner Kontaktabstände nicht möglich ist, wurde<br />
mit einer dünnen Spritze auf jedes SMD-Beinchen ein Tropfen SMD-Lötpaste (Conrad)<br />
gegeben. Dann wurde <strong>der</strong> Baustein mit einer Pinzette (Conrad) auf <strong>der</strong> Platine<br />
platziert und festgehalten. Mit einem Lötkolben (Weller) konnten dann die Beine<br />
auf <strong>der</strong> Platine festgelötet werden. In Abbildung 4.2 ist ein 16-<strong>Kanal</strong>-Modul einzeln<br />
(rechts) und auf die Verstärkerstufe gesteckt (links) abgebildet.<br />
Abb. 4.2: Links: Ein Stimulationsmodul ist auf die Basisplatine gesteckt. Rechts:<br />
Foto <strong>der</strong> 16-<strong>Kanal</strong> Entkopplungsschalterplatine. In <strong>der</strong> Mitte befinden sich<br />
die beiden 8-<strong>Kanal</strong>-Schalterbausteine vom Typ AFDG715. Die beiden 16-<br />
poligen Buchsenleisten sind die Ein- und Ausgänge. Die beiden 2-poligen<br />
Buchsenleisten dienen <strong>der</strong> Spannungsversorgung und als Steuerleitungen.<br />
Die resultierende ”<br />
Sandwich-Platine”, bestehend aus den drei Verstärkerstufen<br />
und <strong>der</strong> Stimulationselektronik, wird in das Gehäuse geschraubt (Abb. 4.3).<br />
Abb. 4.3: Die <strong>Aufnahme</strong>- und Stimulationselektronik sind in einem Metallgehäuse<br />
zusammengefasst.
4. Durchführung, Experimente und Ergebnisse 43<br />
4.1.2 Filtereinheit<br />
Die Filtereinheit besteht aus einer zweiseitigen SMD-Basisplatine, die Impedanzwandler<br />
und Wi<strong>der</strong>stände enthält, und drei aufzusteckenden Filtermodulen, auf die<br />
die frequenzbestimmenden SMD-Kondensatoren aufgelötet werden (siehe Abbildung<br />
4.4). Falls nicht an<strong>der</strong>s angegeben, sind Filtermodule für Frequenzbereiche von 100<br />
Hz bis 10 kHz eingebaut.<br />
Abb. 4.4: 16 <strong>Kanal</strong> Filtermodul. Die Buchsenleiste links oben ist <strong>der</strong> Signaleingang.<br />
Es folgen oben zwei Steckmodule, die für die Eigenschaften des Tiefpass-<br />
Filters zuständig sind. Unten befindet sich das Steckmodul für die Eigenschaften<br />
des Hochpass-Filters. Der Ausgang ist die oben rechts schräg<br />
stehende Buchsenleiste.<br />
Die Filterstufe ist in einem separaten 19“ Modul eingebaut und wird über 68-<br />
polige SCSI-3 Steckkontakte (Molex) mit <strong>der</strong> Verstärkereinheit und <strong>der</strong> Analog-<br />
Digital-Wandlerkarte verbunden. Die Pinbelegung entspricht dem Multichannelsystems<br />
Standard. Dadurch kann die Filterstufe auch mit einem Multichannelsystems-<br />
Gerät eingesetzt werden.<br />
Abb. 4.5: Die 64 Filterkanäle befinden sich in einem 19” Einschubgehäuse. Der Einund<br />
Ausgang wird durch ein SCSI-Kabel verbunden.
4. Durchführung, Experimente und Ergebnisse 44<br />
4.1.2.1 Gehäuse<br />
Um einen einfachen Wechsel <strong>der</strong> MEAs zu ermöglichen besteht das Gehäuse aus<br />
zwei Teilen: einer Basisplatte und einem Elektronikgehäuse. Als Basisplatte dient<br />
eine Aluminiumplatte (80 × 80 mm 2 ) von 4 mm Dicke, in die eine quadratische Vertiefung<br />
mit den Maßen 50 × 50 mm 2 mit einer Tiefe von 3 mm eingefräst ist. In diese<br />
Vertiefung ist eine Heizspirale auf einer 0,5 mm dicken Elektronik-Platine (Epoxyd-<br />
Harz) in ein Wärmeleitpad (Conrad Elektronik, Gap Pad, 189203-62) eingebettet.<br />
Im Zentrum <strong>der</strong> Heizspirale befindet sich ein Temperatursensor LM45 (Conrad Elektronik,<br />
SMD LM45 SOT23, 144827-62). Die Maße <strong>eines</strong> MEAs sind (49 × 49 × 1<br />
mm 3 ), <strong>der</strong> genau in die verbleibende Vertiefung passt. Eine schematische Darstellung<br />
ist in Abbildung 4.6 auf <strong>der</strong> linken Seite zu sehen. Diese Aluminiumplatte ist in<br />
einer PVC-Platte eingelassen, die die Abmessungen des Elektronikgehäuses besitzt.<br />
Abb. 4.6: Links: Die Alu-Basisplatte, in die das MEA eingelegt wird, enthält auch<br />
die Heizung und den Temperatursensor. Rechts: Die schwarzen Leitgummis<br />
sind quadratisch angeordnet und werden auf das MEA gelegt, so dass<br />
sie genau auf den Elektrodenflächen liegen.<br />
Das Elektronikgehäuse besteht aus 2 mm VA-Stahl. Es wurde in <strong>der</strong> Metallwerkstatt<br />
<strong>der</strong> Universität Kaiserslautern durch Biege- und Stanztechniken gefertigt (Abbildung<br />
4.3). Das Gehäuse stellt einen Faradayschen Käfig dar, <strong>der</strong> vor elektromagnetischer<br />
Strahlung schützt. In <strong>der</strong> Ober- und Unterseite befindet sich jeweils ein<br />
rechteckiges Loch von 50×50 mm 2 , durch die das MEA kontaktiert werden kann. Die<br />
Kontaktierung erfolgt durch Leitgummis, die auf den Elektrodenflächen des MEAs<br />
liegen (siehe Abbildung 4.6 rechte Seite).<br />
4.1.3 Charakterisierung <strong>der</strong> Elektronik<br />
4.1.3.1 Verstärkungsfaktor<br />
Je<strong>der</strong> einzelne <strong>Kanal</strong> des Verstärkers wurde auf <strong>der</strong> Eingangsseite mit einem Frequenzgenerator<br />
(Philips) verbunden und dessen verstärktes Signal auf <strong>der</strong> Ausgangsseite<br />
mit einem Oszilloskop (LeCroy) verglichen. Als Referenzfunktion diente ein<br />
Sinus-Signal mit 1 kHz Frequenz. Sowohl Eingangs- als auch Ausgangssignal wurden<br />
per nichtlinearem Kurvenfit mit Origin (OriginLabs) mit einer Sinus-Funktion
4. Durchführung, Experimente und Ergebnisse 45<br />
angefittet (siehe Abbildung 4.7). Der Verstärkungsfaktor errechnet sich durch Quotientenbildung<br />
<strong>der</strong> Amplitudenparameter des Fits von Ein- und Ausgangssignal.<br />
Abb. 4.7: Beispiel <strong>eines</strong> nichtlinearen Sinus-Kurvenfits des Ein- und Ausgangssignals<br />
<strong>eines</strong> Verstärkerkanals. Der Fit wurde mit Origin 7.0 Professional <strong>der</strong> Firma<br />
OriginLab durchgeführt.<br />
Im Mittel ergab sich eine Verstärkung vom Faktor 1038 ± 44. Die 64 Kanäle sind<br />
in Abbildung 4.8 graphisch zusammengefasst. Die Schwankung von ca. 4% kann<br />
durch die Ungenauigkeiten in den Wi<strong>der</strong>ständen und Kondensatoren <strong>der</strong> Elektronik<br />
erklärt werden. Um eine ideale vergleichbare Verstärkung auf allen Kanälen erreichen<br />
zu können wird eine Normierung auf Softwareebene durchgeführt. Hierzu wird eine<br />
Metallplatte statt <strong>eines</strong> MEAs in den Verstärker gelegt und ein <strong>Kanal</strong> wird als<br />
Referenzkanal (= 100% Verstärkung) gesetzt. Die restlichen Kanäle werden auf den<br />
Verstärkungsfaktor des Referenzkanals skaliert.<br />
Die Transferfunktionen <strong>der</strong> einzelnen Kanäle wurden mit dem Netzwerkanalysator<br />
aufgenommen. Die Bandbreite wurde von 5 Hz bis 2 MHz eingestellt und in 1201<br />
Schritten linear durchgefahren. Da alle Kanäle annähernd gleiches Verhalten zeigten,<br />
sind alle 64 Transferfunktionen in Abbildung 4.9 zusammengefasst. Man erkennt<br />
gut den linearen Bereich in den Durchlassfrequenzen von 300 Hz bis 10 kHz und<br />
den starken Abfall außerhalb dieser Frequenzen. Der Filter zeigt den berechneten<br />
Frequenzverlauf nach Abbildung 3.4.<br />
Für die 50 Hz Netzfrequenz ergibt sich ein Wert von etwa -40 dB. Dies ist eine<br />
Abschwächung des Signals um den Faktor 100. Auf <strong>der</strong> hochfrequenten Seite ist
4. Durchführung, Experimente und Ergebnisse 46<br />
Abb. 4.8: Verstärkungsfaktoren <strong>der</strong> 64 Kanäle des Verstärkers.<br />
eine Abschwächung um den Faktor 100 ab etwa 100 kHz erreicht. Bereits bei etwa<br />
300 kHz wird das Signal um den Faktor 1000 abgeschwächt.<br />
Abb. 4.9: Transferfunktionen <strong>der</strong> Filtereinheit im 19”-Gehäuse. Gezeigt sind jeweils<br />
die Mittelwerte über die 16 Kanäle <strong>der</strong> vier Filtermodule.<br />
In den Frequenzen bis 100 Hz erkennt man Abweichungen im Signal zwischen<br />
den einzelnen Filtermodulen. Der Netzwerkanalysator wurde bei <strong>der</strong> <strong>Aufnahme</strong> <strong>der</strong><br />
Transferfunktionen mit einem Frequenzparameter von 100 Hz betrieben. Dadurch<br />
kann <strong>der</strong> Netzwerkanalysator keine Frequenzen unterhalb <strong>der</strong> eigentlichen Analysatorbandbreite<br />
auflösen. Durch Umstellung <strong>der</strong> Einstellung auf 10 Hz konnte diese<br />
Vermutung bestätigt werden. Dies ist in Abbildung 4.10 dokumentiert.
4. Durchführung, Experimente und Ergebnisse 47<br />
Abb. 4.10: Untersuchung <strong>der</strong> Frequenzparameter des Netzwerkanalysators. Frequenzen<br />
unter 10 Hz sind wegen <strong>der</strong> Netzwerkanalysator-Filtereinstellung<br />
nicht messbar.<br />
Die Schwankungen in <strong>der</strong> Messkurve liegen an den Einstellungen des Netzwerkanalysators.<br />
Eine niedrigere Analysatorbandbreite zeigt eine detailliertere Kurve ohne<br />
starke Schwankungen. Da die untere Grenze des Netzwerkanalysators bei 5 Hz liegt,<br />
machen Untersuchungen mit diesem Gerät bei einer Filtereinstellung von 10 Hz nur<br />
im Bereich von 10 Hz bis 10 kHz Sinn.<br />
4.1.3.2 Übersprechen<br />
Ein entscheiden<strong>der</strong> Faktor bei <strong>der</strong> Messung von elektrischen Signalen ist die gegenseitige<br />
Beeinflussung elektronischer Komponenten, das sog. Übersprechen (crosstalk).<br />
Hierzu wurde auf einen <strong>Kanal</strong> eine sinusförmige Welle gegeben und auf verschiedenen<br />
Verstärkerausgängen die Aktivität mit dem Oszilloskop gemessen. Ein Beispiel<br />
einer solchen Messung ist in Abbildung 4.11 zu sehen. Auf <strong>Kanal</strong> 13 wurde das Sinussignal<br />
eingespeist. Die an<strong>der</strong>en Kanäle liegen auf Masse. Alle Kanäle zeigen die<br />
typische Transferfunktion. Allerdings sind die Signale <strong>der</strong> auf Masse liegenden Leitungen<br />
wesentlich schwächer. Der Unterschied zwischen <strong>Kanal</strong> 13 und den Kanälen<br />
12, 14, 15, 16 liegt bei etwa -<strong>60</strong> dB, was einer Abschwächung des Signals um den<br />
Faktor 1000 entspricht. Da relativ starkes Rauschen durch die hohen Impedanzen<br />
des MEAs erwartet werden, sollte ein Übersprechen in <strong>der</strong> Messung nicht bemerkbar<br />
sein. Bis 100 Hz sind schwache Schwingungsphänomene zu erkennen, die ebenfalls<br />
unter -<strong>60</strong> dB liegen.
4. Durchführung, Experimente und Ergebnisse 48<br />
Abb. 4.11: Untersuchung des Übersprechens <strong>eines</strong> <strong>Kanal</strong>s gegenüber den an<strong>der</strong>en.<br />
Auf <strong>Kanal</strong> 13 wurde eine Sinusförmige Wellenform gelegt.<br />
4.1.3.3 Rauschen<br />
Rauschen kann zwei Ursprünge haben:<br />
• Elektronik: Bausteine und Leitungen auf <strong>der</strong> Platine erzeugen ein sog. Eigenrauschen.<br />
• Gesamtsystem: Störungen durch eine hohe Impedanz, die durch MEA, Zuleitungen<br />
und Medium hervorgerufen wird.<br />
Das Verstärker-Eigenrauschen wurde durch ein Verbinden <strong>der</strong> Masseleitung mit<br />
den Eingängen des Verstärkers bestimmt (siehe Abbildung 4.12 linke Seite). Für die<br />
Untersuchung des Rauschens des Gesamtsystems wurde ein MEA mit MEM-Medium<br />
gefüllt, eine Referenzelektrode in das Medium gegeben und mit <strong>der</strong> Masseleitung des<br />
Verstärkers verbunden. Das gefüllte MEA wurde in den Verstärker gesetzt und das<br />
Ausgangssignal auf dem Oszilloskop gemessen (siehe Abbildung 4.12 rechte Seite).<br />
Zwischen direktem Kurzschluss und Messung mit Medium liegen etwa 3 mV Differenz.<br />
Dies lässt sich durch die hohen Leitungswi<strong>der</strong>stände des MEAs und des Mediums<br />
erklären. Die Gesamtrauschspannung mit MEA und Medium Peak-to-Peak<br />
ist 14 mV. Bei einer ca. 1000-fachen Verstärkung liegt das Rauschen bei etwa 14 µV.<br />
Im Vergleich zu einem erwarteten Zellsignal von max. 100 µV ergibt sich ein Signalzu<br />
Rauschverhältnis von 7:1. Zellsignale sollten deutlich erkennbar sein.
4. Durchführung, Experimente und Ergebnisse 49<br />
Abb. 4.12: Untersuchung des Rauschens des Verstärkersystems. Links: Masseleitung<br />
und Elektrode sind direkt verbunden. Rechts: In das Messgerät<br />
wurde ein MEA mit Medium eingelegt. Das Medium wurde mit Masse<br />
über eine in das Bad getauchte Elektrode kontaktiert.<br />
4.1.3.4 Schaltverhalten <strong>der</strong> Stimulationselektronik<br />
Bei gleichem Experimentieraufbau wie bei <strong>der</strong> Rauschanalyse wird eine Elektrode<br />
mit einem Funktionsgenerator verbunden. Es werden bipolare sinusförmige Spannungspulse<br />
in Abständen von 1 Sekunde auf die Elektrode gegeben. Dadurch kann<br />
die Reaktion <strong>der</strong> Verstärkerelektronik auf die hohen Spannungspulse von bis zu<br />
800 mV untersucht werden. Das resultierende Bild ist in Abbildung 4.13 zu sehen.<br />
Es entsteht ein Stimulationsartefakt.<br />
Abb. 4.13: Stimulationsartefakte entstehen durch die Aufladung von Kondensatoren<br />
in <strong>der</strong> Verstärkerschaltung. Der Artefakt beeinträchtigt die Messung nach<br />
<strong>der</strong> Stimulation.
4. Durchführung, Experimente und Ergebnisse 50<br />
Durch die Stimulationspulse werden innerhalb <strong>der</strong> Verstärkerelektronik Kondensatoren<br />
aufgeladen, die sich wie<strong>der</strong> entladen müssen, bevor die <strong>Aufnahme</strong> fortgesetzt<br />
werden kann. Diese Totzeit nennt man Stimulationsartefakt. Sie kann durch eine<br />
Übersteuerung des Verstärkers mit einem Pulsgenerator gemessen werden. Auf den<br />
Eingang des Verstärkers wird ein Puls von bis zu 1 V gegeben. Durch die 1000-<br />
fache Verstärkung übersteuert <strong>der</strong> Verstärker und geht in die Sättigung. Nachdem<br />
<strong>der</strong> Stimulationspuls beendet ist, sollte <strong>der</strong> Verstärker sofort wie<strong>der</strong> in die Nulllage<br />
übergehen. Durch Aufladungen <strong>der</strong> Kondensatoren im Verstärker geht <strong>der</strong> Verstärkerausgang<br />
erst langsam auf die Nullage zurück. Man erkennt deutlich den exponentiellen<br />
Abfall des Artefakts durch die Entladung des Kondensators. Es ergibt sich<br />
eine maximale Artefaktdauer von 2 ms.<br />
Stimulationsartefakte stören die Messungen <strong>der</strong> Netzwerkaktivität. Durch das Artefakt<br />
werden die Zellsignale überdeckt. Eine Minimierung dieses Artefakts ist wichtig.<br />
Die hier gemessene Artefaktdauer von 2 ms ist in Relation zu einer Aktionspotentialdauer<br />
von mindestens 1 ms relativ kurz und akzeptabel.<br />
Sollen die Zellen auf ein bestimmtes Ereignis (z.B. bestimmtes Spike-Muster) stimuliert<br />
werden, so spricht man von Echtzeitstimulation. Typische in Computer eingebaute<br />
Analog-Digitalwandlerkarten benutzen einen Zwischenpuffer zur Datenaufnahme,<br />
<strong>der</strong> Daten zwischenspeichert, bis er voll ist. Erst dann stellt er den Speicherinhalt<br />
<strong>der</strong> Applikation zur Verfügung. Dadurch erhält die Mess-Applikation die Informationen<br />
zeitverzögert. Eine Echtzeitstimulation ist damit nur mit dieser geräteund<br />
softwarespezifischen Zeitverzögerung möglich, die so niedrig wie möglich sein<br />
sollte. Ein idealer Wert wäre eine Zeitskala unter einer Millisekunde. Wie bereits<br />
im Abschnitt ”<br />
Material und Methoden” erwähnt, kann bei dem hier beschriebenen<br />
<strong>Aufbau</strong> die Zeitskala auf etwa 2 ms beschränkt werden.<br />
4.1.3.5 Leitgummis<br />
Um das elektrische Leitvermögen <strong>der</strong> Leitgummis zu charakterisieren wurde eine<br />
Spektrumanalyse mit dem Netzwerkanalysator durchgeführt. Hierzu wurde <strong>der</strong> Leitgummi<br />
zwischen zwei Kupferplatten eingespannt und <strong>der</strong> Ein- und Ausgang des<br />
Netzwerkanalysators jeweils an einer <strong>der</strong> beiden Kupferplatten kontaktiert (siehe<br />
Abbildung 4.14).<br />
Abb. 4.14: <strong>Aufbau</strong> zur Messung <strong>der</strong> Impedanz <strong>eines</strong> Leitgummis: Das Leitgummi<br />
ist zwischen zwei Kupferplatten befestigt. Mit einem Netzwerkanalysator<br />
kann dann die Frequenzabhängigkeit des Leitgummis bestimmt werden.
4. Durchführung, Experimente und Ergebnisse 51<br />
Die gemessene Funktion zeigt einen fast linearen Verlauf im Frequenzbereich um<br />
1 kHz. Die durchgelassene Leistung ist bei 1 kHz maximal. Frequenzen von 500 Hz<br />
bis einige kHz enthalten die wichtigsten Informationen neuronaler Aktivität. Da bei<br />
diesen Frequenzen auch die durchgelassene Leistung maximal ist, sind Leitgummis<br />
für die Kontaktierung ideal. Durch die elastischen Eigenschaften des Materials können<br />
Kontaktierungen wesentlich zuverlässiger als mit einfachen Goldkontaktstiften<br />
vorgenommen werden. Die Differenz <strong>der</strong> Transferfunktionen mit und ohne Leitgummi<br />
zeigt bei hohen Frequenzen einen Abstieg in <strong>der</strong> Absorption des Signals. Dadurch<br />
wirkt das Leitgummi wie ein Tiefpassfilter, <strong>der</strong> störende Hochfrequenzfel<strong>der</strong> schlechter<br />
als nie<strong>der</strong>frequente Informationen weiterleitet.<br />
Abb. 4.15: Gemessene Transferfunktion des Leitgummis aus einer Mischung aus Silikon<br />
/ Graphit<br />
4.1.4 Peripherie<br />
4.1.4.1 Heizung<br />
Auf einer 0,5 mm dicken Platine sind konzentrisch Leiterbahnen angebracht (Abb.<br />
4.16 links). Die Platine ist 40×40 mm 2 groß. Ein Temperatursensor LM45 (National<br />
Semiconductors) misst die Oberflächentemperatur <strong>der</strong> Platine. Die Kontakte des<br />
Sensors sind durch Löcher auf die Rückseite <strong>der</strong> Platine und von dort aus an den<br />
Rand <strong>der</strong> Platine geführt. Der Sensor ist so kalibriert, dass er bei 0 ◦ C eine Spannung<br />
von 0 V zurückgibt. Für jedes weitere ◦ C steigt die Ausgabespannung um 10 mV.<br />
Die Heizungsschaltung ist mit einem 2 A - Netzteil in ein 19“ Modul (Conrad) eingebaut<br />
(Abb. 4.16 rechts). Sie wurde aus einer zweiseitigen Kupferplatine mit Photolack<br />
geätzt. Als Verstärker dient ein Hochleistungs-OPV (LM675T, Linear Technologies).<br />
Der Anschluss des Temperatur-Steuergeräts mit dem MEA erfolgt über<br />
ein 9-Pol Sub-D Kabel (Molex). Ein zweiter Anschluss für den Computer ermöglicht
4. Durchführung, Experimente und Ergebnisse 52<br />
Abb. 4.16: Links: Die Heizspirale beherbergt einen Temperatursensor in <strong>der</strong> Mitte.<br />
Rechts: Fertiges 19” Temperatursteuermodul.<br />
die Temperaturprotokollierung während <strong>der</strong> Messungen. Ein Flüssigkristallmodul<br />
(LCD-Modul, Conrad) stellt wahlweise die aktuelle Temperatur o<strong>der</strong> die Solltemperatur<br />
dar. Über einen Drehpotentiometer kann die Soll-Temperatur eingestellt<br />
werden. Der OPV wird über einen Kippschalter (Molex) wahlweise mit –15 V . . .<br />
+15 V o<strong>der</strong> 0 V . . . +15 V versorgt. Dadurch kann optional mit Peltier-Elementen<br />
temperiert werden.<br />
4.1.4.2 Flusskammer<br />
Eine Form aus Epoxydharz (Uhu) wurde hergestellt. In diese Form wird Polydimethylsiloxan<br />
(PDMS) gefüllt und über 2 Stunden bei <strong>60</strong> ◦ C ausgehärtet. Das ausgehärtete<br />
PDMS wird auf Glas adhäsiv aufgeklebt und erlaubt ein einfaches Füttern<br />
<strong>der</strong> Zellen. Das Prinzip einer Flusskammer ist in Abbildung 3.7 dargestellt.<br />
Bei <strong>der</strong> Herstellung <strong>der</strong> Flusskammern aus PDMS traten an <strong>der</strong> Schlauch-Flusskammer-Schnittstelle<br />
oft undichte Stellen auf. Durch ein Design, das über eingegossene<br />
Luer-Schlauchverbin<strong>der</strong> eine stabilere Verankerung <strong>der</strong> Schlauchanschlüsse im<br />
PDMS ermöglicht, konnte dieses Problem gelöst werden (siehe Abbildung 4.17 linke<br />
Seite).<br />
Mit einer Spritzenpumpe kann das MEA sehr einfach mit Medium versorgt werden<br />
(siehe Abbildung 4.17 rechte Seite). Durch den geschlossenen <strong>Aufbau</strong> kann auch<br />
außerhalb des sterilen Brutschrankes gearbeitet werden.<br />
Eine Automatisierung <strong>der</strong> Nährstoffversorgung erhöht die Reproduzierbarkeit. Ein<br />
8-Wege-Ventil vom Typ EMTMA (VICI) verteilt das Medium an verschiedene Kulturen.<br />
Das Ventil wird über den seriellen Port <strong>eines</strong> Computers gesteuert, <strong>der</strong> per<br />
in Visual Basic (Microsoft) geschriebener Computersoftware gesteuert wird. In dieser<br />
Software können Ventile ausgewählt werden, bestimmte Zeitspannen abgewartet<br />
und komplette Fütterungsprogramme implementiert und zyklisch wie<strong>der</strong>holt werden<br />
(Abbildung 4.18).
4. Durchführung, Experimente und Ergebnisse 53<br />
Abb. 4.17: Links: Flusskammer aus PDMS. Zu sehen ist <strong>der</strong> Durchflusskanal in <strong>der</strong><br />
Mitte. Rechts und links sind Zu- und Ableitung für Medium und Neuropharmaka.<br />
Die verwendeten Luer-Klemmen sind im Originalzustand<br />
und für das Experiment zurechtgeschnitten dargestellt. Rechts: Mittels<br />
zweier Spritzen, die miteinan<strong>der</strong> verklebt sind, kann gleichzeitig exakt die<br />
gleiche Menge Medium aus <strong>der</strong> Flusskammer gesaugt werden, wie in sie<br />
hereingepumpt wird. Dadurch verringern sich die auftretenden Druckdifferenzen.<br />
Abb. 4.18: Die Software ”<br />
NeuroNI Feeding Assistant” kontrolliert den Zufluss von<br />
Medium über ein 8-Wege-Ventil, das per seriellem Port des Computers<br />
gesteuert wird.
4. Durchführung, Experimente und Ergebnisse 54<br />
4.1.5 Software<br />
4.1.5.1 <strong>Aufnahme</strong><br />
Die <strong>Aufnahme</strong>software wurde mit Visual C++ (Microsoft) erstellt. Zwei unabhängige<br />
Prozesse, sog. threads, trennen die Datenaufnahme und -speicherung von <strong>der</strong><br />
Datenanalyse und -darstellung. Der erste Prozess arbeitet unter höchster Systempriorität<br />
für die Datenaufnahme. In einem zweiten Prozess werden die Messdaten<br />
graphisch dargestellt, falls noch Rechenzeit übrig sein sollte. Schwellenwertbedingungen,<br />
sog. ”<br />
threshold trigger events“, werden ebenfalls im zweiten Prozess berechnet.<br />
Falls ein Stimulations-Trigger-Ereignis auftritt, wird eine Unterbrechung (interrupt)<br />
ausgelöst, die die Stimulationssoftware aktivieren kann. In Abbildung 4.19 ist die<br />
Oberfläche <strong>der</strong> <strong>Aufnahme</strong>software dargestellt.<br />
Abb. 4.19: <strong>Aufnahme</strong>software<br />
Die Datenaufnahme arbeitet mit einem kleinen <strong>Aufnahme</strong>buffer von 40 Byte<br />
pro <strong>Kanal</strong>. Der daraus resultierende <strong>Aufnahme</strong>buffer von 25<strong>60</strong> Byte wird durch<br />
die Analog-Digital-Wandlerkarte mit einer Samplefrequenz von 1,25 MS/s (≡ 2,5<br />
MB/s) gefüllt. Innerhalb von 1 ms ist dieser Buffer voll und kann von <strong>der</strong> Applikation<br />
ausgelesen werden. Durch die hohe Systempriorität besitzt die Applikation<br />
genug Rechenzeit diese Operation durchzuführen. Direkt darauffolgende Berechnungen<br />
(Peak-Analyse) ermöglichen eine Reaktion auf ein Signal innerhalb von 2 ms<br />
nach dessen Auftreten.<br />
4.1.5.2 Stimulationssoftware<br />
Mit <strong>der</strong> Stimulationssoftware können Stimulationsmuster erstellt und ausgegeben<br />
werden. Es gibt drei Grundformen von Stimulationsmustern:<br />
• Berechnete Kurven<br />
• Aus WAV-Dateien eingeladene diskrete Wertemengen<br />
• 2D-Muster (Graustufenbil<strong>der</strong>)
4. Durchführung, Experimente und Ergebnisse 55<br />
Die Ausgabe von berechneten Kurven ermöglicht die klassische Reizung von neuronalen<br />
Netzen durch vordefinierte Stimulationsmuster. Die Applikation stellt Grundformen<br />
wie z.B. ”<br />
Sinus-Welle”, ”<br />
Rechteck-Puls”und ”<br />
Sägezahn”in einer Auswahlliste<br />
zur Verfügung. Durch Angabe von Dauer, Amplitude und Anzahl von Wie<strong>der</strong>holungen<br />
kann ein individuelles Stimulationsmuster erstellt werden (Abb. 4.20).<br />
Abb. 4.20: Stimulationssoftware: Berechnete Kurven<br />
Für bestimmte Anwendungen ist es hilfreich, vorberechnete WAV-Dateien ausgeben<br />
zu können. Durch Angabe <strong>eines</strong> Zeit- und Amplitudenskalierungsfaktors können<br />
die WAV-Dateien als angepasstes Stimulationsmuster ausgegeben werden (siehe Abbildung<br />
4.21).<br />
Ein weiteres Aufgabenfeld besteht in <strong>der</strong> Mustererkennung durch natürliche neuronale<br />
Netze. Der Menüpunkt 2D-Muster realisiert diese Variante (siehe Abbildung<br />
4.22). Durch verschiedene Farben werden unterschiedliche Stimulationsmuster dargestellt,<br />
die verschiedene Graustufen <strong>eines</strong> Bildes wie<strong>der</strong>spiegeln.
4. Durchführung, Experimente und Ergebnisse 56<br />
Abb. 4.21: Stimulationssoftware: WAV-Abspielung<br />
Abb. 4.22: Stimulationssoftware: 2D-Muster
4. Durchführung, Experimente und Ergebnisse 57<br />
4.2 Zellaktivität<br />
Hühnereier wurden präpariert und auf MEAs und Petrischalen ausplatiert. Die Petrischalen<br />
dienen als Kontrollkulturen. Nach 14 Tagen im Inkubator sollten die Zellen<br />
vernetzt und elektrisch aktiv sein. Hierbei traten mehrere Probleme auf:<br />
1. Die Kulturen waren kontaminiert (Bakterien o<strong>der</strong> Pilze).<br />
2. Die Neurone starben nach kurzer Zeit.<br />
3. Die Zellen differenzierten sich nicht, d.h. sie vernetzten sich nicht.<br />
4. Die Zellen wuchsen nicht auf den Elektroden.<br />
Kontaminierte Zellkulturen können nur durch sterile Arbeitstechniken verhin<strong>der</strong>t<br />
werden. Durch die Komplexität <strong>der</strong> Präparation könnte die Kontamination von vielen<br />
Quellen stammen. Durch Verän<strong>der</strong>ungen in <strong>der</strong> Vorgehensweise wurde die Kontaminationsquelle<br />
in einer Flasche MEM-Medium gefunden. Durch Wechsel auf ein<br />
neues Medium verschwand die Kontamination.<br />
Zellen benötigen physiologische Bedingungen um überleben zu können. Mögliche<br />
Faktoren für einen verfrühten Zelltod sind:<br />
• ungeeignetes o<strong>der</strong> falsches Nährmedium<br />
• zu später Tausch von verbrauchtem Nährmedium<br />
• pH-Wert weicht relativ stark von 7,4 ab<br />
• fehlende Vernetzung<br />
• ungünstiger Untergrund<br />
Durch Experimente mit unterschiedlichen Nährmedien konnte festgestellt werden,<br />
dass D-MEM und Neurobasal ähnlich gute Ergebnisse erzielen. MEM-Medium dagegen<br />
scheint ungeeignet, da sich die Zellen mit MEM-Medium nicht entwickeln.<br />
Als Serumzusatz stellten sich fötales Kälberserum und Hühnchenserum als günstig<br />
dar. Pferdeserum sollte erst in einem späten Kulturstadium (nach einigen Wochen)<br />
verwendet werden, da die Zellentwicklung sehr schlechte Resultate mit Pferdeserum<br />
zeigt.<br />
Beson<strong>der</strong>s <strong>der</strong> Untergrund ist sowohl für das Wohlbefinden <strong>der</strong> Zellen als auch für<br />
die Differenzierung sehr wichtig. Die Adhäsionsvermittler Laminin, Poly-L-Ornithin<br />
(PO), Matrigel (BD Biosciences), Polyethylenimin (PEI) und Nitrozellulose wurden<br />
getestet. Sowohl Matrigel als auch eine Mischung aus PO, Laminin und PEI zeigten<br />
gute Resultate.<br />
Als MEAs standen bereits oft verwendete planare Elektrodenfel<strong>der</strong> zur Verfügung.<br />
Ältere MEAs haben den Nachteil, dass entwe<strong>der</strong> die Impedanz <strong>der</strong> Elektroden und<br />
ihrer Zuleitungen extrem hoch ist o<strong>der</strong> dass die isolierende Schicht über den Leitungen<br />
sich aufgelöst hat und somit kein Kontakt zu den Elektroden mehr hergestellt<br />
werden kann.
4. Durchführung, Experimente und Ergebnisse 58<br />
Abb. 4.23: Elektrode mit Zellteppich.<br />
Bei den meisten MEAs konnten keine Messungen gemacht werden, da durch fehlende<br />
Verbindung mit den Elektroden kein Signal aufnehmbar war. Bei einem MEA<br />
mit noch einigen existierenden Verbindungen bildete eine Kultur einen Teppich von<br />
Neuronen über wenige Elektroden (siehe Abbildung 4.23). Da zur diesem Zeitpunkt<br />
noch kein AD-Wandler vorhanden war, wurde ein 100-fach Verstärker nachgeschaltet<br />
und per Oszilloskop aufgenommen. Eine zweite Elektrode wurde als Vergleichselektrode<br />
aufgenommen, um Umwelteinflüsse als Differenz <strong>der</strong> beiden aufgenommenen<br />
Signale herausrechnen zu können. Auf eine dritte Elektrode in <strong>der</strong> Mitte zwischen<br />
den beiden Elektroden wurden Spannungspulse variabler Pulshöhe gegeben. Bei <strong>der</strong><br />
<strong>Aufnahme</strong> dieser Kultur zeigte sich ein Signal (Abb. 4.24).<br />
Da es sich um eine 100.000-fache Verstärkung handelte, ist eine Spannung von 8 V<br />
gleich einem Signal auf <strong>der</strong> Elektrode von 80 µV. Dies liegt prinzipiell im Rahmen<br />
typischer Zellsignale. Allerdings ist es ein relativ großes Signal, was man von einem<br />
alten MEA mit relativ schlechter Impedanz nicht erwarten würde. Auffällig sind die<br />
beiden glockenförmigen Erhöhungen vor und nach dem Stimulationspuls, die etwa<br />
20 ms außeinan<strong>der</strong> liegen. Dies sind vermutlich nicht gefilterte Anteile <strong>der</strong> 50 Hz<br />
Netzspannung (50 Hz = 20 ms).<br />
Fraglich ist die relativ schnelle Reaktion auf die Stimulation innerhalb von 2 ms.<br />
Antworten auf einen Stimulationspuls haben aufgrund <strong>der</strong> Erregungsweiterleitungsgeschwindigkeiten<br />
und <strong>der</strong> relativen Refraktärperiode die größte Wahrscheinlichkeit<br />
in Bezug auf die Reaktioszeit zwischen 5 und 10 ms. Weiterhin muss beachtet werden,<br />
dass die Reaktion etwa 8 ms lange dauert. Ein Aktionspotential dauert jedoch<br />
nur 1 bis 2 ms. Es könnte sich jedoch um beobachtete Diffusionsprozesse handeln,<br />
die um die Zelle nach einem Aktionspotential auftreten (Ionenausgleich).<br />
Paulo Bonifazi (SISSA, Triest, Italien) stellte Daten einer neuronalen Mäusekultur,<br />
gemessen mit einem Verstärkersystem von Multichannelsystems zur Verfügung.
4. Durchführung, Experimente und Ergebnisse 59<br />
Abb. 4.24: Fragliches Zellsignal. Bei einer Messung mit Stimulation zeigte sich dieses<br />
Signal.<br />
Ein Vergleich zeigt (s. Abb. 4.25), dass Zeitskalen von 10 ms durchaus realistisch<br />
sind. Die Kurven liegen gut übereinan<strong>der</strong>.<br />
Durch eine Abschwächung des Stimulationspulses verschwand das Signal unter einer<br />
Schwelle von ca. <strong>60</strong>0 mV. Die Messung konnte mehr als eine Stunde lang durchgeführt<br />
werden. Auf an<strong>der</strong>en Elektrodenkombinationen konnte kein vergleichbares<br />
Signal aufgenommen werden. Die genannten Indizien sprechen dafür, dass Zellaktivität<br />
aufgenommen wurde. Diese Kultur wurde im Inkubator aufbewahrt und kein<br />
HEPES für die Messung zugegeben. Aufgrund des geringen Kohlendioxidgehaltes in<br />
<strong>der</strong> Luft verän<strong>der</strong>te sich <strong>der</strong> pH-Wert <strong>der</strong> Kultur während <strong>der</strong> Messung. Nach über<br />
einer Stunde wurde das Signal schwächer und verschwand. Die Kultur wurde zurück<br />
in den Inkubator gelegt. Nach einigen Stunden konnten unter dem Mikroskop nur<br />
noch tote, abgelöste Zellen beobachtet werden. Dadurch war keine weitere Messung<br />
mit dieser Kultur möglich.<br />
Die folgenden Kulturen überlebten entwe<strong>der</strong> nicht länger als eine Woche o<strong>der</strong> es<br />
bildeten sich keine Zellteppiche auf den Elektroden.<br />
Es wurden neue MEAs mit Glasringen versehen und in einem Ozonbad sterilisiert.<br />
Die Kulturen auf diesen neuen MEAs entwickelten sich sehr gut. Nach einer Kontrollmessung<br />
mit den Multichannelsystems Verstärkersystem konnte jedoch kein Signal<br />
aufgenommen werden, da die Elektroden und Zuleitungen scheinbar durch das Ozon<br />
so sehr angegriffen wurden, dass sich die Impedanz zwischen Referenzelektrode und<br />
einer Elektrode des MEAs von etwa 1 MΩ auf über 20 MΩ verschlechtert hatte. Bei<br />
diesen hohen Impedanzen ist keine Messung mehr möglich.<br />
Aufgrund <strong>der</strong> hier geschil<strong>der</strong>ten Umstände konnten daher lei<strong>der</strong> keine Verifikationsmessungen<br />
durchgeführt werden. Weitere geplante Experimente (siehe Ausblick)<br />
konnten aufgrund von fehlenden Kulturen nicht durchgeführt werden.
4. Durchführung, Experimente und Ergebnisse <strong>60</strong><br />
Abb. 4.25: Vergleich des gemessenen Signals mit einem Zellsignal einer Mäusekultur<br />
(aufgenommen mit MCS-Verstärker von Paolo Bonifazi, SISSA-Institut<br />
in Triest, Italien)<br />
4.3 Vergleich mit MCS-System<br />
Aufgrund <strong>der</strong> wenigen Zellmessungen kann ein Vergleich zwischen dem in dieser<br />
Arbeit erstellten System und dem MCS-System nur in sehr eingeschränkter Weise<br />
vorgenommen werden. Betrachtet man zunächst einmal nur die praktischen Aspekte<br />
<strong>der</strong> beiden Geräte, so hat das in dieser Arbeit präsentierte Gerät den Vorteil, dass<br />
Adapter für die Kontaktierung von MEAs sowohl auf <strong>der</strong> Ober- als auch auf <strong>der</strong> Unterseite<br />
befestigt werden können. Dadurch kann das hier präsentierte Gerät sowohl<br />
auf normalen als auch inversen Mikroskopen mit dem passenden Adapter eingesetzt<br />
werden.<br />
Die Stimulation ist ein entscheiden<strong>der</strong> Aspekt in dieser Arbeit. Wie bereits erwähnt<br />
dauert ein Stimulationsartefakt etwa 2 ms in dem hier präsentierten Gerät.<br />
Das Multichannelsystems-Gerät hat Artefakte von etwa 10 ms bei gleichen Bedingungen.<br />
Das Rauschen kann nicht direkt verglichen werden, da die Filtereigenschaften unterschiedlich<br />
sind. Bei einem MCS-System mit 10 Hz bis 5000 Hz Filterbereich liegt<br />
das Rauschen zwischen 5 µV und 20 µV, je nach verwendeter Schirmung und MEA.<br />
Dies ist ein wenig besser als die 15 µV des hier präsentierten Gerätes. Durch ein multilayer-SMD-Layout<br />
sollten jedoch hier noch Verbesserungsmöglichkeiten liegen.<br />
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass beide Geräte vergleichbar sind.<br />
Auf Basis <strong>der</strong> Stimulation liegen leichte Vorteile auf dem hier präsentierten Gerät.<br />
Allerdings könnten durch Anpassung des MCS-Gerätes die geschil<strong>der</strong>ten Nachteile<br />
vermutlich umgangen werden.
Teil IV<br />
Zusammenfassung und Ausblick
5 Zusammenfassung und Ausblick<br />
5.1 Zusammenfassung<br />
Das Aufgabengebiet dieser Diplomarbeit teilt sich in viele Bereiche. Auf Seite <strong>der</strong><br />
Biologie ist ein Grundverständnis über Zellen und <strong>der</strong>en Wechselwirkungen mit <strong>der</strong><br />
Umwelt notwendig, das im ersten Teil dieser Arbeit zusammengefasst wurde.<br />
Grundlage <strong>der</strong> <strong>Aufnahme</strong> von Zellsignalen ist die Verstärkungselektronik, <strong>der</strong>en<br />
Theorie ebenfalls im ersten Teil dargestellt wurde. Eine geeignete Schaltung wurde<br />
entworfen, die Zellsignale aufnehmen und auf beliebige Kombinationen von Elektroden<br />
unterschiedliche Stimulationsmuster ausgeben kann. Die Schaltung funktioniert<br />
mit extrem kurzen Stimulationsartefakten, die es ermöglicht, kurz nach <strong>der</strong> Stimulation<br />
bereits zuverlässige Daten zu messen. Die AD-Wandlung <strong>der</strong> Daten im<br />
Computer und <strong>Aufnahme</strong> <strong>der</strong> Daten durch ein Messprogramm wurden realisiert.<br />
Durch Charakterisierungsmessungen konnte die Funktionsweise <strong>der</strong> Elektronik im<br />
Elektroniklabor bestätigt werden. Die experimentelle Bestätigung <strong>der</strong> <strong>Aufnahme</strong>einheit<br />
in Verbindung mit Nervenzellen konnte nur in einer Messung überprüft werden.<br />
Weitere Messungen waren nicht möglich, da die Zellkulturen entwe<strong>der</strong> abgestorben<br />
waren, bevor sie einen ausreichenden Vernetzungszustand hatten, o<strong>der</strong> die MEAs<br />
nicht funktionsfähig waren. Brauchbare MEAs waren erst in den letzten zwei Monaten<br />
dieser Arbeit verfügbar. Durch einen Sterilisierungsprozess mit Ozon wurde die<br />
Impedanz dieser MEAs jedoch negativ beinflusst, so dass auch hiermit keine weiteren<br />
Messungen möglich waren. Weitere Experimente sind zur Charakterisierung und<br />
Optimierung <strong>der</strong> Elektronik nötig.<br />
Aufgrund <strong>der</strong> fehlenden Zellkulturen konnten auch keine Experimente mit neuronalen<br />
Netzen durchgeführt werden. Die Vorteile des Systems konnten dadurch lei<strong>der</strong><br />
nicht herausgestellt und experimentell bestätigt werden.<br />
Die Vorteile des hier präsentierten Messaufbaus liegen in <strong>der</strong> Stimulation. Durch<br />
eine integrierte elektronische Umschaltung zwischen <strong>Aufnahme</strong> und Stimulation sind<br />
wissenschaftlich sehr interessante Experimente möglich, die mit den kommerziell<br />
erhältlichen Systemen <strong>der</strong>zeit noch nicht möglich sind.<br />
5.2 Ausblick<br />
Mit gut vernetzten Kulturen könnten neurophysiologische Untersuchungen gemacht<br />
werden. Ein erstes Experiment wäre die <strong>Aufnahme</strong> spontaner Aktivität von Neuronen.<br />
Hierzu wird das MEA in den Verstärker eingespannt und ohne Stimulation
5. Zusammenfassung und Ausblick 63<br />
aufgenommen. Dieses Experiment könnte durch Aktivierung einer Stimulationselektrode<br />
erweitert werden. Die Reaktion <strong>der</strong> Zellen auf den Spannungspuls sollte sich<br />
durch eine verstärkte Aktivität ausdrücken.<br />
Die Temperaturabhängigkeit <strong>der</strong> Netzwerkaktivität ist ein weiteres einfach zu realisierendes<br />
Experiment. Als Heizung wird ein Peltier-Element eingesetzt, das die<br />
MEA-Kultur auf definierte Temperaturen abkühlt. Durch die niedrigeren Umgebungstemperaturen<br />
sinkt die Rate <strong>der</strong> spontanen Aktivitätsspikes.<br />
Durch Zugabe von Neurotransmittern o<strong>der</strong> -inhibitoren, wie z.B. Tetrodotoxin<br />
(TTX) o<strong>der</strong> Nikotin, können weitere interessante Statistiken über Netzwerkaktivität<br />
aufgezeichnet werden.<br />
Wissenschaftlich interessant sind Untersuchungen von Lernverhalten und neuronalem<br />
Code. Ein erster Schritt könnte eine Wie<strong>der</strong>holung des Shahaf und Marom”-<br />
”<br />
Experimentes sein [Shahaf und Marom, 2001]. Bei diesem Experiment werden so<br />
lange Stimulationspulse auf eine Elektrode gegeben, bis eine bestimmte Netzwerkantwort<br />
aufgenommen wird. Nach einer kurzen Pause beginnt die Stimulation von vorne.<br />
Untersucht wird die Zeitspanne zwischen Anfang <strong>der</strong> Stimulation und <strong>der</strong> korrekten”<br />
Netzwerkantwort. Shahaf fand heraus, dass diese Zeitspanne kürzer wird, um ”<br />
so länger das Experiment dauert. Das Netzwerk hat sozusagen diesen Zustand” ”<br />
gelernt.<br />
Solche Experimente könnten beliebig ausgedehnt werden. Eine <strong>der</strong> wichtigsten<br />
Fragestellungen ist die des neuronalen Codes. Denkbar ist, dass Informationen spannungscodiert<br />
o<strong>der</strong> frequenzcodiert übertragen werden. Bei <strong>der</strong> Spannungscodierung<br />
werden unterschiedlich hohe Spannungspulse auf das Netzwerk gegeben. Fraglich ist<br />
hierbei, warum Neuronen unterschiedliche Spannungen als Informationen akzeptieren<br />
sollten, da sie entwe<strong>der</strong> ein Aktionspotential auslösen können o<strong>der</strong> k<strong>eines</strong>. An<br />
dieser Stelle könnte argumentiert werden, dass an den Synapsen viele Axone zusammenkommen<br />
und somit zu einer Integration dieser einzelnen Aktionspotentiale zu<br />
einer Gesamtspannung führen. Eine an<strong>der</strong>e Idee besteht in <strong>der</strong> Frequenzcodierung,<br />
d.h. in <strong>der</strong> zeitlichen Abfolge von Aktionspotentialen. Durch ein auf mehrere Zustände<br />
erweitertes Shahaf und Marom”-Experiment könnte untersucht werden, wie<br />
”<br />
die Zellen auf verschiedene Codierungsarten reagieren. Eine mögliche Variante wären<br />
zwei unterschiedliche Frequenzen, für die unterschiedliche Stop”-Bedingungen<br />
”<br />
definiert werden. Diese Variante erscheint für einen Erfolg als wesentlich wahrscheinlicher.<br />
Denkbar wären auch virtuelle Umgebungen, in denen über die Elektroden Einund<br />
Ausgabeinformationen für Sensoren definiert werden. Eingabekanäle wären z.B.<br />
” Augen” o<strong>der</strong> Ohren”. Ausgabekanäle wären z.B. motorische Bewegungen. Das neuronale<br />
Netz könnte sich dann in seiner eigenen Welt bewegen. Solche Ansätze wer-<br />
”<br />
den <strong>der</strong>zeit vom Animat-Projekt [DeMarse u.a., 2001] und dem NeuroBIT-Projekt<br />
(Projektleiter: Sergio Martinoia) verfolgt. Ein solches Experiment ohne Lehrer”, ”<br />
d.h. ohne direkte Wissenseinspeicherung von außen, könnte mit Digitalen Signal-<br />
Prozessoren (DSP) realisiert werden. Diese autonomen Ein-Chip-Computersysteme<br />
auf Mikrochip-Basis haben integrierte Datenaufnahme und -analysefunktionen. DSPs<br />
sind in <strong>der</strong> Lage, eigenständig Stimulationssignale auszugeben. Dieser Chip könnte<br />
eine künstliche Welt für das MEA ausgeben. Über eine vordefinierte Topologie
5. Zusammenfassung und Ausblick 64<br />
könnte <strong>der</strong> DSP auf Aktivität des Netzwerks mit Stimulationspulsen antworten.<br />
Durch das <strong>Aufnahme</strong>system könnten Verän<strong>der</strong>ungen im Verhalten des Netzwerks<br />
protokolliert werden, um so Hinweise auf einen neuronalen Code zu erhalten.<br />
Auf technischer Seite sind viele Entwicklungen denkbar. Eine Vereinfachung für<br />
Routineuntersuchungen würde eine Kontaktierung durch pin grid array-Stecksockel<br />
(PGA) darstellen, auf die das MEA mit Leitsilber verklebt wird. Der Sockel wird<br />
auf einem ”<br />
zero insertion force”-Sockel (ZIF) aufgelegt und mit einem kräftefreien<br />
Hebel (zero insertion foce = ZIF) befestigt (siehe Abbildung 5.1). Dadurch kann das<br />
MEA innerhalb von Sekunden gewechselt werden. Durch eine integrierte Heizung im<br />
PGA kann das MEA sogar außerhalb des Inkubators aufbewahrt werden.<br />
Abb. 5.1: Befestigung des MEAs auf einem pin-grid-array-Sockel (PGA).<br />
Eine Reduktion von Stimulationsartefakten könnte mit einem Dreistufenschalter<br />
erreicht werden. Statt einer direkten Abkopplung <strong>der</strong> Stimulation von den Elektroden<br />
kann eine Zwischenschaltstufe als Masseverbindung genutzt werden. Dadurch<br />
können Spannungsüberhöhungen <strong>der</strong> <strong>Aufnahme</strong>kanäle über die Masseleitung abfließen.<br />
Eine zweite Möglichkeit besteht in <strong>der</strong> Anpassung des Stimulationspulses an die<br />
Eigenschaften <strong>der</strong> Verstärkerelektronik. Werden gezielt Gegenladungen eingebracht,<br />
so kann dem Aufladungseffekt entgegengewirkt werden. Durch Messungen, bei denen<br />
das Stimulationsartefakt direkt wie<strong>der</strong> aufgenommen wird und <strong>der</strong> Stimulationspuls<br />
so lange verän<strong>der</strong>t wird (Längen- und Amplitudenmodulation), bis ein minimales Artefakt<br />
verbleibt, kann die Totzeit minimiert werden. Ein Optimierungsalgorithmus<br />
könnte die optimale Pulsform durch eine Kombination von Analyse und Versuchen<br />
herausfinden. Durch ein automatisiertes Suchen <strong>der</strong> Kontrollparameter mittels Optimierungsalgorithmen<br />
würde dieser Prozess vereinfacht. Denkbar wären genetische<br />
Algorithmen in Kombination mit künstlichen neuronalen Netzen.<br />
Die Stimulationsmodule könnten an das MCS-Verstärkersystem angepasst werden.<br />
Durch eine neue Software (z.B. auf Basis von MEA-Bench von Daniel Waagenar<br />
und Linux-RT) könnte dann aus dem MCS-System ebenfalls ein Echtzeit-<br />
Stimulationssystem hergestellt werden.<br />
Durch Integration <strong>der</strong> Filtermodule in PCMCIA-Steckkarten würde die Auswahl<br />
<strong>der</strong> Filterbereiche stark vereinfacht. Durch eine zweiseitige SMD-Bestückung auf<br />
multilagen-Platinen, die in <strong>der</strong> Elektronikwerkstatt <strong>der</strong> Universität Kaiserslautern<br />
nicht möglich ist, könnten die Ausmaße des Messaufbaus enorm verkleinert wer-
5. Zusammenfassung und Ausblick 65<br />
den. In Verbindung mit einem DSP-Prozessor könnte ein portabler Neurosensor aus<br />
diesem <strong>Aufbau</strong> hergestellt werden.<br />
Auf dem Gebiet <strong>der</strong> natürlichen neuronalen Netze in Verbindung mit Multi-<br />
Elektroden-Arrays sind noch viele interessante Experimente möglich und nötig. Mit<br />
dem in dieser Arbeit präsentierten Messaufbau sind erste Untersuchungen von Lernphänomenen<br />
möglich. Interessante Fragestellungen warten auf ihre Realisierung.
Teil V<br />
Anhang
6 Anhang<br />
6.1 Elektronik<br />
6.1.1 Matrix-Schalter zur <strong>Kanal</strong>auswahl<br />
Zu Beginn <strong>eines</strong> Experimentes ist meistens noch nicht bekannt, welche Kanäle stimuliert<br />
werden sollen, da die Zellen an manchen Stellen besser auf Stimuli reagieren,<br />
als an an<strong>der</strong>en Stellen 1 . Außerdem könnten für Konditionierungsversuche bestimmte<br />
Elektrodenkonfigurationen zur Stimulation erfor<strong>der</strong>lich sein. Benötigt wird also<br />
eine dynamische Auswahlmöglichkeit <strong>der</strong> Stimulationskanäle.<br />
Dies ermöglichen Matrixschalter-IC’s, die ein o<strong>der</strong> zwei Kanäle auf bis zu vier o<strong>der</strong><br />
acht an<strong>der</strong>e Kanäle verteilen (ADG728 / ADG729 bzw. AD 75019, Analog Devices).<br />
Mittels <strong>eines</strong> solchen Baust<strong>eines</strong> können 4 bis 16 analoge Stimulationskanäle beliebig<br />
auf 64 Elektroden verteilt werden. Die Auswahl <strong>der</strong> Stimulationskanäle erfolgt<br />
über einen seriellen Bus des Computers (z.B. Parallel-Port, USB, o<strong>der</strong> <strong>der</strong> Digitalausgang<br />
<strong>der</strong> AD-DA-Karte). Die Programmierung des Matrix-Schalter-Bausteins ist<br />
in Abbildung 6.1 dargestellt. Die 256 Schalter auf einem AD75019 Baustein werden<br />
seriell über einen Datenbus (DIN) bitweise programmiert, wobei jedes bit für einen<br />
Schalter im Matrix Schalter steht (bit=1 heißt Schalter an). Parallel zu den Daten<br />
gibt eine Taktleitung (SCLK) die Programmiergeschwindigkeit vor. Über eine<br />
Synchronisationsleitung (SYNC) wird <strong>der</strong> Programmierprozess initiiert.<br />
Abb. 6.1: Programmiersequenz des AD75019 Bausteins. Erklärung siehe Text. Abbildung<br />
aus Datenblatt AD75019, Analog Devices<br />
Die Bausteine sind auf einer 19”-Einschubplatine integriert und können beliebig<br />
erweitert werden. Auf <strong>der</strong> Platine sind 4 Bausteine mit jeweils 16×16-Kanälen integriert.<br />
Damit können bis zu 16 Kanäle auf 64 Elektroden verteilt werden. Durch<br />
1 Ein Auswahlkriterium besteht in <strong>der</strong> spontanen Aktivität einzelner Elektroden.
6. Anhang 68<br />
ein einfaches Hintereinan<strong>der</strong>schalten mehrerer 19”-Module können mehr Elektroden<br />
o<strong>der</strong> auch mehr Stimulationskanäle verknüpft werden.<br />
6.1.2 Platinenlayouts<br />
Es folgen auf den nächsten Seiten die Platinenlayouts zur Photoreproduktion.
6. Anhang 69
Temperatursteuerung<br />
Layout oben<br />
Layout unten<br />
6. Anhang 70
6. Anhang 71<br />
Heizspirale<br />
Heizspirale - oben<br />
Heizspirale - unten
6. Anhang 72<br />
Verstärkerstufe 1 - Übersicht
6. Anhang 73<br />
Verstärkerstufe 1 - oben
6. Anhang 74<br />
Verstärkerstufe 1 - unten
6. Anhang 75<br />
Verstärkerstufe 2+3 - Übersicht<br />
Verstärkerstufe 2+3 - oben<br />
Verstärkerstufe 2+3 - unten
6. Anhang 76<br />
Filter - Übersicht<br />
Filter - oben<br />
Filter - unten<br />
Filtermodule 1 - 3
6. Anhang 77<br />
Stimulation (Übersicht, oben, unten)<br />
Crosspoint Switch 16x64
Literaturverzeichnis<br />
Datenblatt: Ina2141, texas instruments.<br />
Datenblatt: Tlc074, texas instruments.<br />
Gary Banker und Kimberly Goslin. Culturing Nerve Cells. MIT Press, 2nd edition,<br />
1998.<br />
W. H. Baumann, M. Lehmann, A. Schwinde, R. Ehret, M. Brischwein, und B. Wolf.<br />
Microelectronic sensor system for microphysiological application on living cells.<br />
Sensors and Actuators B, 55:77–89, 1999.<br />
A. Blau, Ch. Ziegler, M. Heyer, F. Endres, G. Schwitzgebel, T. Matthies, T. Stieglitz,<br />
J.-U. Meyer, und W. Göpel. Characterization and optimization of microelectrode<br />
arrays for in-vivo nerve signal recording and stimulation. Biososensors and<br />
Bioelectronics, 12:883–892, 1997.<br />
Axel Blau. Modifikation und Charakterisierung von Mikroelektrodenstrukturen zur<br />
Optimierung <strong>der</strong> kapazitiven Kommunikation mit Nervenfasern. Diplomarbeit,<br />
Tübingen, 1995.<br />
Axel Blau. Bioelectronical Neuronal Networks. Dissertation, Tübingen, 1999.<br />
Volker Bucher, Markus Schubert, Dieter Kern, und Wilfried Nisch. Light-addressed<br />
sub-um electrodes for extracellular recording and stimulation of exitable cells.<br />
Microelectronic Engineering, 57-58:705–712, 2001.<br />
Neil A. Campbell. Biologie. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1. korrigierte<br />
auflage edition, 1998.<br />
I. Caucheteux-Silberzan, R.M. Williams, und W.W. Webb. Flourescence photoactivation<br />
by 2-photon excitation - kinetics of uncaging and 3-dimensional point<br />
diffusion measurements. Biophysical Journal, 64:A109, 1993.<br />
CNNS. Günter gross, cnns, http://www.cnns.org.<br />
M.A. Corner und G.J. Ramakers. Spontaneous bioelectricactivity as both dependent<br />
and independent variable in cortical maturation. chronic tetrodotoxin versus picrotoxin<br />
effects on spike-train patterns in developing rat neocortex neurons during<br />
long-term culture. Ann. N.Y. Acad. Sci., 627:349–353, 1991.
Literaturverzeichnis 79<br />
P. M. Dean und E. K. Matthews. Electrical activity in pancreatic islet cells. Nature,<br />
(219):389–390, 1968.<br />
Thomas B. DeMarse, Daniel A. Wagenaar, Axel W. Blau, und Steve M. Potter.<br />
The neurally controlled animat: Biological brains acting with simulated bodies.<br />
Autonomous Robots, 11:305–310, 2001.<br />
Kurt Diedrich. Elektronik - gar nicht schwer, volume Buch 5: Experimente mit<br />
Operationsverstärkern. 3. auflage edition, 2000.<br />
U. Egert, B. Schlosshauer, S. Fennrich, W. Nisch, M. Fejtl, T. Knott, T. Müller, und<br />
H. Hämmerle. A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on<br />
substrate-integrated multielectrode arrays. Brain Research Protocols, 2:229–242,<br />
1998.<br />
MD Eggers, DK Astolfi, S. Liu, HE Zeuli, SS Doeleman, R. McKay, TS Khuon,<br />
und DJ Ehrlich. Electronically wired petri dish: A microfabricated interface to<br />
the biological neuronal network. Journal of Vacuum Science and Technology, B8:<br />
1392–1398, 1990.<br />
Usama Fayyad, Gregory Piatetsky-Shapiro, und Padhraic Smyth. Knowledge discovery<br />
and data mining: Towards a unifying framework. Proceedings of 2nd Int<br />
Conf on Knowledge Discovery and Data Mining, 1996.<br />
Reiko Maki Fitzsimonds, Hong-jun Song, und Mu-ming Poo. Propagation of activitydependent<br />
synaptic depression in simple neural networks. Nature, 388:439–448,<br />
1997.<br />
Andre Folkers und Ulrich G. Hofmann. A multichannel data acquisition and analysis<br />
system based on off-the-shelf dsp boards.<br />
Peter Fromherz. Sheet conductor model of brain slices for stimulation and recording<br />
with planar electronic contacts. Eur Biophys J, 31:228–231, 2002.<br />
Peter Fromherz und Alfred Stett. Silicon-neuron junction: Capacitive stimulation of<br />
an individual neuron on a silicon chip. Phys. Rev. Letters, 75:1670–1673, 1995.<br />
G.W. Gross. Simultaneous single unit recording in vitro with a photoetched laser<br />
deinsulated gold multimicroelectrode surface. IEEE Transactions on Biomedical<br />
Engineering, 26:273–279, 1979.<br />
G.W. Gross, H.M.E. Azzazy, M-C Wu, und B.K. Rhoades. The use of neuronal<br />
networks on multielectrode arrays as biosensors. Biososensors and Bioelectronics,<br />
10:553–567, 1995.<br />
G.W. Gross, B.K. Rhoades, und J.M. Kowalski. Dynamics of burst patterns generated<br />
by monolayer networks in culture. In H.W. Bothe, M. Samii, und R. Eckmiller,<br />
editors, Neurobionics, pages 89–121. Elsevier, Amsterdam, 1993.
Literaturverzeichnis 80<br />
G.W. Gross, E. Rieske, G.W. Kreutzberg, und A. Meyer. A new fixed-array multimicroelectrode<br />
system designed for longterm monitoring of extracellular single<br />
unit neuronal activity in vitro. Neurosci. Lett., 6:101–105, 1977.<br />
G.W. Gross und F.U. Schwalm. A closed flow chamber for long-term multichannel<br />
recording and optical monitoring. J. Neurosci. Meth., 52:73–85, 1994.<br />
A. Habets, A. van Dongen, F. van Huizen, und M.A. Corner. Spontaneous neuronal<br />
firing patterns in fetal rat cortical networks during development in vitro: a<br />
quantitative analysis. Exp. Brain Res., 69:43–52, 1987.<br />
O. P. Hamill, A. Marty, E. Neher, B. Sakmann, und F. J. Sigworth. Improved<br />
patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cellfree<br />
membrane patches. Eur. J. Physiol., 391:85–100, 1981.<br />
Michael E. Hasselmo und James L. McClelland. Neural models of memory. Current<br />
Opinion in Neurobiology, 9:184–188, 1999.<br />
D. A. Henze, Z. Borhegyi, J. Csicsvari, A. Mamiya, K. D. Harris, und G. Buzsaki.<br />
Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in<br />
vivo. Am. Physiol. Soc., pages 390–400, 2000.<br />
Marc Oliver Heuschkel, Michael Fejtl, Mario Raggenbass, Daniel Bertrand, und Philippe<br />
Renaud. A three-dimensional multi-electrode array for multi-site stimulation<br />
and recording in acute brain slices. J. Neurosci. Meth., in press, 2001.<br />
H. Hämmerle, U. Egert, A. Mohr, und W. Nisch. Extracellular recording in neuronal<br />
networks with substrate integrated microelectrode arrays. Biososensors and<br />
Bioelectronics, 9:691–696, 1994.<br />
A. L. Hodgkin und A. F. Huxley. A quantitative description of membrane current<br />
and its application to conduction and excitation in nerve. J. Physiol, (117):500–<br />
544, 1952.<br />
Ulrich G. Hofmann, Erik De Schutter, Ken Yoshida, Marco de Curtis, Uwe Thomas,<br />
und Peter Norlin. On the design of multi-site microelectrodes for neuronal<br />
recordings. Proceedings of MICRO.tec, in press, 2000.<br />
Jörg Hüser, Peter Lipp, und Ernst Niggli. Confocal microscopic detection of<br />
potential-sensitive dyes used to reveal loss of voltage control during patch-clamp<br />
experiments. Eur J Physiol, 433:194–199, 1996.<br />
Y. Jimbo und A. Kawana. Electrical stimulation and recording from cultured neurons<br />
using a planar electrode array. Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 29:<br />
193–204, 1992.<br />
Peter W. Kalvas und Mitsuo Nakamura. Neural systems for behavioral activation<br />
and reward. Current Opinion in Neurobiology, 9:223–227, 1999.
Literaturverzeichnis 81<br />
Kyung Kim und Sung June Kim. Noise performance design of cmos preamplifier<br />
for the active semiconductor neural probe. IEEE Transactions on Biomedical<br />
Engineering, 47(8):1097–1105, 2000.<br />
Rainer Klinke und Stefan Silbernagl. Lehrbuch <strong>der</strong> Physiologie. 2. Auflage, 2000.<br />
M. Krause, S. Ingebrandt, D. Richter, M. Denyer, M. Scholl, C. Sprössler, und<br />
A. Offenhäusser. Extended gate electrode arrays for extracellular signal recordings.<br />
Sensors and Actuators B, 70:101–107, 2000.<br />
B. R. Land, R. A. Wyttenbach, und B. R. Johnson. Tools for physiology labs: An<br />
inexpensive high-performance amplifier and electrode for extracellular recording.<br />
J. Neurosci. Meth., 106:47–55, 2001.<br />
Toni Lindl. Zell- und Gewebekulturen. Spektrum, 4. auflage edition, 2000.<br />
MCS. Mcs - multichannel systems, mea<strong>60</strong> system,<br />
http://www.multichannelsystems.com.<br />
Markus Meister und Michael J. Berry II. The neural code of the retina. Neuron, 22:<br />
435–450, 1999.<br />
E. Neher und B. Sakmann. Single-channel currents recorded from membrane of<br />
denervated frog muscle fibers. Nature, 2<strong>60</strong>:799–802, 1976.<br />
Miguel A. L. Nicolelis. Actions from thoughts. Nature, 409:403–407, 2001.<br />
W. Nisch, J. Böck, U. Egert, H. Hämmerle, und A. Mohr. A thin film microelectrode<br />
array for monitoring extracellular neuronal activity in vitro. Biososensors and<br />
Bioelectronics, 9:737–741, 1994.<br />
J.L. Novak und B.C. Wheeler. Recording from the aplysia abdominal ganglion with<br />
a planar microelectrode array. IEEE Transactions on Biomedical Engineering,<br />
BME-33:196–202, 1986.<br />
S.M. O’Connor, J.D. Andreadis, K.M. Shaffer, W. Ma, J.J. Pancrazio, und D.A.<br />
Stenger. Immobilization of neural cells in three-dimensional matrices for biosensor<br />
applications. Biososensors and Bioelectronics, 14:871–881, 2000.<br />
A. Offenhäusser, C. Sprössler, M. Matsuzawa, und W. Knoll. Field-effect transistor<br />
array for monitoring electrical activity from mammalian neurons in culture.<br />
Biososensors and Bioelectronics, 12:819–826, 1997.<br />
Panasonic. Panasonic, med64 system, http://www.med64.com.<br />
J.J. Pancrazio, P.P. Bey Jr., D.S. Cuttino, J.K. Kusel, D.A. Borkhol<strong>der</strong>, K.M. Shaffer,<br />
G.T.A. Kovacs, und D.A. Stenger. Portable cell-based biosensor system for<br />
toxin detection. Sensors and Actuators, 13:971–979, 1998.
Literaturverzeichnis 82<br />
Myoung Kyu Park, Alexei V. Tepikin, und Ole H. Petersen. What can we learn<br />
about cell signalling by combining optical imagin and patch clamp techniques ?<br />
Eur J Physiol, 444:305–316, 2002.<br />
R. S. Pickard. Printed circuit microelectrodes. TINS, 2:259–261, 1979.<br />
Jerome Pine. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular<br />
microcircuit electrodes. J. Neurosci. Meth., 2:19–31, 1980.<br />
Jerome Pine. Microdevices for stimulating and recording from cultured neurons.<br />
Artificial Organs, pages 573–581, 1987.<br />
Steve M. Potter. Distributed processing in cultured neuronal networks. Progress in<br />
Brain Research, Advances in Neural Population Coding, 130, 2001.<br />
Steve M. Potter und Thomas B. DeMarse. A new approach to neural cell culture<br />
for long-term studies. J. Neurosci. Meth., 110:17–24, 2001.<br />
Wim Rutten, Jean-Marie Mouveroux, Jan Buitenweg, Ciska Heida, Teun Ruardij,<br />
Enrico Marani, und Egbert Lakke. Neuroelectronic interfacing with cultured multielectrode<br />
arrays toward a cultured probe. Proceedings of the IEEE, 89(7):1013–<br />
1029, 2001.<br />
Robert F. Schmidt, Gerhard Thews, und Florian Lang. Physiologie des Menschen.<br />
Springer, 28. Auflage, 2000.<br />
Carolin Schuhmacher. Kontrolle <strong>der</strong> Membranpotentialoszillation <strong>der</strong> pankreatischen<br />
beta-Zelle. Dissertation, Eberhard-Karls-Universität, 1997.<br />
Goded Shahaf und Shimon Marom. Learning in networks of cortical neurons. J.<br />
Neurosci., 21(22):8782–8788, 2001.<br />
S. Silbernagl und A. Despopoulos. Taschenatlas <strong>der</strong> Physiologie. Thieme, 4.Auflage,<br />
1991.<br />
Wolf Singer. Why use more than one electrode at a time ? Trends in Neurosciences,<br />
pages 12–17, December 2000.<br />
D.A. Stenger, G.W. Gross, E.W. Keefer, K.M. Shaffer, J.D. Andreadis, W. Ma, und<br />
J.J. Pancrazio. Detection of physiologically active compounds using cell-based<br />
biosensors. Trends in Biotechnology, 19:304–309, 2001.<br />
Alfred Stett, Wolfgang Barth, Stefan Weiss, Hugo Haemmerle, und Eberhart Zrenner.<br />
Electrical multisite stimulation of the isolated chicken retina. Vision Research,<br />
40:1785–1795, 2000.<br />
Takashi Tateno und Yasuhiko Jimbo. Activity-dependent enhancement in the reliability<br />
of correlated spike timings in cultured cortical neurons. Biological Cybernetics,<br />
80:45–55, 1999.
Literaturverzeichnis 83<br />
CA jr. Thomas, PA Springer, GE Loeb, Y Berwald-Netter, und CM Okun. A miniature<br />
microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells.<br />
Exp. Cell. Res., 74:61–66, 1972.<br />
U. Tieze und Ch. Schenk. Halbleiter-Schaltungstechnik. Springer Verlag, 9. aufl<br />
edition, 1989.<br />
Jian-Young Wu, YW Lam, CX Falk, LB Cohen, J Fang, L Loew, JC Prechtl, D Kleinfeld,<br />
und Y Tsau. Voltage-sensitive dyes for monitoring multineuronal activity in<br />
the intact central nervous system. Histochemical Journal, 30:169–187, 1998.<br />
Horst Wupper. Professionelle Schaltungstechnik mit Operationsverstärkern. Franzis,<br />
1994.<br />
Christiane Ziegler. Cell-based biosensors. Fresenius J Anal Chem, 366:552–559,<br />
2000.
Danksagung 84<br />
Danksagung<br />
Mein Dank gilt folgenden Menschen:<br />
• Frau Prof. Dr. Christane Ziegler für die Überlassung des interessanten Themas<br />
dieser Arbeit, die sehr guten Arbeitsbedingungen und die hervorragende<br />
Betreuung.<br />
• Juniorprof. Dr. Axel Blau für die Zweitkorrektur, die immer hilfreichen Diskussionen<br />
und <strong>der</strong> hervorragenden Betreuung. Ich danke auch für stets gute<br />
Ideen und <strong>der</strong> tollen Arbeitsatmosphäre.<br />
• Hartmut Stadler für die Programmierung des HP VEE Programms zur Steuerung<br />
des Netzwerkanalysators, für die vielen Diskussionen und Auflockerung<br />
<strong>der</strong> langen Nächte im Labor.<br />
• Alexan<strong>der</strong> Vidic für Rat und Tat in Werkstatt, stets einer guten Idee für Elektronik<br />
und Computer und für die anregenden Gespräche in allen Lebenslagen,<br />
inbeson<strong>der</strong>e in den langen Labornächten.<br />
• Matthias Mondon für abwechslungsreiche Diskussionen, immer guter Laune<br />
und für die Einführung in AFM und die Kräuterkunde.<br />
• Dirk Then für die Arbeitsgruppenbegrünung.<br />
• Der lustigen Truppe aus Bau 46 für nervenaufreibende Pausen. Gretchen, Waldumgang,<br />
Otgorma und Dr. No strike back.<br />
• David Prantl für immer gute Ideen, Netzwerkangelegenheiten, Motivation und<br />
gute Laune.<br />
• Manfred Strack für die technische Unterstützung in allen Bereichen.<br />
• Elektronikwerkstatt für wertvolle Elektroniktips (Dipl.-Ing. Henno Heintz), für<br />
die schnelle und zuverlässige Erstellung <strong>der</strong> Leiterplatinen (Manfred Schlägel)<br />
und die Bestückung <strong>der</strong> SMD-Platinen. Der Metallwerkstatt für die Herstellung<br />
des Gehäuses.<br />
• Silvia Christoffel für die Hilfe bei Planung von Workshops und Seminaren.<br />
• Der gesamten AG Ziegler für die gute Atmosphäre und immer hilfreichen Diskussionen.<br />
• Den Firmen Analog Devices, Texas Instruments, KWHM, Shin Etsu Polymers,<br />
Fujipoly, Maxim-IC und Molex für kostenlose Produktproben<br />
• Nicole Schmidt für die Präparation <strong>der</strong> Zellen, das Durchlesen des Skriptes<br />
und moralische Unterstützung.
Danksagung 85<br />
• Meinen Eltern für die breite Unterstützung (geistig, moralisch, finanziell), ohne<br />
die mein Studium nicht möglich gewesen wäre. Die vielen Kerzen haben doch<br />
was genutzt :-)<br />
• Allen nicht genannten Personen, die mich in meinem Studium und meiner<br />
Arbeit unterstützt haben.