Flavonole - Pharmazie - Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf

PBIII Praktikumseminar
Phenole & Polyketide
Abdessamad Debbab
Institut für Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie
Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
SS 2011

Definition
• Die Flavonoide sind eine Gruppe von
wasserlöslichen Pflanzenfarbstoffen und
spielen eine wichtige Rolle im Stoffwechsel
vieler Pflanzen.
• Sie gehören zu den Polyphenolen.
OH
HO
O
B
A
C
OH
O

Wirkungen beim Menschen
• Flavonoide
– Protektiv gegen Venenerkrankungen
– Protektiv gegen Erkrankungen des Leberparenchyms
– Spasmolytische Wirkung
– Erhöhte Toleranz von Sauerstoffmangel
– Diuretische Wirkung
• Isoflavonoide
– Schwach östrogen
– Antimikrobielle Wirkung
• Zusätzlich
– antioxidativ
– antiallergisch
– antiphlogistisch
– antiviral
– antiproliferativ / antikarzinogen

Substitutionen der Grundkörper
-OH
-OCH 3
-Zucker
HO
6'
O 1'
1
7 8
2
6
A
C
5 4
5'
4'
B
3'
2'
3
-O-Zucker;
-OH
-OH
-OCH 3
-Zucker
OH
O

Biosynthese von Flavonoiden
OH
3 x
CoAS- OOC
C
CH 2
Shikimisäure- /
Chorisminsäureweg
O
Malonyl-CoA
+
CoAS
O
4-Cumaroyl-CoA
3 CO 2
OH
CoA
O
S
Zyklisiert zu
Trihydroxychalcon
O
HO
A
OH
C
B
OH
O O
Zwischenstufe
Chalcon-
Flavon-
HS-CoA
HO
A
O
C
H
B
OH
OH O
Chalcon
Isomerase
OH
O
Flavanon
(Naringenin)

OH
OH
HO
OH
B
HO
O
H
B
A
C
Chalcon-
Flavon-
A
C
OH
O
Chalcon
Isomerase
OH
O
Flavanon
(Naringenin)
HO
Aus Flavanon;
Dehydrierung
A
OH
OH
B
O
C
3
O
Flavon
(Apigenin)
HO
OH
A
OH
O
O
C 3
2'
1'
Isoflavon
(Genistein)
3'
B 4'
5'
6'
OH
Phenylwanderung
H
O
A
O
C
3
B
OH
HO
A
O
H
C 2 3
H
B
OH
O
OH
Flavonol
(Kämpferol)
Aus Flavanonolen;
Dehydrierung
OH
O
OH
Flavanonol
(Dihydrokämpferol)
Aus Flavanonen; Oxidation
HO
A
O
H
C
3
H
OH
OH Flavanol
(Catechin)
Reduktion Carbonylgruppe
B
OH
OH
HO
A
OH
OH
H B
O
OH
C 3 H
OH
H OH
Flavandiol
(Leucoanthocyanidin)
= Flavan-3,4-diole
HO
A
OH
O
C
OH
B
Anthocyanidin
(Pelargonidin)

Flavonoid-Klassen
C

Flavonoide: Beispiele & Quellen
Flavonoiden Beispiele Vorkommen
Flavonole
Quercetin, Rutin, Kaempferol, Myricetin,
Isorhamnetin
Zwiebeln, Endivien
Flavone Luteolin, Apigenin, Morin Sellerie, Paprika
Flavanole
Catechin, Gallocatechin, Epicatechin,
Epigallocatechingallat, Theaflavin, Thearubigin
Rotwein, Äpfel,
Grüner Tee
Flavanone Hesperetin, Naringenin, Eriodictyol Grapefruit, Orange
Flavanonole Taxifolin Ginkgo
Isoflavonoide Genistein, Daidzein, Licoricidin Sojabohnen
Anthocyanidine
(Anthocyane)
Cyanidin, Delphinidin, Malvidin, Pelargonidin,
Peonidin, Petunidin
Heidelbeeren, blaue
Trauben, Kirschen

Farbreaktionen der Flavonoide
• Wilson-Tauböck-Test
• Chelatbildung mit Aluminiumsalzen
• Reduktion mit Zn / HCl bzw. Mg / HCl
• Reaktion mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin

HO
O
Tauböck-Test
- Fluoreszenzprobe auf Flavonole -
B
OH
A
C
3
OH
OH
O
Flavonol
+ Borsäure
Fluoreszenz bei Tageslicht
+ Oxalsäure gelbgrüne oder blaue
OH
OH
HO
O
HO
O +
O
O
OH
O
B
O
OH
O
B -
O
O
O
O
O
O
O

Chelatbildung mit Aluminiumsalzen
- Photometr. Bestimmung von Flavonen und Flavonolen -
OH
OH
HO
O
HO
O
OH
O
OH
Flavonole
+ AlCl 3
O
OH O
Al
5gliedrige Chelate
Fluoreszenz bei Tageslicht!
OH
HO
A
O
C
3
B
OH
+ AlCl 3
HO
A
O
O
C
O
3
B
OH
O
Flavone
Al
6gliedrige Chelate
Keine Fluoreszenz bei Tageslicht!

Photometr. Bestimmung von Flavonen und Flavonolen
Cl
O
Al
OH
O
OH
O
O
HCl
O O
+
Al
Cl Cl
Fluoreszenz bei Tageslicht +
Cl
O
Cl
+
Al
O
Cl
6gliedrige Chelate
Keine Fluoreszenz bei Tageslicht!
O
Al
OH
O
OH
O
O
O
+
OH O
Al
Cl
Cl
Fluoreszenz bei Tageslicht +
HCl
OH
O
Cl
+
Al
O
Cl
5gliedrige Chelate
Fluoreszenz bei Tageslicht!

Reduktion mit Zn/HCl bzw. Mg/HCl
Shinoda-test
HO
A
O
C
3
R
B
OH
Mg/HCl
Zn/HCl
HO
A
OH
O
OH
3
H
R
B
OH
OH
O
Flavone (R=H) und Flavonole (R=OH)
H +
OH
- H 2 O
HO
O +
R
OH
Anthocyanidin (tiefrot)

Reduktion mit Zn/HCl bzw. Mg/HCl
HO
A
O
C
B
OH
Zn/HCl
HO
A
OH
O
OH
3
H
H
H
B
OH
OH
O
H +
H
OH
- H 2 O
H +
HO
O
OH
Nur, wenn Seitenring
substituiert!
O + H
OH
HO
OH
H
+
HO
OH
H
OH
Polymethinkation
(tiefrot bis violett)
OH

Reaktion mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin
- Nachweis für Flavanone -
OH
HO
A
OH
O
C
O
3
R
B
OH
+ 2,4-Dinitro-
Phenylhydrazin
H 2 SO 4
-H 2 O
HO
A
OH
Gelb
O
N
3
NH
R
B
NO 2
Flavone und Flavonole
geben diese Reaktion nicht!
N
N
+ KOH
NO 2
NO 2
Bathochrome Verschiebung
(Diff. 80-90 nm)
Rot-violett
N + O 2

Flavonoid-Gehaltbestimmung nach DAB
Pulverisierte Droge
Nach Zusatz von 1 ml Methenamin-Lösung mehrmals mit Aceton/Salzsäure
extrahieren (Rückfluss)
Filtrieren
Auffüllen mit Aceton und mit H 2 O verdünnen
Mit EtOAc ausschütteln
Trocknen (Na 2 SO 4 ), auf definiertes Volumen auffüllen
*Aliquoten Teil mit AlCl 3 -Reagenz versetzen + mit MeOH-Essigsäure verdünnen.
*Aliquoten Teil ohne AlCl 3 -Lsg, nur mit MeOH, MeOH-Essigsäure verdünnen
Nach 30 min: Photometrisch vermessen bei 425 nm

Flavonoiddrogen
• Birkenblätter - Betulae folium
- Getr. Blätter von Betula pendula oder
B. pubescens (Betulaceae)
- Förderung der Harnbildung
- Flavonolglykoside
(mind. 1,5 %, Hyperosid, Quercitin u.a., Gehalt
bestimmt als Hyperosid, AlCl 3 )
OH
HO
O
OH
O
R
OH
O
Hyperosid: R = β-D-Galactose

Flavonoiddrogen
Holunderblüten - Sambuci flos
- Getr. Blütenstände von Sambucus
nigra (Caprifoliaceae)
- Schweißtreibend bei fieberhafter Erkältung
- Flavonolglykoside, Ätherisches Öl
(mind. 0.8 %, u.a. Rutin), bestimmt als Isoquercitrin, AlCl 3 )
OH
HO
O
OH
O
R
OH
O
Isoquercitrin: R = β-D-Glucose

Flavonoiddrogen
Mariendistelfrüchte - Cardui marie fructus
- Reife Früchte von Silybum marianum (Asteraceae)
- Bei Verdauungsbeschwerden
Bei toxischen Leberschäden, unterstützend bei
chronisch-entzündlichen Lebererkrankungen, Leberzirrhose
- Silymarin = Flavanonolderivate (3 %, Silybin, Silydianin, Silycristin),
berechnet als Silybin (= Silibinin), HPLC
O
CH 2 OH
HO
O
OCH 3
O
OH
O
OH
Silybin
OH

Gerbstoffe
• Hydrolysierbare Gerbstoffe = Tanninegerbstoffe
• Gallotannine
• Ellagitannine
• Kondensierte Gerbstoffe = Catechingerbstoffe
• Lamiaceen-Gerbstoffe
• Algen-Gerbstoffe

Tanningerbstoffe
• Hydrolysierbare Gerbstoffe
– Gallotannine
Hydrolyse ⇒ Zucker + Gallussäure
HO
- O
O
OH
– Ellagitannine
Hydrolyse ⇒ Zucker + Ellagsäure
OH
Gallsäure
OH
O
O
OH
HO
O
O
OH
El lagsäure

Farbreaktionen der
hydrolysierbaren Gerbstoffe
• Eisen(III)-Salz in alkoholischer Lösung
→ blaue Färbung.
• Bariumhydroxidlösung verfärbt Tanninlösung
grün
• Ellagitannine färben sich mit salpetriger
Säure karminrot, später braungrün bis blau.
• Proteine geben Niederschläge

Catechingerbstoffe
Kondensation, oxidative Verknüpfung / Polymerisation von:
• Catechine
Flavan-3-ole
• Leukoanthocyanidine (monomer)
Flavan-3,4-diole
H
HO
O
R 1
R 1
OH
OH
HO
O
OH H OH
• Proanthocyanidine
• Proanthocyanidine (di- bis polymer)
• Procyanidine
• Procyanidine
H
OH
H
OH
H
OH H OH
R 2
R 2

Farbreaktionen Catechingerbstoffe
• Eisen(III)-Ionen in alkoholischer Lösung
→ grüne Färbung.
• Erhitzen mit Formaldehyd-Salzsäure-Lsg
→ roter Niederschlag
• Wolframatophosphorsäure
→ Reduktion zu Wolframblau bzw. Molybdänblau

Gerbstoffwirkungen
Komplexbildung mit Proteinen
Bindung an Proteine ⇒ Denaturierung
• Adstringierend (reversible Bdg.)
• Gerbend (irreversible Bdg.)
• Bindung an Proteine, Alkaloide, Eisen....

Gerbstoffanwendungen
• Durchfall
• Hämorrhoiden
• Mundspülungen
• Früher auch zur äußerlichen
Behandlung von Wunden
(antimikrobiell, schmerzlindernd)
Hepatotoxisch!!!

Beeinflussende faktoren
• Milieubedingungen
• Struktur
(Gerbstoffmoleküle und Proteine)
• Offene bewegliche Konformation förderlich
• Konzentration der Lösungen

Gerbstoffbestimmung Arzneibücher
• Reduktion von +6-wertigem Wolfram/Molybdat zu +4-
wertigem Wolfram bzw. Molbydän (Mischoxide,
“Wolframblau” + “Molybdänblau”, photometerisch
messbar)
H 3 [P(Mo 3 O 10 ) 4 ] • H 2 O
• Teilung d. Drogenextrakts in 2 aliquote Teile, von denen
einem Casein zugesetzt wird Red. – Gerbstoff fällt aus.
[(Mo 3-X (OH) x ] x = 0-2 BLAU
• Umsetzung beider Lösungen mit Folin-Ciocalteu
Phenolreagens – photometr. Vermessung erlaubt
Differenzbestimmung.
• Bezugsubstanz:
einfaches Phenol (Pyrogallol od. Gallussäure)

Gerbstoffdrogen im Praktikum
Eichenrinde – Quercus cortex
- Quercus robur + Q. petraea (Fagaceae)
- u.a. Entzündungen Zahnfleisch/Mundschleimhaut,
entzündl. Hauterkrankungen, akuter Durchfall
- Oligomere Proanthocyanidine, Ellagitannine
Teeblätter – Theae nigrae folium
- Camellia sinensis (Theaceae),
Schwarzer Tee: fermentierte Teeblätter
- u.a. als Antidiarrhoikum
- Gerbstoffe (Galloylcatechine, Catechine),
Coffein, Theobromin, Theophyllin u.a.

Gerbstoffdrogen im Praktikum
Bärentraubenblätter – Uvae ursi folium
- Arctostaphylos uva-ursi (Ericaceae)
- entzündl. Erkrankungen der ableitenden
Harnwege
- 10-20% Gerbstoffe, Arbutin, Flavonolglykoside u.a.
Chinarinde – Chinae cortex
– Cinchona pubescens, C. calysaya, C. ledgeriana
(Rubiaceae)
– Appetitlosigkeit, Verdauungsbeschwerden, Völlegefühl,
Blähungen
– Gerbstoffe (Catechine + Gallotannine, 4-8%)
Alkaloide (5-15%, Cinchonidin, Cinchonin, Chinin,
Chinidin)
Bitterstoffe

Anthranoide
- 1,8-Dihydroxyanthracenderivate -
OH
O
OH
OH
O
OH
7
8
9
1
2
6
5
10
O
Anthrachinon
4
3
Anthron
OH
OH
OH
OH
O
OH
Anthranol
OH
O
OH
Dianthron

Oxidationsstufen
- Oxidationsgrad am C9 und C10 des Anthracenmoleküls -
OH
O
O
red.
ox.
OH
Anthrahydroxychinon
H
OH
Oxanthron
OH
O
O
Anthrachinon
red.
ox.
Anthranol
O
H
H
Anthron
red.
ox.
O
Dianthron

Substitutionen des Grundkörpers
OH
Zucker
(O-glykosidisch)
OH
R 4
O
OH
CH 3
OCH 3
R 1
R 5
OH
H R 3
R 2
Zucker
(C-glykosidisch)
CH 2
COOH

Die wichtigsten Anthrachinon-Aglyka
OH
O
OH
OH
O
OH
R
CH 3
R
O
O
Emodin R = OH
Chrysophanol R = CH3
Physcion R = OCH 3
Aloeemodin R = CH 2 OH
Rhein
R = COOH

Die wichtigsten natürlich vorkommenden
R
Z
O
Typen von Anthranoiden
O
OH
Anthronglykosid
Z=glykosidisch geb. Zucker
X
R
Z
O
O
O
OH
Anthrachinonglykosid
X
•Frangulae cortex
•Rhamni cathartici
fructus
•Rhei radix
Z
O
O
OH
Z
O
O
OH
•Sennae fructus
•Sennae folium
•Rhei radix
R
R
Dianthronglykosid
Z
O
H
O
H
OH
X
X
R
HOH 2
C
O
OH HO
OH
H
Glukosylanthron
X
•Aloe
•Rhamni purshiani
cortex

Prinzip der Anthranoid-
Gehaltsbestimmung des Arzneibuchs:
1. Hydrolyse der Glykosidbindung (HCl, ∆T)
2. Oxidative Spaltung von Glykosylverbindungen
3. Oxidation zu den Anthrachinonen (FeCl 3 , ∆T)
4. Ausschütteln der freien Aglyka in org. Lösungsmittel
5. Modifizierte Bornträger-Reaktion mit Mg(OAc) 2

Dickdarmwirksame Laxantien
• Anthrachinon- + Dianthronglykoside = „Prodrugs“:
Anthrone = Wirkform
• Wirkung:
– Hemmung der Wasser- und Elektrolytresorption durch
Blockade der Na + /K + -ATP-ase
⇒ gesteigerte Wassersekretion + Elektrolyteinstrom
⇒ Volumenzunahme
⇒ Anregung der Peristaltik
– Hemmen stationäre Kontraktion des Colons
(direkter Angriff an glatter Darmmuskulatur)

Teufelskreis bei längerfristiger Anwendung
=> Nur kurzfristige Behandlung
Defäkationsreflex ( )
Obstipation
Laxantien
K + -Verlust
Na + - und H 2 O-Verlust
Aldosteronsekretion ( )

Anthranoiddrogen im Praktikum
Aloe
• Saft aus angschnittenen Blättern,
eingestellter Aloeextrakt (Aloes extractum siccum normatum) aus
Curaçao-Aloe (Aloe barbadensis), Kap-Aloe (Aloe capensis) od.
Mischung (Xanthorrhoeaceae)
• Stark wirksames
Dickdarmlaxans
• Hydroxyanthracenderivate
(Mind. 19%, Kap-Aloe),
Aloine A und B

Anthranoiddrogen im Praktikum
Faulbaumrinde - Frangulae cortex
• Frangula alnus (Rhamnaceae)
• Obstipation
(Tee / Extrakte)
• Antrachinon-Glykoside
(mind. 6%), u.a.
Glucofrangulin A + B,
Frangulin A + B
• Frische Rinde unverträglich
1 Jahr Lagerung / Erhitzen
Oxidation der Anthrone

Anthranoiddrogen im Praktikum
Rhabarberwurzel - Rhei radix
• Rheum palmatum / R. officinale
(Polygonaceae)
• Eingestellter Rhabarbertrockenextrakt
Rhei extractum
siccum normatum Ph. Eur.
• Obstipation (Tee / Extrakte)
• Antrachinonglykoside,
Dianthronglykoside,
Gerbstoffe, u.a.

Anthranoiddrogen im Praktikum
Sennesblätter – Sennae folium
• Senna C (Caesalpiniaceae) od.
C. angustifolia od. Mischung
• Obstipation (Tee / Extrakte)
• Dianthronglykoside
(Sennoside A-D), Anthrachinonglykoside u.a.
Sennesfrüchte
• Alexandriner-Sennesfrüchte, Sennae fructus acutifoliae,
von S. Salzsäure
Tinnevelly-Sennesfrüchte, Sennae fructus angustifoliae,
von C. angustifolia
• Mind. 3,4 (Alexandriner) bzw. 2,2 % (Tinnevelly) Hydroxyanthracen-
Glykoside, berechnet als Sennosid B, bezogen auf die getrocknete
Droge

Weitere Drogen im Praktikum
Bärentraubenblätter: Emerson-Reaktion

Bärentraubenblätter
- Uvae ursi folium -
OH
8% Hydrochinon-Derivate
(ber. als Arbutin)
Emerson-Reaktion
O
O
HO O
O -
HO
HO
OH
NH 3
K 3 [Fe(CN) 6 ]
Aminopyrazol
N
N
N
N +
O
N
O
N

Weitere Drogen im Praktikum
Javanische Gelbwurz
- Curcumae xanthorrhizae rhizoma
• Curcuma xanthorrhiza (Zingiberaceae)
• Dyspeptische Beschwerden
• Ätherisches Öl (ca. 5%),
Curcuminoid
Wilson-Tauböck-Reaktion

Javanische Gelbwurz
- Curcumae xanthorrhizae rhizoma -
O
O
CH 3 O
OCH 3
Curcumin
HO
1% Dicinnamoylmethan-Derivate,
ber. als Curcumin
Boroxalsäure
(Wilson-Tauböck)
OH
O
O
O
O
O
B
O
O
B -
O
O
O
O
O
CH 3 O
OCH 3
CH 3 O
OCH 3
HO
OH
HO
O + H
Rubrocurcumin

Weitere Drogen im Praktikum
Ammi visnaga-Früchte - Ammeos visnagae fructus
• Ammi visnaga (Apiaceae)
• Angina pectoris,
Koronarinsuffizienz, Altersherz,
Asthma, Keuchhusten u.a.
• Furanochrome (mind. 1% Pyrone,
Khellin), Pyranocumarine,
ätherisches Öl, Flavonoide
Oxoniumsalze γ-Pyrone

Ammi visnaga-Früchte
- Ammeos visnagae fructus -
Mind. 1% γ-Pyrone (Furanochromome: Khellin + Visnagin), ber. als Khellin
OCH 3
OCH 3
O
O
O
O
Mineralsaures
Milieu
OCH 3
Khellin
O
OCH 3
+ O
Gelbes
Oxoniumsalz
H

HPLC
= High Performance Liquid Chromatography
Acetonitril oder Methanol
z.B. RP-18-Material
Wasser/Säure
UV/VIS-DAD
* „Chromatographie“ bezeichnet man einen Trennprozess.
* Probengemisch zwischen zwei nicht miteinander mischbaren Phasen:
- stationäre Phase
- mobile Phase

HPLC
Eluenten
Pumpe
Autosampler
UV/VIS
Detektor
Säule

Pe a k # 1600 %
6 0, 0
%
2 13 . 3
HPLC
Peak 8 Peak 13
Pe a k #1 1
- Auswertung -
6 0 , 0
1 0 0 %
%
2 4 0 . 5
4 0, 0
4 0 , 0
2 0, 0
2 93 . 3
2 0 , 0
5 65 . 6
5 63 . 4
- 10 , 0
n m
2 0 0 3 00 4 00 5 00 5 95
Extinktion
- 1 0 , 0
n m
2 00 3 0 0 4 00 5 0 0 5 9 5
600 AP050816 #2 E4aI UV_VIS_3
mAU
WVL:280 nm
13
400
200
8
1 2
3
4
5
6 7 8
9
10 11
12
13
14
-50
min
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0
15
Retentionszeit
16 17

HPLC
- Quantifizierung –
Externer Standard
Untersuchte Probe
45,0
PBIII070509 #2 Silibinin RN UV_VIS_1
mAU
WVL:235 nm
2
160
PBIII070509 #3 Mariendistel Extrakt UV_VIS_1
mAU
WVL:235 nm
12
125
30,0
3
100
8
11
20,0
75
1
14
10,0
50
0,0
1
25
2
3
4
9
6 7
5
10
13
15
16
-10,0
min
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0
-20
min
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0
No. Ret.Time Peak Name Height Area Rel.Area Amount Type
min mAU mAU*min %
1 29,06 n.a. 1,399 1,405 4,79 n.a. BMB
2 32,56 n.a. 42,107 13,650 46,54 n.a. BM
3 33,82 n.a. 30,542 14,275 48,67 n.a. MB
Total: 74,048 29,330 100,00 0,000

HPLC : RP-18
* Nonpolare stationäre Phase (fest Phase).
* Polare Substanzen werden zuerst eluiert

Chirale HPLC
Chirale Chromatographie: Bildung von nichtkovalente Bindungen zwischen
den Enantiomeren und der absorbierenden chiralen stationären Phase.
*Diastereomere Komplexe mit unterschiedlichen
Bindungsaffinitäten
Spiegel

Neue HPLC-Technologie

Viel Erfolg!