Prinzip der Herstellung von monoklonalen AntikÃ¶rpern - Pharmazie

• Transgene Tiere 

Übersicht über die Inhalte der Vorlesung 

„Grundzüge der Biotechnologie und 

Molekularbiologie für Pharmazeuten“ 

• Einführung: Grundlegende Arbeitstechniken bei der DNA-Klonierung 

• Biotechnologie der Pflanzen 

• Biotechnologische Gewinnung von Antibiotika 

• Biotransformation (mikrobielle Stoffumwandlung) 

• DNA-Sequenzierung und -Synthese 

• Funktionelle Charakterisierung von Genen 

• Gentherapie 

• Molekularbiologische Methoden in der Wirkstoffentwicklung 

• Monoklonale Antikörper 

• Pharmazeutische relevante rekombinante Proteine 

• Polymerase-Kettenreaktion

Empfohlene Literatur 

Dingermann, Theodor: Gentechnik, Biotechnik. 

Unter Mitarb. v. Ilse Zündorf. 1. Aufl. 1999. 

ISBN: 3-8047-1597-4; WISSENSCHAFTLICHE VERLAGSGESELLSCHAFT 

85.90 EUR 

Kreis, Wolfgang; Baron, Diethard; Stoll, Günther: Biotechnologie der Arzneistoffe. 

Grundlagen und Anwendungen. Wissen & Praxis. 1. Aufl. 2001. 

ISBN: 3-7692-2310-1; DEUTSCHER APOTHEKER VERLAG 

50.10 EUR 

Kayser, Oliver; Müller, Rainer H.: Pharmazeutische Biotechnologie. 

Ein Kompendium für Forschung und Praxis. 1. Aufl. 2000. 

ISBN: 3-8047-1768-3; WISSENSCHAFTLICHE VERLAGSGESELLSCHAFT 

36.80 EUR 

Kayser, Oliver: Grundwissen Pharmazeutische Biotechnologie. 

1. Aufl. 2002. 

ISBN: 3-5190-3553-7; TEUBNER 

29.90 EUR

Empfohlene Literatur 

Glick, Bernard R.; Pasternak, Jack J.: Molekulare Biotechnologie. 

(Spektrum Lehrbuch). 1. Aufl. 1995. 

ISBN: 3-86025-378-6; SPEKTRUM AKADEMISCHER VERLAG 

24.95 EUR 

alternativ: Molecular Biotechnology: Principles and Applications 

of Recombinant DNA. 3 rd edition, 2003. 

ISBN: 1-55581-269-4; ASM PRESS 

ca. 50,00 EUR 

Brown, Terence A.: Gentechnologie für Einsteiger. 

(Spektrum Lehrbuch). 3. Aufl. 2002. 

ISBN: 3-8274-1302-8; SPEKTRUM AKADEMISCHER VERLAG 

32.00 EUR 

Schmid, Rolf D.: Taschenatlas Biotechnologie und Gentechnik. 

1. Aufl. 2001. 

ISBN: 3-5273-0865-2; WILEY-VCH 

37.90 EUR

Definitionen 

iotechnologie 

rste Verwendung des Begriffes bereits 1917: 

alle Arbeitsgänge, bei denen aus Rohstoffen mit Unterstützung lebender Organismen 

Konsumartikel erzeugt werden 

oderne Definition (DECHEMA, 1976): 

Einsatz biologischer Prozesse im Rahmen technischer Verfahren und industrieller 

Produktion 

eine anwendungsorientierte Wissenschaft der Mikrobiologie und Biochemie in enger 

Verbindung mit der technischen Chemie und der Verfahrenstechnik 

behandelt Reaktionen biologischer Art, die entweder mit lebenden Zellen 

(Mikroorganismenzellen, pflanzlichen und tierischen Zellen bzw. Geweben) oder mit 

Enzymen aus Zellen durchgeführt werden 

eingeschlossen ist die Gewinnung von Biomasse aus den genannten Organismen 

oder Organismenteilen

Definitionen 

entechnologie 

eränderung des Erbguts mit molekularbiologischen Methoden, um neue Produkte 

u erhalten oder die Qualität und Ausbeute eines Produktes zu verbessern 

lonen 

Herstellen genetisch identischer Organismen 

natürliche Klone sind z. B. eineiige Mehrlinge oder vegetativ vermehrte 

Pflanzenpopulationen 

können auch durch Aufspalten der ersten Zellen eines sich entwickelnden 

Organismus in vitro erreicht werden 

modernes Verfahren: genetisches Material einer befruchteten Eizelle (Zygote) wird 

durch das genetische Material einer ausdifferenzierten somatischen Zelle ersetzt 

lonieren 

rundlegendes Verfahren der Molekularbiologie, mit dessen Hilfe fremde genetische 

nformation in eine Zelle übertragen wird und von dieser an ihre Nachkommen weiter 

egeben wird

Einsatzgebiete der Biotechnologie

Geschichte der (molekularen) Biotechnologie 

17: Karl Ereky prägt den Ausdruck „Biotechnologie“ 

43: Penicillin wird im industriellen Maßstab produziert. 

44: Avery, McLeod und McCarty zeigen, daß die DNA die Trägerin der 

Erbinformation ist. 

53: Watson und Crick bestimmen die Doppelhelix-Struktur der DNA. 

66: Die Entschlüsselung des genetischen Codes gilt als abgeschlossen. 

69: Jonathan Beckwith gelingt erstmals die Isolierung eines Gens. 

70: Entdeckung der Restriktionsendonucleasen 

73: Boyer und Cohen führen die rekombinierte DNA-Technik ein. 

75: Im kalifornischen Asilomar findet erstmals eine Konferenz über Sicherheitsaspekte 

in der Gentechnik statt. 

75: Köhler und Milstein beschreiben die Produktion von monoklonalen Antikörpern. 

76: In San Francisco wird das erste Biotechnologie-Unternehmen der Welt gegründe 

die Firma Genentech. 

77: Gilbert und Sanger entwickeln Methoden zur DNA-Sequenzierung.

Geschichte der (molekularen) Biotechnologie 

78: Genentech produziert Humaninsulin in Escherichia coli (Zulassung 1982). 

81: erste kommerzielle automatische DNA-Sequenziermaschine 

83: Verwendung von Ti-Plasmiden zur Transformation von Pflanzen 

88: erstes Patent für ein gentechnisch verändertes Säugetier - eine transgene Maus 

88: Publikation der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 

90: In Deutschland wird das Gesetz zur Regelung der Gentechnik verabschiedet. 

94: In den USA kommen gentechnisch veränderte Tomaten auf den Markt. 

95: Das "Institute for Genomic Research" veröffentlicht die erste komplette 

Genomsequenz eines Bakteriums. 

96: Genom von Saccharomyces cerevisiae entschlüsselt 

97: Klonen eines erwachsenen Säugetieres - das Klonschaf Dolly 

98: embryonale Stammzellen werden zur Differenzierung in spezialisierten 

Gewebezellen angeregt 

00: Genome von Drosophila und Arabidopsis entschlüsselt 

01: Humangenom entschlüsselt

Probleme und Bedenken im Zusammenhang 

mit der molekularen Biotechnologie 

• Können gentechnisch veränderte Organismen andere Organismen oder 

die Umwelt schädigen? 

• Wird die Herstellung und der Einsatz gentechnisch veränderter Organismen 

die natürliche genetische Vielfalt beeinträchtigen? 

• In wie weit sollte die Technik auch beim Menschen angewendet werden? 

• Welche Auswirkungen haben diagnostische Verfahren auf das private 

oder berufliche Leben des Einzelnen? 

• Soll die Patentierung von Organismen, die durch Kombination von natürlich 

vorkommenden Genen mit Genen eines Empfängerorganismus erzeugt 

wurden, erlaubt sein? 

• Wird die finanzielle Unterstützung der molekularen Biotechnologie die 

Entwicklung anderer wichtiger Technologien behindern?

Probleme und Bedenken im Zusammenhang 

mit der molekularen Biotechnologie 

• Wird die Betonung des kommerziellen Erfolgs bedeuten, daß die Vorteile 

der molekularen Biotechnologie nur Wohlhabenden zugute kommen? 

• Wird der Einsatz der molekularen Biotechnologie in der Landwirtschaft 

traditionelle Agrartechniken ersetzen? 

• Werden medizinische Therapien, die auf der molekularen Biotechnologie 

beruhen, herkömmliche gleich wirksame Behandlungsmethoden ersetzen? 

• Wird das Streben nach Patenten den freien Ideenaustausch zwischen 

Wissenschaftlern hemmen? 

• Welche Möglichkeiten gibt es, die mißbräuchliche Anwendung der 

molekularen Biotechnologie zu kontrollieren bzw. zu verhindern?

Alexis Rockman, „The Farm“

Prinzip der DNA-Klonierung 

1) Ein DNA-Fragment, das das zu klonierende Gen enthält, wird in 

ein ringförmiges DNA-Molekül – den Vektor – eingefügt; es 

entsteht ein rekombiniertes DNA-Molekül 

2) Der Vektor wirkt als Vehikel und transportiert das Gen in eine 

Wirtszelle 

3) In der Wirtszelle vermehrt sich der Vektor und mit ihm das 

eingebaute Gen 

4) Bei der Teilung der Wirtszelle werden Kopien des rekombinierten 

DNA-Moleküls an die Tochterzellen weitergegeben 

5) Durch viele Zellteilungen entsteht eine Kolonie, ein Klon 

gleichartiger Wirtszellen, die alle das rekombinierte DNA-Molekül 

in einer oder mehreren Kopien enthalten

Grundlegende Schritte bei der DNA-Klonierung






Wirtszelle 














Wirtszelle 










Grundprinzip des Klonierens von DNA

DNA-Amplifikation durch PCR

Prinzip der Produktion tierischer Proteine in Bakterien

Technischer Ablauf der DNA-Klonierung 

• Präparation reiner DNA 

• Schneiden von DNA-Molekülen 

• Größenbestimmung von DNA-Fragmenten 

• Verbinden von DNA-Molekülen 

• Einschleusen von DNA in die Wirtszellen 

• Identifizierung von Zellen, die rekombinierte 

DNA-Moleküle enthalten









Grundlegende Schritte bei der Präparation von DNA aus Bakterien

Präparation von DNA aus Bakterienzellen

Gewinnung von DNA durch Phenolextraktion

Ethanol-Präzipitation zur Gewinnung von DNA

















Durch Nucleasen katalysierte Reaktionen

Durch Nucleasen katalysierte Reaktionen

Schneiden von DNA mit Restriktionsendonukleasen

Schneiden von DNA mit Restriktionsendonukleasen

Einsatz von Restriktionsendonukleasen bei der DNA-Klonierung

Einsatz von Restriktionsendonukleasen bei der DNA-Klonierung

Biologische Funktion von Restriktionsendonukleasen

Biologische Funktion von Restriktionsendonukleasen

















Prinzip der Gelelektrophorese

Prinzip der Gelelektrophorese

Sichtbarmachen von DNA-Fragmenten bei der Gelelektrophorese

Mechanismus der DNA-Färbung mit Ethidiumbromid 

cave, Ethidiumbromid 

ist cancerogen!

Größenbestimmung von DNA-Fragmenten durch Gelelektrophorese

Größenbestimmung von DNA-Fragmenten durch Gelelektrophorese 

theoretisch: 

D = a - b (log M) 

D: Wanderungsstrecke 

M: Molekulargewicht 

a, b: Konstanten (von 

Bedingungen bei der 

Elektrophorese abhängig)

















Durch DNA-Ligasen katalysierte Reaktionen

Einsatz von DNA-Ligasen bei der Klonierung

Ligation von DNA-Fragmenten durch DNA-Ligasen

Funktion von Linkern bei der Ligation von glatten Enden

Reaktionen von DNA-Polymerasen

Reaktionen von DNA-Polymerasen

















Plasmide

Vermehrung von Plasmiden

Vermehrung von Plasmiden

Plasmidamplifikation durch Chloramphenicol

Der Klonierungsvektor pBR322

Aufbau von Phagen

Lebenszyklus von lytischen Phagen

Lysogener Infektionszyklus des λ-Phagen

















Das Problem der Selektion


Resistenz gegen Antibiotika als selektierbarer Marker


Der Klonierungsvektor pBR322

Antibiotikaresistenz als selektierbarer Marker: Beispiel pBR322

Prinzip der Replikaplattierung

Der Vektor pUC8: Ein Plasmid für die Lac-Selektion

Das Prinzip der Lac-Selektion

Das Prinzip der Lac-Selektion

Mechanismus der Farbreaktion mit X-Gal 

HO 

OH CH2 OH 

O 

OH 

Lactose 

OH 

HO 

OH 

O 

O 

HOH 2 C 

β-Galactosidase 

HO 

OH CH2 OH 

O 

OH 

S 

H 3 C 

CH 3 

HO 

OH CH2 OH 

O 

OH 

OH 

+ 

HOH 2 C 

HO 

HO 

O 

OH 

OH 

Isopropylthiogalactosid 

(IPTG) 

Induktor des lac-Operons 

β-D-Galactose β-D-Glucose 

Cl 

OH CH2 OH 

O 

OH 

O 

Cl 

Br 

β-Galactosidase 

Br 

Cl 

OH 

Luft 

Cl 

O 

O 

N 

H 

N 

H 

N 

H 

Br 

NH 

5-Brom-4-chlor-3-indolyl- 

5-Brom-4-chlorindoxyl 

β-D-galactopyranosid 

(X-Gal) 

5,5'-Dibrom-4,4'- 

dichlorindigo

Praktikumsversuch Restriktionsverdau 

bzw. Restriktionskartierung

Auswahl geeigneter Restriktionsendonucleasen 

anhand von Restriktionskarten

Auswahl geeigneter Restriktionsendonucleasen 

anhand von Restriktionskarten

Ablauf der Restriktionsspaltung im Labor

Sichtbarmachen von DNA-Fragmenten bei der Gelelektrophorese

Größenbestimmung von DNA-Fragmenten durch Gelelektrophorese

Restriktionsspaltung der λ-DNA

Restriktionsspaltung der λ-DNA

Beispiel für eine Restriktionskartierung




Prinzip der Produktion tierischer Proteine in Bakterien

Probleme bei der funktionellen Klonierung in E. coli 

• Gen muß unter die Kontrolle eines starken Promotors gestellt werden 

• die Transkription muß ebenfalls kontrolliert beendet werden 

• eine effiziente Translation muß sichergestellt sein 

‣ Einbinden des Gens in bakterielle Kontrollsequenzen 

• Bakterien neigen besonders bei Überproduktion dazu, das 

synthetisierte Protein in Einschlußkörperchen abzulagern (dabei wird 

das Protein meist denaturiert) 

• zur Erleichterung der Reinigung ist es wünschenswert, eine Sekretion 

des Proteins zu gewährleisten 

‣ Einbau von Signalpeptiden


• Prokaryonten können meist keine korrekte Faltung der Proteine zur 

Ausbildung von Disulfidbrücken gewährleisten (⇒ meist besser in Hefe) 

• Prokaryonten sind nicht in der Lage, posttranslationale Modifikationen 

durchzuführen, z. B. das Anhängen von Zuckerketten (⇒ meist besser in Hefe, 

oft dort aber geringfügig anderes Glykosylierungsmuster) 

• die Präferenz für bestimmte Codons für eine Aminosäure ist artspezifisch 

‣ Codon-Optimierung, oft durch Totalsynthese des Gens) 

• eine konstitutive Proteinsynthese führt zu einem langsameren Wachstum und 

damit zu einem Selektionsnachteil gegenüber nichttransformierten Bakterien 

• wünschenswert ist das gezielte Anschalten der Proteinsynthese in einer 

bestimmten Wachstumsphase 

‣ Einbau des Gens in regulierbare Operons

Grundlagen der Expressionsklonierung

Grundlagen der Expressionsklonierung 

• soll ein eukaryontisches Gen in einem Bakterium funktionell exprimiert 

werden, so muß es mit einem bakteriellen Promotor sowie einem 

Transkriptionsterminator kombiniert werden 

• evtl. kann auch eine Signalsequenz angehängt werden, die die 

Sekretion des rekombinanten Proteins aus der Zelle veranlaßt

• Beispiel: Repressor-Proteine 

Prinzip von Kontrollelementen der Transkription 

cis-wirksame Kontrollelemente: 

• auf demselben Gen in relativ enger räumlicher Nachbarschaft 

• Beispiele: Promotoren, Transkriptionsterminatoren 

trans-wirksame Kontrollelemente: 

• eigenständige Moleküle, die an DNA-Zielsequenzen binden 

• genetische Information befindet sich an anderer Stelle im Genom

• Position -10 wird auch als TATA-Box bezeichnet 

Konsensussequenzen von Promotoren in E. coli 

• Promotoren befinden sich immer upstream, d.h. vor dem Gen 

• signifikante Übereinstimmung aller Promotoren in den Positionen 

-10 und -35 (Konsensussequenzen) 

• Transkription beginnt an Position +1

Termination der Transkription in E. coli 

• Termination erfolgt durch DNA- Sequenz, die nach Transkription auf 

der RNA eine Haarnadelstruktur ausbildet (Palindrom) 

• RNA-Polymerase fällt vom transkribierten Gen ab

Regulation der Translation bei E. coli 

• konservierte Sequenz („Shine-Dalgarno- 

Sequenz“) der mRNA ist komplementär 

zu Abschnitt der 16S-rRNA und initiiert 

die Translation 

• genauer Abstand zum ersten translatierten 

Codon ist wichtig

Das Operon-Modell 

Operon: transkribierter Bereich, der von Promotor und Terminationselement 

terminiert wird 

monocistronisches Operon: 

nur ein Gen bzw. Genprodukt

Das Operon-Modell 

polycistronisches Operon: 

eine mRNA für mehrere funktionell zusammenhängende Gene, von denen 

jedes einen eigenen Startpunkt für die Translation besitzt

Bedeutung von induzierbaren Promotoren 

Prinzip: 

das Fremdgen wird unter die Kontrolle 

eines induzierbaren Promotors 

gestellt (≡ dahinter kloniert) 

Vorteil: 

zu einem geeigneten Zeitpunkt kann 

von außen die Transkription und 

damit der Beginn der Proteinsynthese 

gestartet werden

Aufbau von Kassettenvektoren 


gebrauchsfertige Vektoren erlauben es, ein Fremdgen gezielt zwischen 

Kontrollelemente, die auf den vorgesehen Wirt abgestimmt sind, zu klonieren

Regulation des lac-Operons 

klassischer Fall eines Operons: 

A) bei Anwesenheit von Glucose blockiert ein Repressor die 

Transkription, indem er unterhalb des Promotors an die DNA bindet 

Sinn: sind im Medium sowohl Glucose als auch Lactose vorhanden, wird 

erstere von E. coli bevorzugt verwertet

Regulation des lac-Operons 

B) Lactose (bzw. ein anderer Induktor) führt zur Bindung an den 

Repressor, dieser wird vom Operon abgelöst und somit wird die 

Transkription ermöglicht

Induktoren des lac-Operons

Palindromstruktur des lac-Operators 

Das lac-Operon wird sowohl positiv als auch 

negativ reguliert: 

• bei Anwesenheit von Glucose bindet der 

(konstitutiv gebildete) lac-Repressor an das 

lac-Operon und stabilisiert die Haarnadelstruktur 

⇒ keine Transkription 

• ein Mangel an Glucose führt zu einem Anstieg 

an cAMP; dieses bindet an CRP 

⇒ der cAMP-CRP-Komplex initiiert die Transkription

Katabolit-Aktivierung des lac-Operons 

Zustand bei Anwesenheit von Glucose, Fehlen von Lactose 

⇒ die maximale Transkription wird nur erreicht, wenn zum einen Lactose als 

Kohlenstoffquelle vorhanden ist (Aufheben der Bindung des lac-Repressors), 

zum anderen die Glucose-Vorräte aufgebraucht sind

Katabolit-Aktivierung des lac-Operons 

• ein Mangel an Glucose führt zu einem Anstieg an cAMP; dieses bindet an CRP 

(cAMP-Rezeptorprotein) 

• der cAMP-CRP-Komplex bindet oberhalb des lac-Promotors, wodurch der 

Repressor seine Konformation ändert, abdiffundiert und die Bindungsstelle für 

die RNA-Polymerase freigibt

Regulation des trp-Operons 

Endprodukthemmung der Tryptophanbiosynthese: 

• vorhandenes Tryptophan bildet mit einem spezifisches Repressorprotein 

einen Komplex, der den trp-Promotor für die RNA-Polymerase blockiert 

• erst ein Mangel an Tryptophan führt zur Transkription des Operons

Regulation des trp-Operons 

Mechanismus der Induktion des trp-Promotors: 

• Substratanaloga verdrängen Tryptophan aus dem Komplex mit dem Repressor

Temperatur-Steuerung des pL-Promotors des λ-Phagen 

permissive 

Temperatur 

nicht-permissive 

Temperatur 

A) temperatursensitive Mutante des cI-Repressors ist nur bei 28 °C aktiv 

B) bei 42 °C wird cI-Repressor inaktiviert und gibt den Promotor frei 

⇒ Transkription kann durch die Temperatur der Bakterienkultur gesteuert werden

Steuerung der Transkription durch den T7-Promotor 


• Fremdgen steht unter Kontrolle des Promotors des Phagen T7 

• RNA-Polymerase von E. coli kann nicht an diesen Promotor binden 

• erst eine Infektion mit dem T7-Phagen führt zu einer Transkription 

⇒ die Transkription des Fremdgens läßt sich so zu 100% unterdrücken


• Gen muß unter die Kontrolle eines starken Promotors gestellt werden 

• die Transkription muß ebenfalls kontrolliert beendet werden 

• eine effiziente Translation muß sichergestellt sein 

‣ Einbinden des Gens in bakterielle Kontrollsequenzen 

• Bakterien neigen besonders bei Überproduktion dazu, das 

synthetisierte Protein in Einschlußkörperchen abzulagern (dabei wird 

das Protein meist denaturiert) 

• zur Erleichterung der Reinigung ist es wünschenswert, eine Sekretion 

des Proteins zu gewährleisten 

‣ Einbau von Signalpeptiden

Intrazelluläre Produkt-Akkumulation vs. Sekretion 

oft irreversible Denaturierung 

keine Denaturierung, leichtere Reinigung

Fusionssysteme zur effizienten Produktreinigung 


• an das Fremdgen wird ein Gen für ein weiteres 

Protein angehängt (z. B. β-Galactosidase oder 

Chloramphenicol-Acetyltransferase) 

• das Produkt wird über eine Affinitätssäule mit 

immobilisierten Antikörpern gegen das 

zusätzliche Protein aufgereinigt 

• anschließend wird das Fusionsprotein 

chemisch oder enzymatisch gespalten 

• analog: „his-tag“, hier wird ein Polyhistidin- 

Peptid angehängt und dieses über eine 

Metallchelataffinitätssäule gereinigt

Stabilisierung plasmidhaltiger Zellen 

Problem: 

• Plasmide stellen für Bakterienzellen 

zusätzliche DNA dar, die repliziert 

werden muß (Stoffwechselbelastung) 

• dies verschafft plasmidhaltigen 

Bakterien einen Selektionsnachteil 

gegenüber solchen ohne Plasmide 

• es besteht die Tendenz, die Plasmide 

und damit das Fremdgen abzustoßen 

• Lösung: Selektionsbedingungen müsse 

auch während der Fermentation 

aufrecht erhalten werden (z. B. 

Antibiotika- oder Auxotrophie-Marker)


• Prokaryonten können meist keine korrekte Faltung der Proteine zur 

Ausbildung von Disulfidbrücken gewährleisten (⇒ meist besser in Hefe) 

• Prokaryonten sind nicht in der Lage, posttranslationale Modifikationen 

durchzuführen, z. B. das Anhängen von Zuckerketten (⇒ meist besser in Hefe, 

oft dort aber geringfügig anderes Glykosylierungsmuster) 

• die Präferenz für bestimmte Codons für eine Aminosäure ist artspezifisch 

‣ Codon-Optimierung, oft durch Totalsynthese des Gens) 

• eine konstitutive Proteinsynthese führt zu einem langsameren Wachstum und 

damit zu einem Selektionsnachteil gegenüber nichttransformierten Bakterien 

• wünschenswert ist das gezielte Anschalten der Proteinsynthese in einer 

bestimmten Wachstumsphase 

‣ Einbau des Gens in regulierbare Operons

Der Begriff des „offenen Leserahmens“ 

ORF (open reading frame)

Computersuche nach potentiellen Genen 


• ein Gen beginnt mit einem Startcodon und endet mit einem Stopcodon (5‘ → 3‘) 

• dazwischen muß ein hinreichend langer codierender Abschnitt liegen 

• in einer bekannten DNA-Sequenz prüft der Computer alle 3 Leserahmen auf 

beiden DNA-Strängen (= 6 Möglichkeiten!) auf DNA-Abschnitte, die die

Prinzip der PCR (polymerase chain reaction) 

in Anwesenheit eines Primers ( mit freiem 3‘-OH-Ende) 

und Nucleotiden (dNTPs) verlängert eine (hitzestabile) 

DNA-Polymerase einzelsträngige DNA (ssDNA, 

“Matrize”) zum Doppelstrang (exponentieller Verlauf)

Prinzip der PCR (polymerase chain reaction))

Schematische Darstellung der PCR




Zunahme der verschiedenen PCR-Fragmente 

DNA-Matrize 

konstant 

„lange“ Fragmente 

lineare Zunahme 

„kurze“ Fragmente (Amplimere, PCR-Produkte) 

exponentielle 

Zunahme

Zunahme der verschiedenen PCR-Fragmente 

theoretische Zahl der Produkte jeweils am Ende des Zyklus 

1 2 3 4 5 30 n allgemein 

Matrize 2 2 2 2 2 2 2 x 

lange 

Fragmente 

2 4 6 8 10 60 2n xn 

Aplimere 0 2 8 22 52 ca. 2•10 9 2 n+1 - 2n - 2 x(2 n - n - 1)

Temperatur-Zeit-Profil der PCR 

• typischerweise 

finden 30 – 35 

Zyklen statt 

• theoretisch 

entstehen aus 

einem einzigen 

DNA-Molekül 

10 12 Kopien! 

• Zeitbedarf in 

etwa 2 – 3 h

Prinzipieller Ablauf der PCR 

erhöhte Temperatur 

bedingt Stringenz der 

Basenpaarung 

zwischen Matrize und 

Primern 

hitzestabile 

DNA-Polymerase 

aus Thermus aquaticus

Prinzipieller Ablauf der PCR

Anforderungen an die Primer 

• keine Haarnadelstrukturen 

• keine Dimer-Bildung (weder mit sich selbst, noch mit dem 2. Primer) 

• möglichst keine “ungewöhnlichen” Basenabfolgen wie poly-A- oder

Anforderungen an die Primer 

• mindestens 17 Nukleotide lang (meist 17 – 28 nt) 

• ausgeglichener G/C- zu A/T-Gehalt 

• Schmelztemperatur zwischen 55 und 80 °C 

• möglichst gleiche Schmelztemperatur für beide Primer 

‣ heutzutage unterstützen Computerprogramme die Auswahl 

geeigneter Primer 

‣ Primer beliebiger Sequenz (bis ca. 30 nt) können bei Spezialfirmen 

bestellt werden

Auswahl geeigneter Primer 

• Beispiel: Amplifizierung des menschlichen α 1 -Globingens 

• flankierende Abschnitte müssen bekannt sein 

• auch möglich: Suche nach homologen Genen (Genfamilien) durch

Auswahl geeigneter Primer 

Primer mit 8 nt : (4 8 ) 

bindet statistisch alle 65536 bp, 

d. h. 46000 mal im 

menschlichen 

Genom (300 000 000 bp) 

Primer mit 17 nt: (4 17 ) 

bindet alle 17 179 869 184 bp, 

d. h. nur einmal im 

menschlichen Genom (falls 

Bindungsstelle vorhanden)

Einfluß der Temperatur auf die PCR 

⇒ geringe oder keine Reaktionsausbeute


⇒ unspezifische Amplifikation „falscher“ DNA-Abschnitte


⇒ Kompromiß zwischen Ausbeute und Stringenz 

technische Hilfsmittel: Computerberechnung der Schmelztemperatur 

Temperatur-Gradienten-Thermocycler

Berechnung der Schmelztemperatur 

grobe Abschätzung der Schmelztemperatur: 

T m ≈ (4 x [G+C] + 2 x [A+T]) °C 

Beispiel:

Vergleich der herkömmlichen mit der auf PCR 

basierenden Methode zur DNA-Sequenzierung

Probleme bei der PCR 

• in allererster Linie Kontamination, z. B. durch vorherige Proben! 

• daneben falsche Wahl der Annealing-Temperatur

Probleme bei der PCR 

• Ausbeute läßt mit zunehmender Zahl der Zyklen nach 

(Verbrauch der Nukleotide, Denaturierung der Taq-Polymerase)

Klonieren von PCR-Produkten 

) Erzeugen von klebrigen Enden durch Primer mit Restriktionsschnittstellen 

(angehängt durch 

Taq-Polymerase)

Klonieren von PCR-Produkten 

b) Verwenden von Primern mit zusätzlicher Restriktionsschnittstelle 

am verlängerten 5‘-Ende

Problematik des Klonierens von PCR-Produkten 

• Taq-Polymerase besitzt relativ hohe Fehlerrate (1 nt pro 9000 nt) 

• nach 30 Zyklen liegt - statistisch verteilt - alle 300 bp ein Fehler vor

Problematik des Klonierens von PCR-Produkten 

• Fehler fallen bei direkter Sequenzierung der PCR-Produkte nicht ins 

Gewicht, da sie statistisch verteilt vorliegen 

⇒ bei der Klonierung wird jedoch jeweils ein einzelnes fehlerhaftes 

PCR-Produkt vermehrt!

Nested-PCR

Prinzip der RT-PCR 

RNA wird zunächst in cDNA umgeschrieben (durch Reverse 

Transkriptase oder Thermus thermophilus-Polymerase)

Prinzip der RT-PCR 

generell schlechtere Gesamteffizienz als normale PCR 

selbst unter optimalen Bedingungen werden nur ca. 10 – 30 % 

der RNA umgeschrieben

Reinigung von Einzelstrang-DNA

Reinigung von Einzelstrang-DNA

Typischer Verlauf der PCR 

Quantitative PCR 

theoretische Ausbeute: N = N 0 • 2 n 

in der Praxis: N = N 0 • (1 + E) n 

E (bei optimal eingestellter PCR): 0.8 – 0.9


zunächst verwendete Methoden 

a) limiting dilution 

• Referenzstandard bekannter Konzentration wird mehrfach 

verdünnt und amplifiziert 

• Grenzkonzentration, die ein nachweisbares Amplifikat ergibt 

• Probe: ebenfalls mehrfache Verdünnungen 

• nur semiquantitative Aussagen möglich 

b) Externe Eichkurve 

• z. B. HIV-Zellinien mit bekannter Anzahl proviraler Genome 

• fehlende interne Überwachung der Reaktion: bereits bei 

geringer Inhibition wird zu niedrige Konzentration ermittelt


Intern kontrollierte und standardisierte Amplifikationsreaktionen 

c) interner endogener Standard 

• Standard: endogene Sequenzen des Genoms (oft β-Globin-Gene) 

• Multiplex-PCR mit 2 Primerpaaren (eines für nachzuweisende DNA, eines 

für β-Globin-Gen-DNA) 

• Verhältnis der beiden Signale erlaubt Aussagen über Menge der zu 

bestimmenden DNA (Menge der β-Globin-Gene ist bekannt) 

• Erfassung von Inhibitoren möglich, solange diese nicht sequenzspezifisch 

sind und beide PCRs gleich beeinflussen

d) kompetitive (RT)-PCR 


• Zugabe eines artifiziellen klonierten Standards bekannter 

Konzentration 

• bindet diesselben Primer wie die eigentliche Zielsequenz (“Mimic- 

Fragment”, im Idealfall auch von ähnlicher Größe)

d) kompetitive (RT)-PCR 


• Zugabe von zunehmender Menge an RNA-Mimic-Fragment zu 

Aliquots der Probe 

• Konkurrenz beider Targets um die Primer bei der PCR

Prinzip der Real-Time-PCR 

• erlaubt eine quantitative Echtzeitanalyse der PCR über die Messung 

von laserinduzierten Fluoreszenzsignalen 

•.neben den spezifischen Primern wird eine sequenzspezifische 

Hybridisierungssonde zugegeben, die am 3'-Ende mit einem 

Quencherfarbstoff und am 5'-Ende mit einem fluoreszierenden 

Reporterfarbstoff markiert ist 

•.die intakte Sonde fluoresziert nach Anregung nicht, da die Fluoreszenz- 

Emission des Reporterfarbstoffs durch die räumliche Nähe zu dem 

Quencherfarbstoff unterdrückt wird (Fluoreszenz-Energietransfer, FRET)

Prinzip der Real-Time-PCR 

• während der PCR-Reaktion wird die hybridisierte DNA-Sonde durch die 

5'-3'-Exonuklease-Aktivität der Polymerase zerschnitten 

• dadurch wird die räumliche Nähe zwischen Reporter und Quencher 

unterbrochen, und der Reporterfarbstoff kann Fluoreszenzlicht emittieren

Quantitative Auswertung der Real-Time-PCR 

• die Hydrolyse der Sonde durch die 5'-3'-Exonuklease-Aktivität kann nur 

dann erfolgen, wenn es zu einer sequenzspezifischen Hybridisierung 

zwischen Sonde und Zielsequenz kommt 

• entsprechend der Amplifikation des spezifischen PCR-Fragmentes steigt 

das Fluoreszenzsignal an, dabei ist die Fluoreszenzzunahme dem 

Zuwachs an PCR-Amplifikat direkt proportional. 

Vorteile der Real-Time-PCR 

• verringerte Kontaminationsgefahr, das PCR-Amplifikat muss nicht mehr 

auf ein Agarosegel aufgetragen werden (Vermeidung von "carry-over") 

•die Integration der Bestätigungsreaktion im PCR-Lauf 

(fluoreszenzmarkierte Hybridisierungssonden).

Ermitteln des CT-Werts 

CT-Wert ("threshold cycle"): 

• entspricht der Zyklenzahl, bei der zum ersten Mal ein Anstieg der 

Reporter-Fluoreszenz über das Grundrauschen ermittelt wird

Standard-Reihe mit bekannten DNA-Mengen

Real-Time-PCR: Erstellen einer Standardkurve

‣ eindeutige, gesicherte Aussage (Konsequenzen für Patienten!) 

Einsatz der PCR in der klinischen Diagnostik 

Schwerpunkt: Erregernachweis ohne vorherige Kultivierung 

a) Viren 

• Beispiele: HIV, HBV, HCV (Hepatitis C-Virus), CMV 

(Cytomegalie-Virus) 

• Kultivierung ist aufwendig (z. T. Labor gemäß BSL 3*) 

b) Bakterien 

• Beispiele: Chlamydia, Mycobacterium, Neisseria‚ Salmonella 

• Kultivierung ist oft sehr langwierig 

wichtige Parameter: 

‣ ausreichende Spezifität (cave falsch positive Ergebnisse) 

‣ hohe, aber klinisch relevante Sensitivität (z. T. 20 Genome pro mL)

Repetitive Sequenzen im Genom des Menschen 

a) (Makro-)Satelliten-DNA 

• bestehen aus sehr langen Sequenzen von 100en bis 1000en von bp 

• ihrerseits tandemartig wiederholt (bis mehrere 100000 bp lang) 

b) Minisatelliten 

• Länge zwischen 100 und 15000 bp, wobei jeweils 15 - 100 bp 

tandemartig wiederholt werden 

• Anzahl der wiederholten Sequenzen ist sehr variabel 

• bilden Polymorphismen (VNTR = variable number of tandem repeats) 

• oft herangezogen zum Erstellen eines genetischen Fingerabdrucks

Repetitive Sequenzen im Genom des Menschen 

c) Mikrosatelliten 

• ebenfalls tandemartig wiederholten Sequenzen, aber nur 2 -6 bp lang 

• machen insgesamt etwa 0,5% des Genoms aus 

• innerhalb einer Population hochpolymorph, d.h. praktisch jedes 

Individuum ist an diesen Orten heterozygot 

• bilden STRPs (short tandem repeat polymorphisms) 

• oft Ursache von Erbkrankheiten (Chorea Huntington, Muskeldystrophie) 

• diagnostisch wichtig 

• ebenfalls oft herangezogen für Vaterschaftstests

Einsatz der PCR zum Nachweis von genetischen Defekten 

Längenvariante Mutationen bei Chorea Huntington: 

• ursächliche Mutation: Expansion eines Trinucleotid-Repeats (CAG) 

im betroffenen HD-Allel (IT15-Gen) 

• normales Allel zeigt ebenfalls Längenpolymorphismus (bis zu 32 

Wiederholungen) 

• positiver Befund erst ab 36 CAGs 

Vererbung erfolgt autosomal dominant: immer zweites, gesundes Allel 

vorhanden

Einsatz der PCR zum Nachweis von genetischen Defekten

Einsatz der PCR zum Nachweis von genetischen Defekten 

1 2 3 4 5 

PCR-Amplifikation durch spezifische Primer, die 

den CAG-Repeat flankieren 

2) betroffene Frau (n = 55) 

präsymptomatische Kinder: 

3) erste Tochter: Reduktion (n = 51) 

4) Sohn: ebenfalls n = 55 

5) zweite Tochter: weitere Expansion (n = 59) 

1) Vater: homozygot (n = 19) 

1 2 3 4 5

Prinzip des genetischen Fingerabdrucks 

STR (short tandem repeats) im TPOX-Genlocus: 

Allel1: AATGAATGAATGAATGAATGAATG 

Allel2: AATGAATGAATGAATGAATGAATGAATG 

Bei Allel1 ist also die Folge "AATG" 6x wiederholt, bei Allel2 7x. 

Dies wird dann in einem genetischen Fingerabdruck 

folgendermaßen festgehalten: 

Locus Allel1 Allel2 

TPOX 6 7

Statistische Grundlagen des genetischen Fingerabdrucks 

Fiktives Beispiel: 

Angenommen, an jedem Genort gäbe es 10 mögliche Wiederholungen. 

Dann wäre die Chance, dass 2 Personen den gleichen genetischen 

Fingerabdruck haben: 

- bei 1 Genort 1:10 

- bei 2 Genorten 1:100 

- bei 16 Genorten 1:10.000.000.000.000.000 

- bei 17 Genorten 1:100.000.000.000.000.000 

Die Sicherheit potentiert sich also mit jedem hinzugekommenen Genort! 

Beispiel für tatsächlich herangezogene humane Genloci: 

D3S1358, vWA, D16S539, D2S1338, D8S1179, D21S11, D18S51, 

D19S433, TH01, D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, CSF1PO 

und FGA

Durchführung des genetischen Fingerabdrucks 

in der Forensik 

Sicherstellen von DNA-Proben vom Tatort 

• geeignet sind grundsätzlich alle zellhaltigen Proben, z. B. Blut- und 

Sekretspuren, Haarwurzeln oder Hautschuppen 

• typische Spuren von Tatorten sind z.B. gerauchte Zigarettenfilter, benutzte 

Taschentücher, Kleidungsstücke mit Haaren, Sekretflecken oder 

Hautabrieb 

molekularbiologischer Vergleich der DNA 

• Entnahme einer DNA-Probe des Verdächtigen (z. B. gezielt oder durch 

Reihenuntersuchung, DNA-Datei des BKA) 

• Amplifikation mit PCR und Detektion mittels Gelelektrophorese

Prinzip des genetischen Vaterschaftsnachweises 

•die Wiederholungsanzahlen der STR-Loci werden vererbt 

• ein Kind trägt an jedem STR-Genort eine Wiederholungsanzahl der Mutter 

und eine des Vaters 

M V K1 K2 K3 K4

Beispiel für Vaterschaftstest 

Gelelektrophorese nach PCR-Amplifikation von STRs 

• DNA der Mutter (M), des Kindes (K) und von zwei zu 

testenden Männern (V1 und V2) 

markiert: entscheidende Banden 

• V1 besitzt gemeinsame Banden mit dem Kind, aber 

nicht mit der Mutter, V2 dagegen nicht 

• die Vaterschaft von V1 ist somit nachgewiesen, 

V2 scheidet dagegen als Vater aus

Identifizierung von Mitgliedern einer Genfamilie 

• Prinzip: homologe Proteine besitzen konservierte Bereiche und damit 

ähnliche Genabschnitte

Identifizierung von Mitgliedern einer Genfamilie 

mit degenerierten Primern werden solche ähnlichen Abschnitte amplifiziert 

erhaltene Fragmente werden kloniert und sequenziert und können Hinweise 

auf bisher unbekannte Mitglieder von Genfamilien liefern

Prinzip der Immuno-PCR


Prinzip der Immuno-PCR 

• kurze DNA-Abschnitte sind an monoklonale Antikörper gebunden 

• Bindung des MAK kann durch PCR nachgewiesen werden 

Vorteil: weitere Empfindlichkeitssteigerung des ELISA 

• Nachweisgrenze: 

ELISA ca. 10 -18 mol 

Immuno-PCR: ca. 500 Proteinmoleküle

Random amplified polymorphic DNA analysis 

• wichtiges Verfahren der Phylogenetik 

• Prinzip: Einsatz kurzer Zufallsprimer 

liefert Gemisch verschiedener 

PCR-Amplifikationsprodukte 

• erhaltenes Bandenmuster spiegelt 

Struktur der Gesamt-DNA wider 

• je näher zwei Organismen verwandt 

sind, desto ähnlicher ist ihr Bandenmuster 

• mit Hilfe dieses Verfahrens wurde nachgewiesen, daß ein Klon des 

Hallimasch (Armillaria bulbosa) eines der größten und ältesten 

Lebewesen der Erde ist

Biosynthese des Insulins 

• Synthese erfolgt zelltypspezifisch in den B-Zellen der Langerhans‘ 

schen Inseln im Pankreas


⇒ Insuline werden nur von einem Gen codiert ! 

• Insuline werden zunächst als Vorläufermoleküle mit nur einer Kette 

synthetisiert (Prä-Proinsulin)


• Signalpeptid ist verantwortlich für Ausschleusen aus dem ER 

• Abspaltung des Signalpeptids bei Membrandurchtritt ergibt Proinsulin


• C-Peptid ist verantwortlich für optimale Faltung zur korrekten 

Ausbildung der Disulfidbrücken (2 x intramolekular, 1 x intermolekular)

equenzvergleich zwischen Insulinen verschiedener Spezies

equenzvergleich zwischen Insulinen verschiedener Spezies

Humanisierung von Schweine-Insulin 

Abspaltung der terminalen 

Aminosäure in der B-Kette 

mit Trypsin 

• wasserfreies Medium: Einbau von Threonin anstelle von Wasser 

• Reaktionsbedingungen genau eingestellt, um Spaltung hinter

Insulinbedarf 

ein Diabetiker „braucht“ 

50 Schweine im Jahr 

Jahresbedarf weltweit 

5 - 6 t pro Jahr 

Fa. Hoechst verarbeitete täglich 

11 t Schweinebauchspeicheldrüsen 

(aus 100.000 Schlachttieren) 

technisch machbar, aber nicht 

ausreichend, um Weltbedarf an 

Insulin zu decken

Übersicht über gentechnisch hergestellte Insuline 

Wirkstoff Präparat Hersteller Organismus 

Humaninsulin 

Berlininsulin ® Berlin-Chemie E. coli 

Huminsulin ® Lilly E. coli 

Insulin Actrapid ® Novo Nordisk S. cerevisiae 

Insuman ® Aventis E. coli 

Insulin lispro Humalog 100 ® / 

Liprolog ® Lilly E. coli 

Insulin aspart NovoRapid ® Novo Nordisk S. cerevisiae 

Insulin glargin Lantus ® Aventis E. coli

Insulinsynthese in zwei Bakterienstämmen 

• A- und -B-Ketten werden in zwei unterschiedlichen E. coli-Stämmen 

synthetisiert 

• jede Kette erhält zusätzliches Methionin am N-terminalen Ende (Start 

der Transkription!), das mit CNBr abgespalten werden muß

Insulinsynthese in zwei Bakterienstämmen 

• Kombination der Ketten nach oxidativer Sulfitolyse 

• oxidative Verknüpfung durch Ausbildung der Disulfidbrücken 

⇒ nur geringe Ausbeute möglich

Gewinnung von Einketten-Insulin 

• C-Peptid im Vektor 

enthalten 

⇒ Kopie der natürlichen 

Insulinbiosynthese: 

zunächst wird Pro-Insulin 

(-analogon) gebildet


• das C-Peptid fördert die 

korrekte Ausbildung der 

Disulfidbrücken 

⇒ oxidative Sulfitolyse 

verläuft mit wesentlich 

höherer Ausbeute


• Abspaltung des C-Peptid 

mit Trypsin und 

Carboxypeptidase B 

⇒ Prozeß verläuft ähnlich 

der Humanisierung von 

Schweineinsulin

Insulingewinnung aus Bäckerhefe 

• „Mini-Proinsulin“: 

C-Peptid auf drei 

Aminosäuren 

verkürzt 

• ausreichend für 

korrekte Faltung

Insulingewinnung aus Bäckerhefe 

• Abspaltung des 

„C-Peptids“ ist 

analog zur 

Humanisierung von 

Schweine-Insulin

Insulin lispro: Das erste zugelassene Insulin-Mutein 

• Insulin lispro: Reihenfolge Pro B28 , Lys B29 ist vertauscht 

⇒ Tendenz zur Hexamerbildung ca. 300fach verringert

Insulin lispro: Das erste zugelassene Insulin-Mutein 

• deutlich schneller bioverfügbar als Humaninsulin 

• bessere Steuerbarkeit des Blutglucose-Spiegels 

• kein postprandialer Glucose-Anstieg 

• kein postprandialer Glucose-Abfall (nach Insulin-Gabe)

Insulin aspart, ein weiteres schnell wirksames Insulin 

• Insulin aspart: Pro B 28 ist durch Asp ersetzt 

• Wirkung / Pharmakokinetik ähnlich wie die von Insulin lispro

Insulin glargin, ein langwirksames Insulinanalogon 

Insulin glargin: die B-Kette ist am Carboxylende um zwei Arginine verlängert 

Asparagin in Position 21 der A-Kette durch Glycin ersetzt

Insulin glargin, ein langwirksames Insulinanalogon 

⇒ verzögerter Wirkungseintritt 

• im physiologischen pH-Bereich (pH = 7.4) schwer löslich 

• in schwach saurer Lösung (pH = 4) vollständig löslich 

• präzipitiert nach Injektion in das Subkutangewebe 

• bildet stabilisierte Hexamer-Assoziate

Übersicht über pflanzenspezifische in vitro-Techniken

Samenkeimung in vitro 

praktische Anwendung: Vermehrung und Züchtung von Orchideen 

nährstoffarme Samen keimen in der Natur nur in Gegenwart von Pilzen


• oberflächensterilisierte Samen bilden auf Nährmedium Protokorm 

• sich entwickelnde Pflanzen werden auf geeignetes Substrat pikiert


• weitere Entwicklung erfolgt im Gewächshaus 

• auch verwendet für Neuzüchtung sowie den Erhalt und die Vermehrung

Embryokultur 

efinition: Aufzucht eines aus Samen isolierten Embryos 

nwendung: 

üchtung von Getreidearten (evtl. komplette Samenanlage entnehmen) 

rechen der Samenruhe bei Holzgewächsen 

Embryorettung”: nicht entwicklungsfähige Samen (aus Kreuzungsxperimenten) 

werden auf geeigneten Nährmedien zur Weiterdifferenzierung 

ngeregt (Triticale-Arten) 

mmen-Endosperm-Technik: Hybridembryo wird freipräpariert und in 

normalen” Samen übertragen

Prinzip der Embryokultur 

Haploidenkultur 

• Haploide: Sporophyten mit der 

Chromosomenzahl des 

Gametophyten 

• haploide Zellen entstehen durch 

Meiose: Zellen des Embryosacks 

(Megagametophyt) bzw. des 

Pollens (Mikrogametophyt) 

• haploide Pflanzen können 

entweder durch Gymnogenese 

oder – bevorzugt – durch 

Androgenese gewonnen werden


Antherenkultur 

• aus Pollenkörnern der isolierten 

Antheren entsteht haploider 

Kallus, der zu haploiden 

Pflanzen regeneriert werden 

kann 

• diese können nach künstlicher 

Diploidisierung durch Colchicin 

zu Kreuzungsexperimenten 

genutzt werden


Prinzip der Mikrosporenkultur 

• nicht-haploide Zellen der Antherenw 

können Kallus bilden, aus dem 

sich intakte Pflanzen bilden können 

• wird verhindert, wenn nicht die 

gesamten Antheren, sondern nur die 

Mikrosporen kultiviert werden 

• Vorteil: es wird verhindert, daß die 

durch Androgenese entstandenen 

Pflänzchen überwuchert werden

Meristemkultur 

Meristeme: 

teilungsaktive Bildungsgewebe 

• können aus der Pflanze entnomme 

werden und in vitro kultiviert werde 

• häufig werden Blattprimordien 

verwendet (Meristem wird durch 

umliegende Zellen geschützt)

Meristemkultur 

• angewendet z. B. bei Digitalis lanata und Baptisia tinctoria 

• gut geeignet, um virenfreie Pflanzen zu erhalten (z. B. Erdbeere, Banane)

ikropropagation durch Adventivbildungen an Explantaten 

• Adventivbildung: Organentwicklun 

aus nicht-meristematischen 

Geweben 

⇒ bereits ausdifferenzierte, 

spezialisierte Zellen werden 

wieder meristematisch 

• manchmal über Bildung von Kallu 

als Zwischenstadium

ikropropagation durch Adventivbildungen an Explantaten 

• Sproßbildung kann z. B. durch 

Phytohormongabe induziert 

werden 

• Methode der Wahl bei Geranien, 

Petunien, Usambara-Veilchen, 

bestimmten Vertretern der 

Liliopsida

Kallusinduktion und Organogenese 

Kallus: bildet sich an Wundflächen nach Auslegen auf feste Nährmedien 

Primärkallus kann entfernt und unabhängig kultiviert werden 

durch Subkultivierung lassen sich gezielt Zellinien gewinnen


• junger Kallus kann durch Phytohormone zu Organogenese oder Embryoidbildung 

angeregt werden, somit können intakte Pflanzen gewonnen werden 

• nach einer gewissen Zeit tritt Habituierung ein (Kalluszellen werden 

unabhängig von Wachstumsfaktoren, lassen sich aber auch nicht mehr 

regenerieren)


nogenese: 

rch Phytohormongabe kann man Bildung von Sprossen oder Wurzeln induzie 

minieren Cytokinine, wird Sproßbildung gefördert 

minieren Auxine, wird Wurzelbildung gefördert 

Adventivsprossen können Wurzeln induziert werden (aber nicht umgekehrt)

Bildung von Ruta-Alkaloiden in Kalluskulturen 

lluskulturen entwickeln meist bereits nach kurzer Zeit ihr eigenes 

kundärstoffmuster, unabhängig von ihrer Herkunft

generierte Pflanzen zeigen meist wieder das urspüngliche Verteilungsmuste 

Bildung von Ruta-Alkaloiden in Kalluskulturen 

rund: z. B. Verlust von Zelldifferenzierung, Verlust von Speicherorganen

Somaklonale Variation 

ährend der Kultivierung verändern sich Pflanzenzellen in vielfältiger Weise 

rhöhte Mutationsrate durch hohe Zellteilungsraten und geringen Selektionsdr 

erden Veränderungen stabil weitergegeben, so liegen Mutanten vor

Protoplastenisolierung und Elektrofusion 

rotoplasten: Gesamtheit aller Zellbestandteile mit Ausnahme der Zellwand 

ewinnung: Abbau der Zellwand mit Hilfe von Cellulasen, Hemicellulasen 

nd Pektinasen

Protoplastenisolierung und Elektrofusion 

• Protoplastenfusion kann chemisch oder elektrisch induziert werden 

• zunächst bildet sich ein Heterokaryon, anschließend ein Hybrid

Selektion von Zellinien 

• Metastabile Zellkultur: Zellsuspension 

stellt eine Mischpopulation 

aus besser und 

schlechter produzierenden 

Zellen dar 

• Selektion ist möglich durch 

- (wiederholte) Zellaggregat 

klonierung 

- Einzelzellklonierung 

- Protoplastenklonierung

Gewinnung von Protoberberin-Alkaloiden 

durch Suspensionskultur 

allusstücke werden in Erlenmeyerkolben überführt und unter Schütteln kultiv 

ubkultivierung erfolgt alle 7 bis 14 Tage

Gewinnung von Protoberberin-Alkaloiden 

durch Suspensionskultur 

• Upscaling möglich bis > 1000 L (meist Rührkesselreaktor) 

• auch möglich: Wurzelkulturen (z. B. bei der Gewinnung von Forskolin)

Produktivitäten einiger Pflanzenzell- und Gewebekulturen

ispiele für Naturstoffakkumulation in pflanzlichen Zellkultur

Beispiele für antineoplastische Naturstoffe, 

die von pflanzlichen Zellkulturen produziert werden

Beispiele für Terpenoide, die von pflanzlichen Zellkulturen 

produziert werden

Beispiele für Terpenoide, die von pflanzlichen Zellkulturen 

produziert werden

Beispiele für Alkaloide, die von pflanzlichen 

Zellkulturen produziert werden

Beispiele für Alkaloide, die von pflanzlichen 

Zellkulturen produziert werden

Beispiele für weitere Naturstoffe, die von pflanzlichen 

Zellkulturen produziert werden 

⊕ Shikonin: erstes kommerzielles Produktionsverfahren 

mit pflanzlichen Zellkulturen (in Japan eingesetzt in 

Kosmetika und zur Textilfärbung) 

• aus den Wurzeln von Lithospermum erythrorhizon 

• Anbau der Pflanze ist nicht wirtschaftlich 

• Produktivität der Zellkultur liegt bei 1500 mg Shikonin 

pro L und Tag 

• Marktwert ca. 3500 € / kg

Beispiele für weitere Naturstoffe, die von pflanzlichen 

Zellkulturen produziert werden 

⊕ Purpurin: Anthranoid vom Alizarin-Typ 

• eingesetzt in der Farbstoffindustrie

Beispiele für Biotransformationen phenolischer 

Verbindungen durch pflanzliche Zellkulturen 

rbutin: hemmt Melaninsynthese, eingesetzt in depigmentierenden Hautcreme 

ird bisher synthetisch gewonnen 

auvolfia-Zellkultur bildet 18 g/L aus zugegebenem Hydrochinon 

Zukunft konkurrenzfähig ?

ispiele für Biokonversionen durch pflanzliche Zellkulturen 

⊕ Nootkaton: Grapefruitaroma 

⊕ Steviol: Aglykon des Steviosids 

300 mal süßer als Glucose 

Produktion in Japan ca. 200 t 

pro Jahr 

⊕ Steroide: ungewöhnliche Posit 

für Hydroxylierungen durch 

Zellkultur

Die Wurzelhalsgallenkrankheit: 

Basis für die Herstellung transgener Pflanzen

Die Wurzelhalsgallenkrankheit: 

Basis für die Herstellung transgener Pflanzen 

•Auslöser:Agrobacterium tumefaciens 

• Bodenbakterium, das hauptsächlich Dikotyledonen befällt 

• genetische Basis: Ti-Plasmid

Struktur und Funktion von Opinen 

pine: Kondensationsprodukte aus Aminosäuren und Ketosäuren bzw. Zucker 

werden nach Transfer der T-DNA von den befallenen Pflanzen produziert 

dienen Agrobacterium tumefaciens als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle 

können von anderen Bodenbakterien nicht genutzt werden

Genkarte des Ti-Plasmids

Linearisierung des Ti-Plasmids beim T-DNA-Transfer

Gentransfer in Höhere Pflanzen in der Natur

Gentransfer in Höhere Pflanzen in der Natur

Funktionen des Ti-Plasmids



Vom Ti-Plasmid abgeleitete Vektorsysteme: 

Zwei-Vektor-Verfahren

Vom Ti-Plasmid abgeleitete Vektorsysteme: 

der binäre Ti-Vektor pBin19

Cointegrationsverfahren

Prinzip des Gentransfers in Höhere Pflanzen



Vektorfreie Genübertragung

Vektorfreie Genübertragung 

Biolistik (Gene Gun ® )

Direkte Genübertragung

Direkte Genübertragung

Inaktivierung von Genen durch Antisense-Inhibition 

• Prinzip: Ziel-Gen wird „falsch 

herum“ in einen Vektor zwisc 

Promotor und Teminator 

eingebaut 

• Transkription des Antisense- 

Gens führt zur Bildung von 

Antisense-RNA 

• Translation der Ziel-mRNA w 

verringert (meist nicht vollstän 

unterdrückt)

Vermuteter Mechanismus der Antisense-Inhibition 

• Sense- und Antisense-mRNA 

sind komplementär zueinande 

• es kommt zur Ausbildung eine 

Doppelstranges 

• Expression der mRNA wird 

blockiert (vermehrter Abbau d 

Nucleasen oder Verhindern de 

Anlagerns an das Ribosom?)

Antimatsch-Tomaten“ als erste kommerzielle Anwendung 

Prinzip: Einbau eines Antisense-Gens für Polygalacturonidase

Antimatsch-Tomaten“ als erste kommerzielle Anwendung 

Zeitverlauf der Polygalacturonidase-Spiegel

Verzögerung von Reifeprozessen durch 

Hemmung der Ethylen-Produktion





Wirkungsweise der δ-Endotoxine 

δ-Endotoxine: potente insektizide 

Proteine aus Bacillus thuringensis

Expression natürlicher Insektizide

Expression natürlicher Insektizide

Positionseffekt 

Die Stärke der Expression hängt ab vom zufälligen Ort des Einbaus 

in das Chromosom

Genehmigte Freisetzungen in Deutschland

Übersicht über Freisetzungen gentechnisch 

veränderter Pflanzen in Deutschland

Übersicht über Freisetzungen gentechnisch 

veränderter Pflanzen in Deutschland

Inaktivierung von Herbiziden durch Biotransformation 

Prinzip: der Pflanze wird ein bestimmtes Enzym zur Modifikation des 

Herbizids übertragen 

⇒ Pflanze wird dadurch unempfindlich gegenüber dem Herbizid

Inaktivierung von Herbiziden durch Biotransformation 

Prinzip: der Pflanze wird ein bestimmtes Enzym zur Modifikation des 

Herbizids übertragen 

⇒ Pflanze wird dadurch unempfindlich gegenüber dem Herbizid

Weitere Ansätze zur gentechnischen Veränderung 

von Nutzpflanzen: Änderung des Nährwertes 

Antisense-Inhibition der 

earyl-ACP-Desaturase in Raps 

Veränderung des Fettsäuremusters

Weitere Ansätze zur gentechnischen Veränderung 

von Nutzpflanzen: Änderung des Nährwertes 

Expression einer bakteriellen ADP-Glucose-Pyrophosphatase in Kartoffeln

Überexpression der Hyoscyamin-6β-Hydroxylase 

in Atropa belladonna

Erzeugung männlicher Sterilität

icherheitsaspekte: Elimination von selektierbaren Markern 

roblem: keine sicheren Aussagen möglich über die Auswirkungen der 

reisetzung von bakteriellen Resistenzgenen z. B. auf das Ökosystem 

der die menschliche Darmflora 

Entfernen durch Cre-Enzym des Bakteriophagen P1 

katalysiertRekombinationsvorgang, bei dem DNA-Fragmente zwischen zwei

icherheitsaspekte: Elimination von selektierbaren Markern 

Transformation mit zwei Klonierungsvektoren: 

- 1. Vektor mit Ziel-Gen sowie selektierbarem Marker 

(eingerahmt von Cre-Erkennungssequenzen) 

- 2. Vektor mit Cre-Gen 

nach Transformation schneidet das Cre-Enzym das Resistenzgen aus

Struktur von Antikörpern 

Antikörper 

• bestehen aus je zwei identischen leichten 

und zwei schweren , über Disulfidbrücken verknüpften Protein-Ketten


Antikörper 

• schwere Kette: entscheidet über Subtyp (IgA, IgD, IgG, IgE, IgM) 

• CDR: drei hypervariable Bereiche bilden die Antigenbindungsstelle


Antikörper 

• enthalten zwischen 3 und 13 % Zuckeranteile 

• werden von aktivierten B-Lymphozyten (Plasmazellen) gebildet

Spaltung von Antikörpern mit Papain und Pepsin

3D-Struktur von Antikörpern

Struktur der Antikörper-Subklassen

Eigenschaften der Antikörper-Subklassen

Prinzip der Herstellung von monoklonalen Antikörpern 

• Antikörper sind sich strukturell sehr ähnlich 

•dieIsolierung einzelner Antikörper aus Ig-Fraktionen des 

Serums ist technisch unmöglich 

• jeder B-Zell-Lymphozyt produziert nur genau eine Sorte von AK 

• einzelne Zellen müßten kloniert werden 

• Problem: B-Zellen besitzen in vitro nur eine kurze Lebensdauer 

• Lösung: Fusionierung von Antikörper-produzierenden B-Zellen 

mit „unsterblichen“ Myeloma-Zellen


1 2 

3 

4 

1 2 3 4 

2 3 

1 

4


1 

2 3 4 

1 2 3 4 

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1 

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2 

3 

2 3 

3 

2 

3 

4 

4 

4 

4

Ablauf der Herstellung von monoklonalen Antikörpern 

1) Immunisierung von Mäusen mit Antigen 

• mehrmalige Infusion führt zu besserer Produktion von Antikörpern 

• Haptene (< 10 kDa) werden durch Kopplung an hochmolekulare 

Träger zu Antigenen 

2) Kultivierung einer Maus-Myeloma-Zellinie (B-Zell-Linie) 

• produziert selbst keine Antikörper 

• gezielter Einbau eines Enzymdefekts für spätere Selektion 

3) Isolierung von Milz-Zellen aus immunisierter Maus


4) Fusion von Milz-Zellen mit Myelom-Zellen 

•“Hybridoma-Zellen”, Fusion erfolgt meist durch Zugabe von PEG 

5) Selektion von Hybridoma-Zellen 

• durch HAT-Selektion (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin) 

6) Primäres Screening Antikörper-produzierender Hybridoma-Zellen 

• im Fall von Haptenen sollte ein anderes Proteinkonstrukt verwendet 

werden als das zur Immunisierung eingesetzte 

• meist mit Hilfe von ELISA


7) Klonierung (Vereinzelung) vorselektionierter Zellen 

• z. B. durch Verdünnen (200 µl Medium pro Zelle) 

8) Identifizierung von MAK-produzierenden Klonen 

9) Charakterisierung der produzierten MAK 

• z. B. Bestimmung der Isotypen

Ablauf der Immunisierung 

• hoher Antikörpertiter ist wichtig für die Produktion von MAK 

• zur effektiven Immunisierung sind mehrere Injektionen notwendig 

• verwendete Antigen-Mengen: 5 - 100 µg pro Immunisierung und Maus

Ablauf der Immunisierung 

• Zeitbedarf: wenige Wochen bis mehrere Monate 

• Haptene (< 10 kDa) müssen an hochmolekulare Träger gebunden 

werden (z. B. Serumalbumin, Transferrin, synthetisches Poly-Lysin) 

• werden gekoppelte Haptene eingesetzt, muß für die Überprüfung der 

Antikörperproduktion ein zweites Konjugat verwendet werden

Herstellung von monoklonalen Antikörpern

Herstellung von monoklonalen Antikörpern

Charakterisierung von Antikörpern

Ablauf und Hemmung der Purin-Biosynthese 

• Aminopterin hemmt Bildung von IMP ausgehend von Ribose-5-Phosphat 

• Zellen sterben ab, da keine Purine mehr gebildet werden können

Hemmung der C 1 -Übertragung durch Aminopterin 

Tetrahydrofolsäure (C 1 -Überträger) 

Aminopterin (Folsäureantagonist)

Ablauf und Hemmung der Purin-Biosynthese 

•„normale“ Zellen können Aminopterin-Block umgehen, wenn Hypoxanthin 

im Medium vorhanden ist (Umsetzung durch Hypoxanthin-Guanin- 

Phosphoribosyltransferase, HGPRT): „salvage pathway“

Ablauf und Hemmung der Pyrimidin-Biosynthese 

• Aminopterin hemmt Bildung von dTMP ausgehend von dUMP 

• Zellen sterben ab, da kein Thymidin mehr gebildet werden kann

Ablauf und Hemmung der Pyrimidin-Biosynthese 

•„normale“ Zellen können Aminopterin-Block umgehen, wenn Thymidin 

im Medium vorhanden ist (Umsetzung durch Thymidinkinase, TK)

Biochemische Grundlagen der HAT-Selektion 

• Aminopterin-Block führt zum Erliegen der DNA-Synthese und zum Zelltod


•„normale“ Zellen können Aminopterin-Block umgehen, weil sie über 

„salvage pathways“ Thymidin und Hypoxanthin zur DNA-Synthese


• Myelom-Zellen verfügen weder über HGPRT noch TK (gezielte Selektion 

durch „Gen-Knockout“)

Prinzip der HAT-Selektion 

yelomzellen: können 

icht auf HAT-Medium 

achsen 

ybridomazellen: 

önnen „unberenzt“ 

auf HATedium 

wachsen 

Fusion 

Kultur auf HAT-Medium 

Milzzellen: können 

zwar auf HAT-Medium 

wachsen, haben aber 

eine begrenzte 

Lebensdauer

Prinzip der HAT-Selektion 

• nur Hybridoma-Zellen können unter den gewählten Selektionsbedingungen 

überleben 

• einzelne Zellen können weiter charakterisiert und zur Erstellung von

Industrielle Herstellung von monoklonalen Antikörpern 

1) Ascites-Methode 

• Injektion von Hybridomazellen in die Bauchhöhle der Maus (ethisch 

bedenklich, in Deutschland nur in Sonderfällen erlaubt) 

• nach 14 Tagen kann Flüssigkeit (2 – 5 mL) entnommen werden 

• pro Entnahme 5 – 10 mg, d. h. 50 mg AK pro Maus 

2) Dialyseschlauch 

• Ausschlußgrenze ca. 10 4 Da 

• Volumen bis 500 mL, 100 – 300 mg/L AK


3) Airlift-Bioreaktor 

• schonende Durchmischung bei geringen Scherkräften 

• 5 – 8000 L Volumen, 200 – 350 mg/L AK


4) Hohlfaser-Bioreaktor 

• Hybridomazellen befinden sich im extrakapillaren Raum 

• keine Durchmischung mit höhermolekularen Serumbestandteilen


4) Hohlfaser-Bioreaktor 

• leichtere Reinigung 

• Volumen bis 2 L, 1000 – 5000 mg/L AK


5) Produktion in transgenen Tieren 

• selektive Produktion im Euter von Kühen, Ziegen oder Schafen 

• Ausbeuten bis mehrere mg pro mL Milch 

6) Produktion in transgenen Pflanzen 

• besonders geeignet: transgener Tabak (Nicotiana tabacum) 

• Antikörpergehalt: bis zu 1.5% des Trockengewichts der Blätter 

• Vorteil: Anbau auch in Ländern der 3. Welt möglich (Vermeiden von 

Kühlketten)

Industrielle Produktion von monoklonalen Antikörpern

Engineering von monoklonalen Antikörpern 

• chimäre Antikörper: nur variable Abschnitte stammen von der Maus 

⇒ Vorteil: geringere immunogene Eigenschaften

Humanisierung von monoklonalen Antikörpern


• humanisierte Antikörper: nur CDR stammen von Maus, der Rest vom 

Menschen 

⇒ Vorteil: geringere / keine immunogene Eigenschaften

Humanisierung von monoklonalen Antikörpern

Gewinnung von Infliximab

Gewinnung von Infliximab


• insbesondere für diagnostische Zwecke sind oft keine vollständigen 

Antikörper notwendig

Produktion von Einketten-Antikörpern durch die 

Phagendisplay-Technik 

• Vorgehensweise: ausgehend von Lymphozyten von nichtimmunisierten 

humanen Spendern wird eine cDNA-Bank erstellt, die alle denkbaren 

variablen Regionen enthält 

• diese werden willkürlich kombiniert und in das Gen 3 des filamentösen 

Phagen M13 kloniert



• zwischen der leichten (VL) und der schweren Kette (VH) befindet sich ein 

Protein-Linker (pLi) 

• das Genprodukt des Phagengen 3 (gp3) sorgt dafür, daß die Immunglobuline 

auf der Oberfläche der Phagenpartikel exprimiert werden 

• Phagen mit der gesuchten Spezifität werden über Bindung und Elution an



• durch Neuinfektion von Bakterien können Einketten-Antikörper im 

industriellen Maßstab gewonnen werden („coliklonale Antikörper“) 

• außerdem ist es möglich, die AK-Gene zu isolieren, in einer Säugetierzellinie 

zu exprimieren und so vollständige Antikörper herzustellen

Gewinnung von Adalimumab durch Phagendisplay

Proteinreinigung per Immunoaffinitätschromatographie

Proteinreinigung per Immunoaffinitätschromatographie

Proteinreinigung per Immunoaffinitätschromatographie 

•bis zu50.000fache Reinigung in einem Schritt! 

• Elution durch Salzgradient oder durch Proteolyse

Prinzip des heterogenen Immunoassays 

heterogener Immunoassay: Trennung von freiem und gebundenem Antigen 

(homogener Immunoassay: keine Trennung erforderlich)

Prinzip der Frontline-Teststäbchen 

Gloria-Technologie: gold labeled optical read immuno assay

Prinzip des ELISA-Tests 

Adsorbieren des 

Antigens 

enzyme linked immunosorbent assay


1. Antikörper 

(gegen Antigen)



(gegen 1. Antikörper, 

gekoppelt an Enzym, z. B. 

Alkalische Phosphatase, 

Meerrettich-Peroxidase) 

- oft MAK einer anderen 

Spezies, z. B. Schaf 

Zugabe von Substrat 

⇒ Bildung von Farbstoff

Prinzip des „Sandwich-ELISA“ 

Adsorbieren des 

Antikörpers 

(gegen Antigen)

Prinzip des „Sandwich-ELISA“ 

Inkubation mit 

Antigen 

Zugabe von 


(gegen Antigen) 

⇒ entspricht 1. Schritt 

bei „normalem“ ELISA 

Antigen befindet sich „sandwichartig 

zwischen zwei spezifischen AK



Prinzip der Immuno-PCR 

• kurze DNA-Abschnitte sind an monoklonale Antikörper gebunden 

• Bindung des MAK kann durch PCR nachgewiesen werden 

Vorteil: weitere Empfindlichkeitssteigerung des ELISA 

• Nachweisgrenze: 

ELISA ca. 10 -18 mol 

Immuno-PCR: ca. 500 Proteinmoleküle

Anwendung von MAK in der Diagnostik

Therapeutisches Drug-Monitoring durch MAK

Therapeutisches Drug-Monitoring durch MAK

Zur Therapie zugelassene monoklonale Antikörper

otumumab HumaSpect Organon Teknika Szintigraphie von Kolonkarzinom 

In Deutschland zugelassene monoklonale Antikörper 

N-Name Handelsname Hersteller Indikation 

alivizumab Synagis Abbott, UK Prävention der durch 

das Respiratory-Syncytial- 

Virus (RSV) hervorgerufenen 

schweren Erkrankungen der 

unteren Atemwege 

fliximab Remicade Centocor, NL Rheumatoide Arthritis, 

Morbus Crohn 

bciximab Reopro Centocor, NL zur Vermeidung ischämischer 

kardialer Komplikationen bei 

perkutaner Koronarintervention, 

bei instabiler Angina pectoris



rcitumomab CEA-Scan Immunomedics Scintigraphie von Kolon- und 

Rektumkarzinom 

ulesomab LeukoScan Immunomedics Scintigraphie der Osteomyelitis 

uromonab-CD3 Orthoklone OKT3 Janssen-Cilag 

Behandlung der akuten steroidresistenten 

Abstoßung von 

allogenen Nieren-, Herz- und 

Lebertransplantaten 

lemtuzumab MabCampath Millenium & ILEX Second-Line Behandlung der 

chronischen lymphatischen 

Leukämie



asiliximab Simulect Novartis Prophylaxe der akuten 

Transplantatabstoßung nach 

allogener De-novo- 

Nierentransplantation 

rastuzumab Herceptin Roche Behandlung von Brustkrebs mit 

HER2-Überexpression 

großzelligen diffusen B-Zell-Non 

ituximab Mabthera Roche Behandlung des follikulären 

(Stadium III-IV) sowie des 

Hodgkin-Lymphoms 

aclizumab Zenapax Roche Prophylaxe akuter Abstoßungsreaktionen 

nach de novo

Therapeutisch verwendete monoklonale Antikörper 

) adjuvante Tumortherapie 

anorex ® (Edrecolomab) 

gegen CO17-1A-Antigen (Oberflächenantigen auf bestimmten Tumorzellen, 

v. a. des Kolons, Rektums, Magens) 

vermitteln ADCC (Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität) 

nur disseminierte Zellen können immunologisch bekämpft werden 

zugelassen zur postoperativen adjuvanten Therapie des kolorektalen 

Karzinoms im Stadium Duke C 

Zulassung inzwischen widerrufen, da Wirksamkeit sich nicht bestätigen ließ 

erceptin ® (Trastuzumab) 

gegen HER2-Protein (=EGF-Rezeptor-2-Protein) 

zugelassen zur Therapie des metastasierenden Mammakarzinoms

Trastuzumab (Herceptin®): MAK gegen 

HER2-Rezeptor auf Krebszellen


2) Organtransplantation / Immunsuppression 

Orthoclone ® OKT3 (Muromonab-CD3) 

• gegen das T3-Antigen humaner T-Zellen gerichtet (Teil des T-Zellrezeptors 

sowohl von CD4- als auch CD8-Zellen) 

• schnelle Elimination von CD3-Zellen aus dem zirkulierenden Blut 

• zugelassen zur Behandlung der akuten Abstoßung von allogenen Nieren-, 

Herz- und Lebertransplantaten 

Simulect ® (Basiliximab) 

• chimärer Antikörper 

• erkennt α-Untereinheit des Interleukin-2-Rezeptors 

• Signalfunktion von Interleukin-2 bei Immunreaktion unterbunden 

• zugelassen zur Prophylaxe akuter Organabstoßungsreaktionen bei 

allogener Nierentransplantation


3) kardiovaskuläre Medizin 

ReoPro ® (Abciximab) 

• chimäres F(ab) 2 -Fragment 

• bindet Glykoproteinrezeptor GPIIb/IIIa 

• Bindung von Fibrinogen an diesen Rezeptor wird unterbunden 

• verhindert Thrombozytenaggregation und damit Thrombose 

• zugelassen zur Vermeidung kardialer ischämischer Komplikationen 

während oder nach perkutaner transluminaler Koronarangioplasie 

(PTCA)

huMAb-E25: monoklonaler Antikörper gegen IgE

Hypothetischer Wirkmechanismus von rhuMAb-E25 

• Neutralisierung zirkulierender IgE-Antikörper unterbindet die IgEvermittelte 

Degranulation der Mastzellen (Sofortreaktion) und 

hemmt die IgE-produzierenden B-Lymphozyten (Spätreaktion) 

• Bindung von E25 an APC hemmt die Antigen-Präsentation und


4) Therapie von Entzündungskrankheiten 

Remicade ® (Infliximab) 

• erkennt Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) 

• reduziert Infiltration inflammatorischer Zellen sowie die 

Produktion von Zytokinen 

• zugelassen zur Therapie des Morbus Crohn und der 

rheumatoiden Arthritis 

• bei Morbus Crohn in Kombination mit Methotrexat, wenn 

konventionelle Therapie nicht (mehr) wirksam

Bispezifische Antikörper in der Krebstherapie 


⇒ Antikörper mit zwei unterschiedlichen Bindungsstellen 

⇒ binden sowohl Tumor- als auch T-Zellen 

⇒ Aktivierung der T-Zellen, die angedockte Tumorzellen zerstören 

⇒ Fc-Fragment bindet zusätzlich Makrophagen und Killerzellen 

(Hybrid aus Maus- und Rattenantikörper)

Gewebsspezifische Anreicherung von monoklonalen AK 

Szintigramme einer Maus 

behandelt mit bispezifischen MAK, markiert mit radioaktivem Iod


Beispiele: 

Removab ® 

• erkennt CD3 (Oberflächenantigen von T-Lymphozyten) sowie 

EpCAM (epithelial cell adhesion molecule, auf der Oberfläche 

bestimmter epithelialer Tumorzellen) 

Rexomab ® 

• erkennt neben CD3 das Oberflächenantigen HER2/neu 

(Onkoprotein auf der Oberfläche von bestimmten Tumorzellen)


Anwendung: 

•zuradjuvanten Therapie von Tumoren (Mamma-, Lungen-, 

Ovarial- oder Kolonkarzinom), die die Antigene EpCAM bzw. 

HER2/neu tragen 

• verhindert wirkungsvoll Metastasen nach chirurgischem 

Eingriff 

• nicht wirksam gegen solide Tumoren 

Removall ® 

• Kombination beider Antikörper zur ex vivo-Therapie 

• Reinigung von Stammzell-Suspensionen von 

Tumorzellen 

• geplant zur Reinigung von Stammzelltransplantaten bei 

Frauen mit Brustkrebs, die eine Hochdosistherapie erhalten werden

Gentherapie 

efinition: 

bertragung von Nukleinsäuren in Körperzellen zur Erzielung 

ines therapeutischen oder prophylaktischen Effektes 

iel: 

in Defekt als Ursache einer Krankheit wird durch Übertragung 

enetischer Information auf molekularer Ebene beseitigt

Gentherapie 

1) somatische Gentherapie 

• ex vivo-Gentherapie (erstmals durchgeführt 1990) 

- Entnahme von Zellen des Patienten 

- genetische Manipulation im Labor 

- Retransplantation in den Patienten 

• in vivo-Gentherapie 

- direktes Einbringen der Gene in den Patienten 

• Antisense-Therapie 

- Unterdrückung / Verminderung der Expression eines bestimmten Genes 

2) Keimbahntherapie 

- in Deutschland an Menschen verboten (gemäß Embryonenschutzgesetz) 

- Manipulation der Augenfarbe von Drosophila in der folgenden Generation 

durch Einbringen des Gens rosy (1981)

Anwendungen der Gentherapie 

rster Versuch am Menschen 1990: 

ierjähriges Mädchen mit SCID (severe combined immune deficiency) 

beruht auf ADA-Mangel (Adenosindesaminase, wandelt Desoxyadenosin 

in Desoxyinosin um) 

angereichertes dATP hemmt dNTP-Synthese (”feedback inhibition”), 

dies führt zum Absterben v.a. von B- und T-Zellen und damit zum 

Verlust der Immunantwort 

Therapie: periphere CD3 + -T-Lymphozyten wurden kultiviert und mit 

dem ADA-Gen ausgestattet 

nach Retransplantation war eine signifikante Besserung der Symptome 

festzustellen

Anwendungen der Gentherapie 

Weitere Krankheiten, bei denen der mögliche Einsatz von Gentherapie 

derzeit erforscht wird (monogene Erbleiden) 

• familiäre Hypercholesterinämie (LDL-Rezeptor) 

• Hämophilie A (Blutgerinnungsfaktor VIII) 

• Phenylketonurie (Phenylalanin-Hydroxylase) 

• Zystische Fibrose = Muskoviszidose (CFTCR-Ionenkanal) 

• Sichelzellenanämie (β-Globin) 

• Duchenne-Form des Muskelschwunds (Dystrophin) 

• Gaucher-Krankheit (Glucocerebrosidase)

Schematische Darstellung der ex vivo-Gentherapie

Schematische Darstellung der ex vivo-Gentherapie 

1. Isolierung genetisch defekter Zellen 

des Patienten 

2. Vermehrung der isolierten Zellen in vitro 

3. Transfektion der Zellen mit einem 

therapeutisch wirksamen Genkonstrukt 

4. Selektion, Vermehrung und Testen der 

transfizierten Zellen 

5. Wiedereinführung der transfizierten 

Zellen in den Patienten durch 

Transplantation und Transfusion

Schematische Darstellung der in vivo-Gentherapie

Schematische Darstellung der in vivo-Gentherapie 


direktes Einbringen eines Genes in die Zellen ein 

bestimmten Gewebes, ohne daß diese dem 

Patienten vorher entnommen werden müssen 

• bereits durchgeführt an Hirntumoren von Ratten 

(Injektion von Retrovirusvektoren mit HSV- 

Thymidinkinase; nach 5 Tagen Gabe von 

Ganciclovir): in 11 von 14 Fällen komplette 

Rückbildung der Tumoren 

⇒ “molekulare Chirurgie” 

• z. Zt. Genehmigungsverfahren für Erprobung an 

Patienten mit inoperablen Hirntumoren im 

Endstadium

Einsatz einer viralen Thymidinkinase zur 

enzymatischen Giftung von Ganciclovir 

– verwendetes Enzym: Thymidinkinase aus Herpessimplex-Viren 

(HSV) 

– Ganciclovir: prodrug (erst nach Biotransformation akt 

an sich nicht zytotoxisch)

Antisense-Therapie zur Hemmung spezifischer Gene 

a) Einsatz von antisense-Oligonucleotiden

Antisense-Therapie zur Hemmung spezifischer Gene 

b) Einsatz von antisense-Genen

Formen der somatischen Gentherapie 

) Substitution 

enersatztherapie: das Produkt des eingebrachten Gens substituiert 

ie Funktion eines defekten zellulären Gens 

) Addition 

inzufügen von Genen, die für Proteine kodieren, welche in den 

erapierten Zellen nicht vorkommen 

genetische Immunisierung 

- direkte Injektion von DNA führt zur Expression von Antigenen, die 

eine Immunantwort hervorrufen (mögliches Konzept zur Behandlung 

von Hepatitis C, Influenza sowie Malaria) 

- es ist möglich, die Art der Immunantwort – humoral oder zellulär – 

zu beeinflussen


) Addition 

Tumor-Vakzinierung 

- Einbringen von Genen für Zytokine (IL-2, TNF-α) oder 

koloniestimulierende Faktoren (G-CSF, GM-CSF) in T-Zellen, 

Fibroblasten oder Tumorzellen, um T-Zellen anzulocken, die 

die Tumorzellen eliminieren 

zytotoxische Gentherapie (Suizid-Gentherapie) 

- toxisches Genprodukt bringt Tumorzellen zum Absterben (nur 

sinnvoll, wenn Genprodukt enzymatisch aktiv ist und auch 

benachbarte, nicht transfizierte Tumorzellen abgetötet werden: 

”bystander killing effect”)


) Addition 

Sensibilisierung von Zellen für eine Sekundärtherapie 

a) Ausstatten von Tumorzellen mit Thymidinkinase aus dem 

Herpex-simplex-Virus (HSV); Zellen werden sensibel für 

Ganciclovir-Behandlung 

- mögllicher therapeutischer Ansatz zur Behandlung von AIDS 

b) Übertragen eines Gens für ”Multidrug resistance” (P-Glycoprotein) 

in hämatopoetische Stammzellen 

- gesunde hämatopoetische Stammzellen werden vor hochdosierter 

Zytostatika-Therapie geschützt, die infizierte Zellen eliminiert


) Antisense-Therapie 

omplementäre Oligonukleotide hybridisieren mit der mRNA des 

nerwünschten Gens und verhindern deren Translation 

zur Zeit getestet bei entzündlichen Erkrankungen, viralen Infektionen 

und Tumorerkrankungen (Hemmung von Onkogenen) 

eispiele: 

deregulierte zelleigene Gene wie bcr-abl-Fusionsgen bei der 

chronisch-myeloischen Leukämie 

Gene von Infektionserregern zur Unterbindung des replikativen Zyklus 

wie im Falle von Infektionen mit Cytomegalievirus (CMV) bei AIDS- 

Patienten (in USA bereits zugelassen)

Gentransfersysteme 

Nicht-virale Gentransfersysteme 

ikroinjektion von ”nackter” DNA 

intramuskuläre Injektion von Plasmid-DNA führt zur Aufnahme und 

Expression (ebenfalls möglich in Leber und Schilddrüse) 

iolistische Systeme (”Particle bombardment”, ”Gene gun”) 

DNA wird auf winzige Gold- oder Wolframpartikel aufgezogen und in die 

Zellen ”geschossen” 

a-phosphat-Präzipitation 

DNA (= Polyphosphat-Anion) wird durch Ca 2+ -Ionen mikrodispers auf der 

Zelloberfläche präzipitiert 

anschließende Aufnahme wahrscheinlich durch ATP-abhängige Endozytose 

Effizienz: 10 -3 –10 -5 , nur ex vivo


Nicht-virale Gentransfersysteme 

lektroporation 

durch plötzliche Entladung eines Plattenkondensators, zwischen dem 

sich eine Zellsuspension und die einzubringende DNA befindet, wird 

DNA quasi ”in die Zelle gezogen” 

größere Effizienz, nur ex vivo 

iposomen 

DNA-Aufnahme durch Endozytose 

schützen DNA vor Degradation (in Endosomen ?) 

Targeting möglich durch Ligand/Rezeptor-Systeme (z.B. Transferrin) 

ex vivo- und in vivo-Applikation möglich


virale Gentransfersysteme 

etrovirale Vektoren 

zufällige Integration in das Wirtsgenom: größere Stabilität der 

Transduktion, aber Gefahr der unvorhersehbaren Beeinflussung der 

Aktivität anderer Gene (Aktivierung von Onkogenen oder Inaktivierung 

von Tumorsuppressorgenen durch “insertional mutagenesis”) 

transfizieren nur teilungsaktive Zellen 

denovirale Vektoren 

eingebrachte DNA liegt extrachromosomal vor (auf Plasmiden) und wird 

nicht integriert (weniger stabil) 

transfizieren auch ruhende Zellen (z.B. Epithelzellen der Bronchialmucosa, 

Neuronen, Hepatozyten)

Einsatz von Retroviren zum Gentransfer 

Genkarte eines typischen Retrovirus 

LTR : long terminal repeat (lange terminale Sequenzwiederholung) 

ψ + 

: Signalsequenz für Verpackung 

gag : group specific antigene (virales Capsidprotein) 

pol 

: Reverse Transkriptase, Integrase 

env : virales Hüllprotein


benszyklus eines Retrovirus 

fektion einer Wirtszelle 

roduktion einer DNA-Kopie mit Hilfe der Reversen Transkriptase 

m Virion enthalten) 

ransport viraler DNA in den Zellkern 

inbau der viralen DNA in das Wirtsgenom (an ± zufälliger Stelle im Chromoso 

ranskription der viralen DNA in mRNA (starker Promotor in 5‘-LTR) 

ranslation der Proteine Gag, Pol und Env im Cytoplasma 

roduktion des Capsids, Beladen mit zwei RNA-Strängen sowie einigen 

olekülen der Reversen Transkriptase 

reisetzung von Virionen in das umgebende Medium


erstellen eines Retrovirusvektors 

Klonierung einer vollständigen Retrovirus-RNA in ein Plasmid 

Entfernen der Gene gag, pol und env 

5‘- und 3‘-LTR sowie ψ + bleiben erhalten 

Klonierung eines therapeutischen menschlichen Gens (bis 8 kb) neben 5‘-LT 

(Transkription wird durch 5‘-LTR-Promotor gesteuert) 

Einbringen eines selektierbaren Markers mit eigenem Promotor 

pische Genkarte eines Retrovirusvektors


insatz von Verpackungszellinien 

enthalten im Genom nur Fragmente des ursprünglichen Genoms ohne 

funktionstüchtige Verpackungssequenz ψ + (∆ψ) 

produzieren nur leere Hüllen 

nach Transfektion mit Retrovirusvektor-DNA entstehen intakte Viruspartikel 

(mit Retrovirusvektor-DNA), die Wirtszellen effektiv infizieren 

ontrolle notwendig, ob 

transduzierte Zellen das therapeutische Genprodukt synthetisieren 

keinereplikationsfähigen Retroviren produziert werden 

Vermehrungseigenschaften sowie normale Zellfunktionen der Zielzellen 

nicht gestört sind

Einsatz von Retroviren zum Gentransfer

Einsatz von Retroviren zum Gentransfer



etrovirale Vektoren 

zufällige Integration in das Wirtsgenom: größere Stabilität der 

Transduktion, aber Gefahr der unvorhersehbaren Beeinflussung der 

Aktivität anderer Gene (Aktivierung von Onkogenen oder Inaktivierung 

von Tumorsuppressorgenen durch “insertional mutagenesis”) 

transfizieren nur teilungsaktive Zellen 

denovirale Vektoren 

eingebrachte DNA liegt extrachromosomal vor (auf Plasmiden) und wird 

nicht integriert (weniger stabil) 

transfizieren auch ruhende Zellen (z.B. Epithelzellen der Bronchialmucosa, 

Neuronen, Hepatozyten)



denovirus-abgeleitete Vektoren 

adenoassoziierte Viren (AAV): Parvoviren, sind abhängig von Helferviren 

(Adeno- oder Herpesviren) 

zwischenzeitlich latent in Chromosom 19 integriert 

können Zellen des Blutes bzw. des blutbildenden Systems infizieren, 

sind aber nicht humanpathogen 

Zukunft: 

künstliche Chromosomen (artificial chromosomes) 

adenovirale Vektoren ohne virale Gene (”gutless adenovirus”) 

idealer Fall: exakter Austausch des defekten durch das korrigierte Gen 

(bislang technisch nicht machbar)

Übersicht über genehmigte Studien in Deutschland 

Anzahl der Studienanzeigen 

pro Jahr 

Art der Erkrankung oder 

Anwendungsform 

Anzahl 

1994: 2 

1995: 4 

1996: 7 

1997: 7 

1998: 8 

1999: 11 

2000: 10 

2001: 4 

2002: 2 

Krebs (Immuntherapie) 21 

Krebs (Nicht-Immuntherapie) 17 

Infektion (alle HIV) 5 

Monogene Erbkrankheit 1 

Kardio-vaskuläre Erkrankungen 5 

Marker-Gentransfer 5 

rheumatoide Arthritis 1 

Quelle: 

(Stand Juni 2003) 

Paul-Ehrlich-Institut 

Bundesamt für Sera und Impfstoffe


Phase der klinischen 

Prüfung/ Heilversuch 

Anzahl 

Phase I oder I/II 40 

Phase II oder II/III 9 

Phase III 4 

Heilversuch 2 

Art des Gentransfers 

Anzahl 

ex vivo 25 

in vivo 30 

Quelle: 

• Vorlagen gemäß § 40 AMG beim Paul-Ehrlich-Institut 

• Studien-Anträge bei der Kommission Somatische Gentherapie 

des Wissenschaftlichen Beirates der Bundesärztekammer (KSG-BÄK) 

• Gentherapie-Register der Deutschen Arbeitsgemeinschaft Gentherapie


rt des Vektors bei 

-vivo-Verfahren 

Anzahl 

Art des Vektors bei 

in-vivo-Verfahren 

Anzahl 

ko-retroviral 12 

cht viral, (komplexierte 

NA = verpackt) 12 

cht viral, nackt 1 

Paul-Ehrlich-Institut 

ndesamt für Sera und Impfstoffe 

Verpackungszellen 

(onko-retroviral) 2 

adenoviral (replikationsinkompetent) 

13 

Orthopoxviren (repl. inkompetent, 

z.B. MVA, ALVAC o.ä.) 5 

Orthopoxviren (replikationskompetent, 

z. B. Vaccinia) 2 

nicht -viral, verpackt 4 

Nukleinsäure, unverpackt 

(“naked nucleic acid”) 4

Ausblick 

itische bzw. im Einzelfall zu klärende Fragen: 

elche Zellen eignen sich als Target für eine Gentherapie? 

ie gelangt die funktionsfähige Genkopie für den Patienten in diese Zellen? 

ie viele Zellen müssen modifiziert werden, um die Krankheit zu kurieren? 

uß die Transkription des eingeschleusten Gens reguliert sein? 

ann eine Überexpression des Gens zu Problemen führen? 

leibt das eingeschleuste Gen oder die Zelle lebenslang funktionstüchtig? 

leibt die eingebrachte DNA in der Zelle oder kommt es zu einer 

nachträglichen Übertragung auf andere Zellen?

Ausblick 

inzwischen erste vorliegende Phase III-Studien 

kein Anlaß zu übertriebenen Hoffnungen 

bisherige Ansätze nicht besonders effektiv, sicherlich aber eine Therapieform 

der Zukunft 

generell wiederkehrendes Problem: mangelnde Effizienz bei der Transfektion 

erste Erfolge bei Tumorbehandlung mit Blutstammzellen sowie Inselzell- 

Transplantation bei fortgeschrittenem Diabetes mellitus 

in den USA und in Europa wurden vor kurzem alle klinischen Studien aufgrun 

von Todesfällen suspendiert, inzwischen aber unter verschärften Kontrollen 

wieder aufgenommen 

inzwischen erster Hinweis auf Entstehung eines Leberkarzinoms nach 

Verwendung lentiviraler Vektoren

Biotransformation durch Mikroorganismen 

Substanzproduktion für pharmazeutisch verwendete Produkte 

erfolgt durch 

• chemische Totalsynthese (z. B. Chloramphenicol) 

• Isolierung von Naturstoffen (z. B. Digitoxin) 

• Partialsynthese (z. B. Penicilline, Taxol) 

• Biokonversion (z. B. β-Methyldigitoxin in β-Methyldigoxin) 

• Biotransformation (z. B. Steroidhydroxylierung durch 

Mikroorganismen)

Biotransformation durch Mikroorganismen 

Vorteile der Biotransformation 

• hohe Regio- und Stereospezifität bei Einführung von Substituente 

• umweltschonende Verfahren 

Anwendung von Biotransformationen bei 

• Steroiden 

• Antibiotika 

• Kohlenhydraten 

• Alkaloiden

Strategie bei Biotransformationsreaktionen 

nicht Ersatz für gut etablierte chemische Verfahren, da der 

Entwicklungs- und Optimierungsaufwand größer ist als bei 

chemischen Reaktionen 

Auffindung geeigneter Mikroorganismen durch Screening von 

Stammsammlungen oder Wild-Proben 

Untersuchung und Optimierung der wichtigsten Faktoren zur Bildung 

der gewünschten Enzyme und zu ihrer Regulation 

Ausarbeiten eines Fermentationsverfahrens unter Prüfung einer 

Vielzahl von biologischen, physikochemischen und technischen 

Parametern

Strategie bei Biotransformationsreaktionen 

konomie der Biotransformation ist abhängig von 

einer guten Produktausbeute bei guter Stoffbilanz (d. h. geringe Verluste an 

Ausgangs- und Endprodukt) 

niedrigen Rohstoffkosten (Nährlösung und Extraktionsverfahren) 

geringen Arbeitsvolumina in möglichst kurzer Zeit 

effizienter In-Prozeß-Kontrolle 

Beispiel: bei einem Wert von 0,01€ pro mg Substrat und einer 

Substanzkonzentration von 1 g pro L enthält ein 50 m 3 -Fermenter 

einen Substanzwert von 500.000 €

ichtige Reaktionstypen bei mikrobiellen Stoffumwandlungen

Auswahl häufig eingesetzter Mikroorganismen 

für mikrobielle Stoffumwandlungen

Industrielle Synthese von Ascorbinsäure

Industrielle Synthese von Ascorbinsäure 

mwandlung von D-Sorbit in L-Sorbose erfolgt durch Acetobacter suboxydans 

le anderen Schritte erfolgen chemisch

Hydroxylierungsreaktionen an Steroiden 

18 

2 

1 

19 

10 

11 

9 

8 

12 

13 

14 

17 

15 

16 

biotechnisch mögliche 

Hydroxylierungen 

in α-Position 

in β-Position 

3 

4 

5 7 

6 

durch Monooxygenasen katalysierte Hydroxylierungen: 

C H + O 2 + NAD(P)H + H + C OH + H 2 O + NAD(P) +

Hydroxylierungsreaktionen an Steroiden 

18 

3 

2 

4 

1 

19 

11 

10 

9 

6 

5 7 

8 

12 

14 

13 

17 

16 

15 

H 

tertiäre C-Atome lassen sich chemisch gut oxidieren (Orientierung des 

Substituenten ergibt sich durch Steroidgerüst; regiospezifische Reaktion 

erforderlich!) 

sekundäre C-Atome können prinzipiell entweder in α- oder β-Stellung oxidier 

werden (regio- und stereospezifische Reaktionen erforderlich)

Partialsynthese von Steroiden 

H 

O 

H 

H 

O 

H 

H 

H 

H 

H 

HO 

Stigmasterin 

Diosgenin 

usgangsstoffe: leicht zugängliche Naturstoffe wie Diosgenin (aus Yamswurze 

ioscorea composita) oder Stigmasterin (aus Sojabohnen, Kokosfett oder 

ckerrohr-Wachs) 

ster Schritt meist Hydrolyse der glykosidisch gebundenen Zucker

Partialsynthese von Steroiden 

O 

HOH 2 C 

O 

OH 

H 

H 

H 

H 

H 

H 

O 

O 

Progesteron 

11-Desoxycortisol 

(Substanz S) 

schließend chemische Umwandlung (oxidativer Abbau) zu Zwischenprodukte 

Progesteron oder 11-Desoxycortisol (Reichsteins Substanz S)

Hydroxylierung in 11α-Stellung 

O 

O 

HO 

H 

Aspergillus 

H 

H 

H 

H 

H 

O 

O 

Progesteron 

11α-Hydroxyprogesteron 

• Rhizopus- undAspergillus-Arten sind in der Lage, Progesteron regio- und 

stereospezifisch in 11-α-Stellung zu hydroxylieren 

• Entwicklung des Verfahrens bereits 1952: Durchbruch bei der 

Kommerzialisierung von Nebennierenrinden-Hormonen


O 

O 

HOH 2 C 

HO 

O 

HO 

O 

H 

chemisch 

H 

chemisch 

H 

H 

H 

H 

H 

H 

H 

O 

O 

α-Hydroxyprogesteron 

11-Ketoprogesteron 

Cortisol 

nschließende Reaktionsschritte verlaufen chemisch, wobei zunächst an C-11 

xidiert, dann stereospezifisch reduziert, und anschließend an C-17 und C-21 

ydroxyliert wird


O 

O 

HOH 2 C 

HO 

HO 

O 

H 

Aspergillus 

H 

chemisch 

H 

H 

H 

H 

H 

H 

H 

O 

O 

Progesteron 

11α-Hydroxyprogesteron 

Cortisol 

⇒ letztendlich wird die erhaltene Chiralität an C-11 umgekehrt

11β-Hydroxylierung bzw. Einführung einer Ketogruppe 

HOH 2 C 

O 

HO 

OH 

H 

H 

H 

HOH 2 C 

H 

O 

OH 

Curvularia 

lunata 

O 

Cunninghamella 

blakesleana 

H H 

Cortisol 

O 

H 

HOH 2 C 

O 

OH 

O 


(Substanz S) 

O 

H 

H 

Cortison 

• direkte 11β-Hydroxylierung ist möglich mit Hilfe von Curvularia lunata 

• Synthese von Cortison wird durchgeführt durch Oxidation mit 

Cunninghamella blakesleana (wahrscheinlich über 11-Hydroxyderivat als 

Zwischenstufe)

Einführung einer Doppelbindung 

HOH 2 C 

O 

HOH 2 C 

O 

HO 

OH 

HO 

OH 

H 

H 

Corynebacterium 

H 

H 

simplex 

H 

H 

O 

Cortisol 

Prednisolon 

die bakterielle Einführung einer Doppelbindung zwischen C-1 und C-2 ist alle 

chemischen Methoden bei weitem überlegen 

besonders geeignet: Corynebacterium (bzw. Arthrobacter) simplex 

Prednisolon hat ähnliche physiologische Wirkungen wie Cortisol, ist aber 

therapeutisch viel wirksamer 

dieser Prozeß hat erhebliche kommerzielle Bedeutung

Seitenkettenabbau und Reduktion 

O 

O 

H 

Penicillium lilacinum 

H 

H 

H 

Gliocladium catenulatum 

H 

H 

O 

Progesteron 

Androsten-3,17-dion 

oxidativer Abbau der Seitenkette von Progesteron liefert Androsten-3,17-dion 

einen wichtigen Ausgangsstoff zur Synthese männlicher Sexualhormone 

verwendete Mikroorganismen: Penicillium, Gliocladium, Mycobacterium, 

Corynebacterium spp.

Seitenkettenabbau und Reduktion 

O 

OH 

H 

Saccharomyces sp. 

H 

H 

H 

> 90 % Ausbeute 

H 

H 

O 

O 


Testosteron 

stereospezifische Reduktion an C-17 ist möglich durch Saccharomyces sp. 

in hoher Ausbeute

Androsten-3,17-dion als Ausgangsstoff zur Synthese 

von Steroiden mit verschiedenen Wirkungen 

OH 

H 

H 

H 

O 

O 

Testosteron 

(androgen) 

O 

O 

H 

H 

H 

H 

H 

H 

O 

O 

SCH 3 


OH 

C 

CH 

Spironolacton 

(diuretisch) 

H 

H 

H 

O 

Dimethisteron

Aromatisierung 

O 

HOH 2 C 

H 

H 

H 

H 

Nocardia restrictus 

H 

H 

19-Hydroxycholesterinacetat 

HO 

Estron 

• vollständige Aromatisierung des Ringes A ist ebenfalls möglich 

• Nocardia restrictus ist in der Lage, zwei Dehydrierungen mit zwei 

Seitenketten-Abspaltungen zu verbinden

Aromatisierung 

O 

HOH 2 C 

H 

H 

H 

H 

Nocardia restrictus 

H 

H 

19-Hydroxycholesterinacetat 

HO 

Estron 

• im einzelnen laufen dabei die folgenden Reaktionen ab: 

1) Bildung einer Doppelbindung (∆ 1,2 ) 

2) Hydrolyse und Dehydrierung an C-3 unter Bildung der Ketoverbindung 

3) oxidative Abspaltung von C-19 mit Umlagerung von ∆ 5,6 zu ∆ 5,10 

4) Keto-Enol-Umlagerung zum aromatischen Ring 

5) oxidative Abspaltung der Seitenkette an C-17

Verwendung von immobilisierten Zellen 

HOH 2 C 

O 

HOH 2 C 

O 

HOH 2 C 

OH 

HO 

OH 

HO 

H 

H 

H 

H 

H 

11β-Hydroxylierung 

Curvularia 

lunata 

O 

H 

H 

∆ 1 -Dehydrierung 

Arthrobacter 

simplex 

O 

H 

H 


(Substanz S) 

Cortisol 

Prednisolon 

oren von Curvularia lunata werden in photovernetzbares Harz einpolymerisier 

ch Inkubation in einem Nährmedium entstehen lebende Mycelien mit hoher 

β-Hydroxylierungsaktivität 

rennt davon werden lebende Zellen von Arthrobacter simplex ebenfalls in ein 

l immobilisiert 

de Gele werden hintereinander für die Reaktion eingesetzt 

Gele sind bei guter Ausbeute 25 Tage ohne Aktivitätsverlust für die Umwand 

n 11-Desoxycortisol zu Prednisolon einsetzbar

Weitere Beispiele für Biotransformationen 

a) Antibiotika 

OH 

H 

H 

N(CH 3 ) 2 

OH 

Curvularia 

lunata 

OH 

H 

H 

N(CH 3 ) 2 

OH 

OH O OH O 

12-Desoxytetracyclin 

CONH 2 

OH 

OH O OH O 

Tetracyclin 

CONH 2

Weitere Beispiele für Biotransformationen 

b) Alkaloide 

N 

H 

H 

N 

H 

Streptomyces sp. 

H 

H 3 COOC 

OH 

18α-Hydroxyyohimbin 

OH 

N 

H 

H 

H 

N 

H 

HO 

Pilze (Phycomyceten, Ascomyceten) 

N 

H 

H 

N 

H 3 COOC 

H 

Yohimbin 

OH 

H 3 COOC 

10-Hydroxyyohimbin 

O

DNA-Sequenzierung nach Sanger: 

Didesoxynukleotidmethode 

2‘,3‘-Didesoxy-CTP 

2‘-Desoxy-CTP 

Prinzip: wird ein Didesoxynukleotid (z. B. ddCTP) am Ende einer 

wachsenden DNA-Kette eingebaut, kommt die DNA-Synthese 

zum Stillstand, da keine weitere Verknüpfung zusätzlicher 

Nukleotide stattfinden kann

Kettenabbruch: 

DNA-Sequenzierung nach Sanger: 

Didesoxynukleotidmethode

Ablauf der DNA-Sequenzierung nach Sanger

Ablauf der DNA-Sequenzierung nach Sanger 

1) Sequenzierung beginnt mit der Anlagerung eines Primers 

(synthetischer Oligonukleotidstrang von ca. 15 - 25 Nukleotiden 

Länge) an die zu sequenzierende DNA 

2) Anlagerung des Primers ist Voraussetzung für DNA-Synthese durch 

DNA-Polymerase 

3) Reaktion findet parallel in vier Reaktionsgefäßen statt; jedes Gefäß 

enthält alle vier dNTPs (eines davon ist radioaktiv markiert) sowie ein 

Didesoxynukleotid (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddGTP) 

4) molares Verhältnis dNTP:ddNTP ist ca. 200:1, damit Kettenabbruch 

statistisch verteilt an jeder Stelle der wachsenden DNA-Kette 

stattfinden kann 

5) nach Beenden der DNA-Synthese enthält jedes Reaktionsgefäß 

DNA-Bruchstücke unterschiedlicher Länge, die aber alle jeweils mit

Ablauf der DNA-Sequenzierung nach Sanger

Ablauf der DNA-Sequenzierung nach Sanger 

6) synthetisierte DNA-Stränge werden durch denaturierende 

Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt; die 

Auflösung ist so hoch, daß DNA-Moleküle getrennt werden 

können, die sich in der Länge nur durch ein einziges Nukleotid 

unterscheiden 

7) die Sequenz der Nukleotide wird durch Reihenfolge der Banden 

im Autoradiogramm bestimmt (je kürzer, desto schneller 

wandernd) 

⇒ maximal mögliche Auflösung: ca. 1000 bp 

⇒ größere DNA-Abschnitte können mit Restriktionsendonukleasen 

(möglichst überlappend) gespalten werden

Verbesserte Markierungsverfahren 

⇒ Ersetzen der radioaktiven Markierung durch Fluoreszenzfarbstoffe 

⇒ Nachweis durch spezifische Anregung mit Laserstrahlen 

Einführung fluoreszierender Marker 

a) markierte Primer 

b) markierte dNTPs 

c) markierte ddNTPs 

‣ durch Einsatz verschiedener Farbstoffe mit unterschiedlichen 

Absorptionscharakteristika (Fluorescein, Texas Red, 

Tetramethylrhodamin und NBD) ist es möglich, die Sequenzierung 

auf einen einzigen Ansatz zu beschränken

Einfluß der Pyrophosphatase 

mit 

ohne

Online-Detektionssysteme 

• ermöglichen vollautomatische 

DNA-Sequenzierung 

• spezieller Scanning-Mechanismus: 

Lasergestützter Detektor gekoppelt 

an vertikale Gelelektrophorese- 

Apparatur 

• ortsaufgelöstes wird durch 

zeitaufgelöstes Bandenmuster 

ersetzt

Cycle-Sequencing mit thermostabilen DNA-Polymerasen 

• Prinzip ähnlich wie PCR 

• gleichzeitige Amplifikation und 

DNA-Sequenzierung 

• es wird nur ein Primer 

eingesetzt, deshalb nur eine 

lineare und keine exponentielle 

Amplifikation 

• thermisches Profil 

(Primerdenaturierung, 

Primerhybridisierung, DNA- 

Synthese) wird ca. 30 mal 

durchlaufen

Sequenzierungsprofil einer Amplitaq-FS-katalysierten 

Cycle-Sequencing-Reaktion

Doublex-DNA-Sequenzierung 

• Unterschied zu Cycle- 

Sequencing: mehrere Primer 

gleichzeitig 

• Amplifikation ist eher 

exponentiell als linear 

• thermisches Profil 

(Primerdenaturierung, 

Primerhybridisierung, DNA- 

Synthese) wird ca. 30 mal 

durchlaufen

Vollautomatische Sequenziermaschine

Vollautomatische Sequenziermaschine

Chemische DNA-Synthese 

Grundvoraussetzung: Festphasen-Synthese + Schutzgruppenchemie 

⇒ Reaktanden sind immobilisiert an Trägermaterialien; das jeweils 

reaktive Zentrum wird in jedem Schritt erst entschützt 

matrixgebundene Oligonukleotid-Synthese: 

1) Abspaltung der Dimethyltrityl-Schutzgruppe am 5‘-Ende


2) Kopplung an die 

3‘-Phosphoramidit-Gruppe 

des nächsten 

Desoxyribonukleosids


3) Acetylierung (“capping”) der 

nicht abreagierten 5‘-Enden


4) Oxidation der Phosphitzur 

Phosphat-Funktion 

• Zykluszeit: < 40 min 

• bis 80 Zyklen möglich 

• Kosten: ca. 1 € pro Nukleotid

Anwendung von synthetischen RNA/DNA- 

Oligonukleotiden 

Gewinnung von (spezifischen) Primern für DNA-Sequenzierung oder PCR 

• Länge: meist 17 (bis 28) Nukleotide 

• mit Hilfe des Computers können Sequenzen in Zielgenen gefunden 

werden, die für eine bestimmte Spezies spezifisch sind 

• Analyse von konservierten Genabschnitten für die Erstellung 

molekulargenetischer Stammbäume 

• oft herangezogen: 16S-rRNA (bei Prokaryoten) oder 18S-rRNA (bei 

Eukaryoten) für die molekulare Taxonomie

Anwendung von synthetischen RNA/DNA- 

Oligonukleotiden 

RNA-Hybridisierungstechniken zum Nachweis von Bakterien in 

biologischem Material 

fluorescence in situ hybridization (FISH) 

Prinzip: an einen Fluoreszenzfarbstoff gekoppelte Oligonukleotide (Sonde) 

hybridisieren mit verschiedenen 16S-rRNA-Spezies und erlauben 

so einen in situ-Nachweis von Bakterien ohne vorherige 

Kultivierung

Wichtige Produzenten von Antibiotika 

• Gesamtmarktvolumen der Antibiotika 1990 ca. 3 Mrd. US$

Optimierung der Syntheseleistung von Antibiotikaproduzierenden 

Stämmen

Typischer Verlauf der Antibiotika-Produktion während 

der Fermentierung 

• Antibiotika-Produktion tritt häufig erst in der Idiophase auf

Typischer Verlauf der Antibiotika-Produktion während 

der Fermentierung 

• in vielen Fällen ist die Antibiotika-Produktion mit 

morphologischen Veränderungen gekoppelt (Beispiel: Bacillus sp.)

Mechanismus der wachstumsphasen-abhängigen 

Aktivierung von Genen des Sekundärstoffwechsels 

formen der RNA-Polymerase: α-, β- und β‘-Untereinheiten werden konstitutiv 

primiert, verschiedene δ-Untereinheiten nur in bestimmten Wachstumsphase

Operonmodell der Regulation der Transkription 

• oft zusätzlich Katabolitrepression (Beispiele: Glucose bei Penicillinen,

Strategien zur Herstellung und Selektion 

hochproduktiver Mutanten 

• Beseitigung von “Flaschenhälsen” in derIntermediat- (Präkursor-) 

Bereitstellung für die gewünschten Biosynthesewege



• Beseitigung von Faktoren, die reprimierend auf die Genexpression oder 

die Vorstufenbildung einwirken, z. B. 

a) Verhindern von Katabolitrepression 

b) Förderung erhöhter Enzymspiegel an Synthetasen



• Unempfindlichkeit des Produzenten gegen das eigene Antibiotikum 

(z. B. durch Einfügen von Resistenzgenen, Transportproteinen) 

• Verhindern der negativen Feedback-Regulation durch die gebildeten 

Sekundärstoffe

Biochemie und Molekularbiologie der Biogenese von 

β-Lactam-Antibiotika 

• erster Schritt: Bildung eines Tripeptids (LLD-ACV) nach dem 

Thiotemplat-Mechanismus 

• Zyklisierung durch Isopenicillin N-Synthase 

• an dieser Stelle Verzweigung der Biosynthesewege zu den 

Penicillinen und den Cephalosporinen 

• Bildung von Penicillin N durch Epimerisierung in der Seitenke 

• Ringerweiterung durch Expandase 

• Hydroxylierung und Acetylierung führt schließlich zum 

Cephalosporin C 

⇒ Anwendung: z. B. Überexpression der Isopenicillin N-Syntha

Biotechnologische Penicillin-Synthese 

L-α-Aminoadipinsäure + L-Cystein + L-Valin 

δ(L-AAA) - L-Cys - D-Val 

HOOC 

H 

N 

H 

H 

S 

CH 3 

NH 2 

O 

N 

CH 3 

O 

COOH 

Isopenicillin N

Biotechnologische Penicillin-Synthese 

HOOC 

H 

N 

H 

H 

S 

CH 3 

NH 2 

O 

N 

CH 3 

O 

COOH 

Isopenicillin N 

Acyltransferase 

Penicillin-Amidase 

H 

N 

H 

H 

S 

CH 3 

H 2 N 

H 

H 

S 

CH 3 

O 

O 

N 

COOH 

CH 3 

chemische 

Spaltung 

O 

N 

COOH 

CH 3 

Penicillin G 

O 

H 

N 

H 

H 

S 

CH 3 

6-Aminopenicillansäure 

Ausgangstoff für partialsynthetische 

Penicilline 

O 

N 

O 

Penicillin V 

COOH 

CH 3 

Präkursordirigierte Biosynthese

Gentechnische Gewinnung von 7-ACA 

NH 2 

O 

O 

H 

N 

O 

Cephalosporin C 

O 

H 

N 

O 

H 

H 

H 

N 

H 

N 

S 

COOH 

S 

COOH 

Keto-AD-7-ACA 

Carboxy-5-oxopentanamido)-cephalosporansäure 

H 2 N 

O 

H 

H 

N 

S 

COOH 

O CH 3 

7-ACA 

7β-Aminocephalosporansäure 

D-Aminosäure-Oxidase 

Cephalosporin-Acylase 

O 

1 

2 

O CH 3 

O 

O CH 3 

O 

• 7-Aminocephalosporansäure ist ein 

wichtiger Ausgangsstoff zur 

Herstellung von partialsynthetischen 

Cephalosporinen 

• bislang wurde allerdings noch kein 

Mikroorganismus entdeckt, der 7-ACA 

synthetisiert 

• Cephalosporin C wird durch 

Acremonium chrysogenum erzeugt 

• in den Produzenten (Pilz) wurden zwe 

heterologe Gene übertragen: 

1) D-Aminosäure-Oxidase (aus dem 

Pilz Fusarium solani) 

2) Cephalosporin-Acylase (aus 

Pseudomonas chrysogenum)

O 

OH 

Reaktivierung „stummer“ Gene 

HO 

(H 3 C) 2 N CH 3 

N 

O 

O 

OH 

O 

CH 3 

OH 

H 3 C 

CH 3 

OH 

O 

OH 

Indolizomycin 

Iremycin 

N 

H 3 C 

O 

CH 3 

OH 

O 

H 3 C CH 3 

N 

H 

Curromycin B 

OH 

CH 3 H 3 CO O 

HO 

H 3 C 

O 

N 

O 

CH 3 

CH 3 

• Grund: Expression von vorher “stummen” Genen infolge Aktivierung

O 

OH 

Reaktivierung „stummer“ Gene 

HO 

(H 3 C) 2 N CH 3 

N 

O 

O 

OH 

O 

CH 3 

OH 

H 3 C 

CH 3 

OH 

O 

OH 

Indolizomycin 

Iremycin 

N 

H 3 C 

O 

CH 3 

OH 

O 

H 3 C CH 3 

N 

H 

Curromycin B 

OH 

CH 3 H 3 CO O 

HO 

H 3 C 

O 

N 

O 

CH 3 

CH 3 

• beobachtet nach Regeneration von Protoplasten oder Entfernung von

Mutasynthese und Hybridbiosynthese 

• Mutasynthese (mutational biosynthesis): 

Kulturen idiotropher Mutanten (Blockmutanten) werden strukturelle Analo 

von Biosyntheseintermediaten (Mutasynthons) als Ersatz für den


• Mutasynthese (mutational biosynthesis): 

– klassisches Beispiel: Bildung von Hybrimycinen in S. fradiae durch 

Füttern von synthetischen Zuckern


• Hybridbiosynthese: im Prinzip ähnlich, nur wird kein synthetisches 

Mutasynthon, sondern ein “biogenes” Mutasynthon einer anderen Art bzw 

eines anderen Stammes (ebenfalls Blockmutante) verwendet


• Hybridbiosynthese: 

– Beispiel: Bildung von Chimeramycinen durch S. ambofaciens


Ziel: Gewinnung von neuen Antibiotika (“non-natural natural products”) mit 

verbesserten Eigenschaften

Mutasynthese: Bildung von Hybrimycinen 

2-Desoxystreptamin-negativen Mutanten von Streptomyces fradiae wurden 

totalsynthetische Zucker wie Streptamin oder Epistreptamin zugesetzt 

Mutasynthons werden von den entsprechenden Enzymen als Substrat akzep 

und anstelle der “natürlichen” Zucker eingebaut

Mutasynthese: Bildung von Hybrimycinen 

• bislang wurden mehr als 40 mutasynthetische Aminoglykoside 

(Hybrimycine und Mutamycine) gewonnen; allerdings zeigte kein Derivat 

verbesserte Eigenschaften

Bildung von Chimeramycinen durch Hybridbiosynthese 

1) Streptomyces ambofaciens (Spiramycinbildner; Biosynthese des


2) Streptomyces fradiae (Tylosinbildner; Aglykon: Protylonolid;


Zugabe von Protylonolid zur Kultur von S. ambofaciens führt zur Bildung

Hybridbiosynthese mit molekulargenetischen Methoden 

N(CH 3 ) 2 

HO 

OH O CH 3 

O 

H 3 C 

O 

O 

H 

OH CH 3 

COOH 

O 

O 

H 

O 

OH 

O 

O 

2 

Medermycin 

Streptomyces sp. AM-7161 

Actinorhodin 

Streptomyces coelicolor 

Einbringen des Actinorhodinbiosyntheseclusters 

aus S. coelicolor 

N(CH 3 ) 2 

HO 

OH O CH 3 

H 3 C 

O 

O 

H 

OH 

O 

H 

O 

Mederrhodin A 

O

Hybridbiosynthese mit molekulargenetischen Methoden 

Dihydrogranatirhodin 

OH OH O CH 3 

O 

H 3 C 

O 

OH 

O 

H 

OH CH 3 

COOH 

O 

OH 

O 

H 

O 

OH 

O 

Granaticin 

Streptomyces violaceoruber 

O 

Actinorhodin 

Streptomyces coelicolor 

2 

Einbringen des Actinorhodinbiosyntheseclusters 

aus S. coelicolor 

OH 

OH O CH 3 

H 3 C 

OH 

O 

O 

COOH 

OH 

O

Prinzip der Herstellung von monoklonalen AntikÃ¶rpern - Pharmazie

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