Hydrolyse von Harnstoff / Michaelis-Menten-Kinetik - Physikalische ...

Hydrolyse von Harnstoff / Michaelis-Menten-Kinetik 1
Hydrolyse von Harnstoff / Michaelis-Menten-Kinetik
Das Ziel dieses Versuches ist es, die mit dem Michaelis-Menten-Mechanismus verbundene
Kinetik sowie eine Methode zur Bestimmung der Enzymaktivität zu erlernen. Dies soll anhand
der Hydrolyse von Harnstoff unter Katalyse durch das Enzym Urease geschehen. Über
die einfache Michaelis-Menten-Kinetik hinaus sollen außerdem der Einfluss einer Produkthemmung
und des pH-Wertes kennen gelernt werden. Hierbei sind nicht die mathematischen
Einzelheiten der im Anhang aufgeführten Herleitungen (sie sind nur der Vollständigkeit halber
angegeben), sondern die Methodik, mit der aus komplexen Mechanismen Geschwindigkeitsgesetze
abgeleitet werden (Bodensteinsches Quasistationaritätsprinzip) und theoretische
Modelle ausgehend von der einfachsten Annahme durch Verfeinerung mit der Realität abgeglichen
werden.
Stichworte
Kinetik, Reaktionsordnung, Geschwindigkeitskonstante, Reaktionsgeschwindigkeit, Gleichgewichtskonstante,
pH-Wert, Enzym, Enzymaktivität, Leitfähigkeit
Michaelis-Menten-Kinetik
L. Pasteur zitierte in einem Vortrag im April 1864 an der Sorbonne folgenden Ausspruch des
Mediziners und Alchemisten J.B. van Helmont (1577/9 - 1644): "Das reinste Quellwasser
verschimmelt und produziert Würmer, wenn sein Behälter mit dem Duft eines Fermentes imprägniert
wird. Die Gerüche, die aus der Tiefe eines Sumpfes aufsteigen, produzieren Frösche,
Schnecken, Blutegel, Pflanzen usw. Graben sie ein Loch in einen Ziegel, legen sie in
das Loch Königskraut, decken das Loch mit einem zweiten Ziegel zu, lassen sie die zwei Ziegel
an der Sonne! In einigen Tagen erscheint der Geruch des Königskrautes, der, als Ferment
wirkend, die Pflanze in Skorpione verwandelt." Nach dieser mystischen und lückenhaften
Versuchsanleitung ist offenbar die Funktion des Fermentes, die Lebensprozesse in Gang zu
setzen, die zur Bildung der "Skorpione" führen (in der Alchemie steht der Begriff Skorpione
für den Vorgang, wenn aus absterbendem, faulendem Material wieder neues Leben entsteht).
Mit fortschreitender Erforschung der Lebensprozesse wurde der Begriff enger gefasst und
heute ist er synonym mit "Enzym".
Dies sind bestimmte Proteine, deren Aufgabe es ist, spezifische, biochemische Reaktionen zu
katalysieren, was in der Regel unter sehr hoher Substrat- und Produktspezifität geschieht, d.h.,
dass nur ausgewählte Edukte zu ganz bestimmten Produkten umgesetzt werden. Auf diese
Weise vollzieht sich also die geheimnisvolle Steuerung der Lebensvorgänge: durch spezifische
Katalyse. Der entscheidende Schritt ist dabei die Wechselwirkung des Substrats mit dem
so genannten "aktiven Zentrum" des Enzyms, die dafür sorgt, dass die Energie des Über-
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gangszustands, der zu den gewünschten Produkten führt, erniedrigt wird (d.h. nur ein bestimmter
Reaktionsweg wird eingeschlagen).
Die in diesem Versuch untersuchte Reaktion ist die Hydrolyse von Harnstoff,
O
N H 2
NH 2
Urease
+
+ 2 H 2 O
2 NH 4 +
O
O -
O -
(1)
die durch das Enzym Urease katalysiert wird. Zwar taucht das Enzym Urease in obiger Bruttogleichung
nicht auf (hat also keinen Einfluss auf das Gleichgewicht!), dennoch hängt die
Reaktionsgeschwindigkeit entscheidend von der Enzymkonzentration ab. Ein plausibler Mechanismus,
mit der sich die beobachtete Kinetik beschreiben lässt, ist der Michaelis-Menten-
Mechanismus, der sich in seiner einfachsten Form wie folgt darstellt:
U + S
k 1 k 2
US
U + P (2)
k -1
S steht hier für das Substrat, U für Urease und P für die Produkte. Im ersten Schritt wird also
der Enzymsubstratkomplex US mit der Geschwindigkeitskonstanten k 1 gebildet, bzw. zerfällt
mit der Geschwindigkeitskonstanten k -1 wieder in die Edukte. Im zweiten Schritt werden die
Produkte in einer irreversiblen Reaktion von US und Wasser mit der Geschwindigkeitskonstanten
k 2 gebildet (die Konzentration von Wasser bleibt konstant Reaktion pseudo-erster
Ordnung, k 2 =k' 2 [H 2 O] 2 ).
Die entsprechenden Bildungsgeschwindigkeiten der für die Herleitung des Geschwindigkeitsgesetzes
interessanten Spezies ergeben sich dann wie folgt: 1
d[US]
= k1[S][U]
− k
− 1[US]
− k
2[US]
(3)
dt
d[P]
= k
2[US]
(4)
dt
Die Ureasekonzentration lässt sich hierbei nicht einfach aus der einfachen Bedingung
m U /(M U·V) berechnen, da das Enzym je nach Qualität unterschiedlich viele aktive Zentren pro
Molekül besitzt. Die Enzymqualität wird daher umgekehrt durch die mit einer bestimmten
Enzymeinwaage erreichbaren Reaktionsgeschwindigkeit charakterisiert werden.
Die Bildungsgeschwindigkeit v = d[P]/dt der Produkte kann durch Ermittlung von [US] unter
Annahme des Bodensteinschen Stationaritätsprinzips – hierunter versteht man die Annahme,
dass pro Zeiteinheit genauso viel Zwischenprodukt [US] gebildet wird, wie abgebaut wird,
wodurch d[US]/dt gleich 0 wird - und der Substitution
1 zur Aufstellung von Geschwindigkeitsgesetzen für einzelne Elementarschritte chemischer Reaktionen s. Lehrbücher
der Physikalischen Chemie, z.B. P.W. Atkins, Physikalische Chemie, 2. Aufl. Weinheim 1996, Kap. 25
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bestimmt werden.
[ U] = [U] − 0
[US] (5)
d[US]
= k1 [U][S] − k
− 1[US]
− k
2[US]
= 0
(6a)
dt
[US]
k
[U][S]
k
([U]
− [US])
[S]
1
1 0
= =
(6b)
k
2
+ k
− 1
k
2
+ k
−1
Auflösen von Gl. 6b nach [US] und Einsetzen in Gl. 4 ergibt für die Reaktionsgeschwindigkeit
v:
v =
d[P] k
2
⋅[U]
0
⋅[S]
=
dt k
−1
+ k
2
[S] +
k
1
Gl. 7 ist als Michaelis-Menten-Gleichung bekannt und beschreibt die Bildungsgeschwindigkeit
der Produkte in Abhängigkeit der momentanen Harnstoffkonzentration und der eingesetzten
Konzentration des Enzyms. Die Größe ( k -1 +k 2 )/k 1 wird zu einer Konstanten, der Michaelis-Menten-Konstante
K M zusammengezogen.
K
k
+ k
1 2
M
= − (8)
k1
Da die Konzentration [S] zum Zeitpunkt t=0 durch die Einwaage an Harnstoff festgelegt ist,
können die Konstanten K M und k 2 durch Messung der Anfangsgeschwindigkeit v 0 ermittelt
werden.
v
0
⎛ d[P] ⎞
= ⎜ ⎟
⎝ dt ⎠
t = 0
k
2[U]
0[S]
=
[S] + K
0
M
0
In Abb.1 sind nach Gl. 7 berechnete Werte (Einheiten willkürlich, K M /(k 2 [U] 0 ) = 13,33) für
die Reaktionsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der Substratkonzentration aufgetragen.
Betrachtet man den Grenzwert
⎛ d[P] ⎞
lim ⎜ ⎟ = k
2[U]
0
= v
[S] →∞⎝
dt ⎠
max
so sieht man, dass durch für eine Substratkonzentration [S] = K M in Gl. 9 v = d[P]/dt den Wert
v max /2 annimmt.
Das Geschwindigkeitsgesetz (7), das zu dem Michaelis-Menten-Mechanismus gehört, stellt
einen fließenden Übergang von einer Kinetik erster Ordnung zu einer Kinetik nullter Ordnung
dar. Anschaulich lässt sich dies wie folgt erklären:
I) Ist im Verhältnis zum Substrat sehr viel Enzym vorhanden, so wird die Enzymkonzentration
kaum durch die Bildung des Substratkomplexes verringert. In der Folge
(7)
(9)
(10)
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nimmt auch die Bildungsgeschwindigkeit von P zu, die linear von der Konzentration
[US] abhängt.
II)
Wenn allerdings die Substratkonzentration so hoch wird, dass wenig freies Enzym
übrig ist, so hängt die Reaktionsgeschwindigkeit nur noch von der Menge des eingesetzten
Enzyms ab und nicht mehr von der Substratkonzentration. Das ist genauso, wie
an der Supermarktkasse, wenn alle Kassen besetzt sind. Dann kommt es auch nur auf
die Arbeitsgeschwindigkeit oder „Turn-Over-Frequenz“ der Kassiererinnen an, wie
viele Leute pro Zeiteinheit durchgeschleust werden können.
Abbildung 1:
Darstellung der Michaelis-Menten-Gleichung (Gl. 7): Abhängigkeit der Produktbildungsgeschwindigkeit
v von der Substratkonzentration
Die durch Gl. 10 definierte Maximalgeschwindigkeit kann als Maß für die katalytische Aktivität
A der Urease verwendet werden. Diese ist definiert als die Menge an Ammoniak in mol,
die pro mg Enzym bei einer bestimmten Temperatur (oft 25 oder 30°C) und einem bestimmten
pH (pH6,1 oder pH7) maximal pro Minute gebildet wird (Angabe in U mg -1 : ein U entspricht
1µmol NH 3 pro Minute).
v
max
⋅ VLösung
A = (11)
m
Enzym
Im Hauptteil des Versuchs wird die Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion (diese ist nicht
durch die nicht-kompetitive Produkthemmung beeinflusst, s.u.) dazu verwendet, um die Parameter
K M und v max zu ermitteln. Hierzu ist es hilfreich, die reziproke Form von Gl. 9 zu
verwenden
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1
v
1 K 1
= + ⋅
(12)
M
0
v
max
v
max
[S]
0
und dementsprechend 1/v 0 gegen 1/[S] 0 aufzutragen (so genannter Lineweaver-Burk-Plot).
Aus dem Achsenabschnitt erhält man v max , mit dessen Hilfe man dann K M aus der Steigung
der Ausgleichsgeraden ermitteln kann.
pH-Abhängigkeit der Harnstoffhydrolyse
Ein wichtiger Punkt bei der Harnstoffhydrolyse ist der pH-Wert der Lösung. Führt man die
Experimente in einer ungepufferten Lösung aus, so stellt sich nach einiger Zeit der pH-Wert
für den Ammoniumcarbonat-Puffer ein. Die Aktivität der Urease hängt aber entscheidend
vom pH-Wert ab. Optimal wäre ein pH von 7,01 [1] (s.u.). Die Beeinträchtigung der Aktivität
lässt sich mit folgendem Mechanismus beschreiben: [2]
UH 2
UH 2
S
K E,1
k 1 k
UH - + S UHS - 2
UH - + P
K
k -1 E,2
U 2-
K ES,2
US 2- K ES,1
Abbildung 2: Mechanismus der pH-abhängigen Harnstoffhydrolyse nach Trypton und Dixon [2]
Die aktive Spezies des Enzyms ist damit das amphotere Anion einer zweibasigen Säure. Die
Behandlung dieses Mechanismus unter der Bedingung eines stabilen Zwischenzustandes für
UHS - liefert für die Größen v max und K M in Abhängigkeit der Gleichgewichtskonstanten
(Herleitung siehe Anhang):
*
*
k
2[U]
0
v
max
v
max
= k
2[U]
0
=
=
(13)
+
[H ] K
ES,2 f ( pH)
1+
+
+
K [H ]
ES,1
K
M
+
[H ] K
E,2
1+
+
+
K
*
E,1 [H ]
= K
M
(14)
+
[H ] K
ES,2
1+
+
+
K [H ]
ES,1
v* max ist die (hypothetische) Maximalgeschwindigkeit für den Fall, dass alle Enzymmoleküle
in der einfach protonierten Form vorliegen würden, während v max die im Experiment erzielbare
Maximalgeschwindigkeit für einen gegebenen pH-Wert darstellt.
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Es wird gefunden, dass die jeweiligen Konstanten K E und K ES gleich sind, was bedeutet, dass
die Anbindung des Substrates keinen Einfluss auf die Säure-Base Eigenschaften des Enzyms
hat. Dies hat ebenfalls zur Folge, dass sich K M nicht mit dem pH ändert. Fidaleo und Lavecchia
geben die Werte mit pK 1 =6,12 und pK 2 =7.9 an. (Warum ist dann ein pH-Wert von 7.01
optimal für die Harnstoffhydrolyse?) Die Werte können benutzt werden, um z.B. die Aktivität
bei einem beliebigen pH zu berechnen, da die Experimente in ungepufferter Lösung durchgeführt
werden.
Produkthemmung
Verwendet man die aus den gemessenen Anfangsgeschwindigkeiten ermittelten Parameter des
Michaelis-Menten-Mechanismus und versucht damit den Konzentrationsverlauf über die Zeit
zu beschreiben, so tritt ein weiterer Gesichtspunkt des eigentlichen Mechanismus zu Tage.
Hierzu wird zunächst die Michaelis-Menten-Gleichung mit der Anfangsbedingung
t=0[S]=[S] 0 integriert (Herleitung siehe Anhang).
[P]
() t
= [S]
0
− K
M
⎛
⎜ e
⎜
⋅ W⎜
⎜
⎜
⎝
vmaxt
−
K M
⎛
+ ln⎜
⎜
⎝
K
[] S
M
0
e
[S] 0
KM
⎞ ⎞
⎟ ⎟
⎟ ⎟
⎠ ⎟
(15)
⎟
⎟
⎠
Die Funktion W ist dabei die Lambert-Funktion, die als Umkehrfunktion der Beziehung
f
( W) W ⋅ e
W
= (16)
definiert und z.B. als Funktion ProductLog im Programmpaket Mathematica ® integriert ist
Ein Nachteil der Methode der Anfangsgeschwindigkeit zur Aufklärung der Kinetik bzw. des
Mechanismus ist die Tatsache, dass der Einfluss der Produktkonzentration auf die Reaktionsgeschwindigkeit
nicht berücksichtigt wird, da diese ja am Anfang sehr klein ist. Es gibt mehrere
mögliche Mechanismen für die Produkthemmung. Der für die Harnstoffhydrolyse durch
Urease relevante Mechanismus ist der so genannte nicht-kompetitive Mechanismus (s.
Abb.3).
Sowohl das freie Enzym, wie auch der Enzym-Substrat-Komplex reagieren mit dem Produkt
zu einem inaktiven Komplex. Das Substrat konkurriert nicht mit dem Produkt um freie Bindungsstellen,
sondern P reagiert mit jeder Form des Enzyms in gleichem Maße und deaktiviert
dieses. Die Gleichgewichtsbedingungen werden durch eine gemeinsame Dissoziationskonstante
K p beschrieben, in der alle Formen von U vorkommen:
([U]
+ [US])
[P]
K P
= (17)
[UP] + [UPS]
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Hydrolyse von Harnstoff / Michaelis-Menten-Kinetik 7
k 1
k 2
U + S US U + P
k -1
P
P
UP
UPS
Abbildung 3:
Nicht-kompetitive Produkthemmung
Das Geschwindigkeitsgesetz für diesen Mechanismus lässt sich durch Gl. 18 angeben (wiederum
wird ein stationärer Zwischenzustand angenommen, Herleitung siehe Anhang).
d[P]
dt
=
v
max
[S]
⎛ [P] ⎞
+
( K ) ⎜
⎟ M + [S] 1
⎝ K
p ⎠
Für kleine Produktkonzentrationen geht Gl. 18 in Gl. 7 über. Eine Methode, die Produkthemmung
zu studieren, wäre zum Beispiel der Zusatz einer bestimmten Menge an Produkt, um
den Effekt zu untersuchen, den die auf die Anfangsgeschwindigkeit hat. Sind die Parameter
K M und v max schon bekannt, so kann K p (1,22±0,11 10 -2 mol/l) auch mit der Methode der Anfangsgeschwindigkeiten
durch eine solche Messreihe bestimmt werden. Aus Zeitgründen soll
hier aber ein anderer Weg eingeschlagen werden, der sich der integralen Konzentrations-Zeit-
Kurve bedient. Der Einfluss der Produktkonzentration wird dabei halbquantitativ bestimmt.
Hierzu werden jetzt zwei Gleichungen benötigt, da die Produktbildung und die Eduktabnahme
miteinander gekoppelt sind (auftauchen von [P] in Gl. 18). Die zweite Gleichung ergibt sich
wiederum aus dem Bodensteinschen Stationaritätsprinzip, da ja dann gerade soviel Produkt
gebildet wird, wie Edukt verbraucht wird. Das Differentialgleichungssystem ist dann einfach
durch (19) gegeben und lässt sich numerisch lösen.
d[P] d[S]
= −
(19)
dt dt
Im konkreten Fall muss man noch die stöchiometrischen Verhältnisse berücksichtigen. Es
werden zum Beispiel zwei Einheiten Ammoniak und eine Einheit CO 2 pro Formelumsatz gebildet.
Betrachtet man Ammoniumcarbonat allerdings als das eigentliche Produkt, so liegen
die Verhältnisse wieder 1:1 und Gl. 19 enthält automatisch den richtigen stöchiometrischen
Koeffizienten.
(18)
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Hydrolyse von Harnstoff / Michaelis-Menten-Kinetik 8
Leitfähigkeit von Elektrolyten
Die Konzentrationsmessungen erfolgen indirekt durch Messung der spezifischen Leitfähigkeit
der Lösung. Die ionische Leitfähigkeit der Elektrolyte unterscheidet sich wesentlich von der
elektronischen Leitfähigkeit der Metalle. Für den reinen Ladungstransport, der in Elektrolyten
durch positive und negative Ionen bzw. in Metallen durch Elektronen getragen wird, lassen
sich jedoch gleiche elektrische Grundgrößen definieren. Ist L die Länge und F der Querschnitt
eines Elektrodengefäßes, so liefert das Ohmsche Gesetz für den Widerstand R dieses Leiters,
wenn U die angelegte Spannung und I den sich einstellenden Strom bedeuten:
R = U/I = L / (κF) (20)
Im Gegensatz zu metallischen Leitern gilt Gl. 20 in Elektrolytlösungen nur für hochfrequenten
Wechselstrom (mit Frequenzen ≥ 1 kHz), da sonst Elektrolyse- und Polarisationseffekte
an den Elektroden auftreten. Die Größe L/F ist die Zellkonstante und wird meist in cm -1 angegeben.
κ ist die spezifische Leitfähigkeit mit der SI-Einheit S/m = (Ωm) −1 . Die molare Leitfähigkeit
(molar conductivity) Λ m ist die auf die Konzentration c bezogene spezifische Leitfähigkeit
Λ m = κ/c (21)
Ein Elektrolyt, der in zwei Ionensorten zerfällt, und zwar in ν + Kationen der Ladungszahl z +
und ν − Anionen der Ladungszahl z − , besitzt die elektrochemische Wertigkeit ν = ν + z + = ν − z − ,
die die molare Leitfähigkeit Λ m mit der Äquivalentleitfähigkeit Λ eq verknüpft:
Λ eq = Λ m /ν = κ/(νc) (22)
Anhand der molaren Leitfähigkeit ihrer Lösungen werden Elektrolyte als stark oder schwach
klassifiziert: Ein starker Elektrolyt ist eine Substanz, deren molare Leitfähigkeit in Lösung nur
wenig von der Konzentration abhängt. Ein schwacher Elektrolyt besitzt bei sehr niedrigen
Konzentrationen eine ähnliche molare Leitfähigkeit wie ein starker Elektrolyt, die jedoch für
zunehmende Konzentrationen sehr schnell auf kleine Werte abfällt. Das Verhalten schwacher
Elektrolyte lässt sich auf der Basis des Gleichgewichts zwischen der Substanz und ihren Ionen
in Lösung erklären: Der Dissoziationsgrad α, der den in Lösung dissoziiert vorliegenden Anteil
einer Substanz angibt, nimmt zu, wenn die Konzentration verringert wird. Starke Elektrolyten
dagegen liegen in Lösung immer vollständig dissoziiert vor (α = 1).
Da die molare Leitfähigkeit Λ m = Λ m (c) selbst konzentrationsabhängig ist, findet man keine
Proportionalität zwischen κ und c, wie Gleichung (21) nahe legt. Lediglich für den Grenzfall
der unendlich verdünnten Lösung strebt Λ m einem festen Grenzwert zu. Man bezeichnet diesen
Wert als molare Grenzleitfähigkeit (limiting molar conductivity) Λ 0 m bei unendlicher
Verdünnung. Er beinhaltet keine interionischen Wechselwirkungen mehr. Für starke Elektrolyten
sind Λ m und c im Bereich kleiner Konzentrationen c nach experimentellen Ergebnissen
von Kohlrausch durch ein Quadratwurzelgesetz miteinander verknüpft:
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Hydrolyse von Harnstoff / Michaelis-Menten-Kinetik 9
Λ m = Λ 0 m - A c ½ (23)
Durch die Auftragung von Λ m gegen c ½ erhält man Λ 0 m aus dem Ordinatenabschnitt und A
aus der Steigung der Geraden. Beziehung (23) ergibt sich auch aus der Debye-Hückel-Theorie
der Ionenwanderung, die auf einer Modellvorstellung für ionische Lösungen beruht, nach der
jedes Ion von einer entgegengesetzt geladenen Ionenwolke umgeben ist, die sich aus dem
Wechselspiel zwischen der anziehenden Wirkung der Ladung des Zentralions und der für die
Lösung charakteristischen thermischen Bewegung ergibt (s. Skript zur Elektrochemie). Die
Abnahme der molaren Leitfähigkeit mit erhöhter Konzentration ist 1) auf eine asymmetrische
Verzerrung der Ionenwolke bei der Wanderung mit einhergehender Verschiebung der Ladungsschwerpunkte
vom Ionenwolke und Zentralion (Asymmetrieeffekt) und 2) auf die erhöhte
Viskosität durch die entgegengesetzten Bewegungsrichtungen von Zentralion und Ionenwolke
(elektrophoretischer Effekt) zurückzuführen.
Nach dem Gesetz der unabhängigen Ionenwanderung ergibt sich die molare Grenzleitfähigkeit
Λ 0 m bei unendlicher Verdünnung aus der Summe der Ionenleitfähigkeiten Λ, d.h. der mit
den stöchiometrischen Faktoren ν gewichteten molaren Grenzionenleitfähigkeiten λ
Λ 0 m = Λ + + Λ − = ν + λ + + ν − λ − (24)
Diese sind wie Λ m und κ relativ stark temperaturabhängig, so dass es erforderlich ist, während
der Messung für Temperaturkonstanz zu sorgen. Das Gesetz der unabhängigen Ionenwanderung
ermöglicht es, für einen beliebigen Elektrolyten (zumindest bei unendlicher Verdünnung)
die molare Leitfähigkeit Λ m aus den bekannten Ionenleitfähigkeiten λ zu berechnen.
Insbesondere können Grenzleitfähigkeiten schwacher Elektrolyte, die einer direkten Messung
nicht zugänglich sind, aus den Grenzleitfähigkeiten starker Elektrolyte berechnet werden. Für
die Grenzleitfähigkeit von Essigsäure ergibt sich beispielsweise:
Λ 0 m (CH 3 COOH) = Λ 0 m (CH 3 COONa) + Λ 0 m (HCl) − Λ 0 m (NaCl)
Das Quadratwurzelgesetz (23) versagt für schwache Elektrolyte, weil diese nur teilweise dissoziieren
(α < 1). Vernachlässigt man interionische Wechselwirkungen (für kleine Werte von
α zulässig), so bestimmt der Dissoziationsgrad alleine die Abnahme der molaren Leitfähigkeit:
Λ m = αΛ m
0
(25)
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Hydrolyse von Harnstoff / Michaelis-Menten-Kinetik 10
1) Bereitstellung der Lösungen
a) Ammoniumcarbonat
Aufgabenstellung
Stellen Sie zunächst 100ml einer 0,01 M Harnstofflösung her und versetzen Sie sie
mit 50 mg Urease. Überlassen Sie die Lösung auf einem Magnetrührer bis zum
Ende des Messtages sich selbst.
b) Herstellung der Verdünnungsreihe einer Harnstofflösung/Ureaselösung
2) Messungen
Stellen Sie ausgehend von 250 ml einer 0,1 M Harnstofflösung eine Verdünnungsreihe
mit je 100ml der Konzentrationen {0.5·10 -3 , 1·10 -3 , 1.5·10 -3 , 2·10 -3 , 3·10 -3 ,
4·10 -3 , 6·10 -3 , 8·10 -3 , 1·10 -2 , 1.2·10 -2 } mol/l her. Die Konzentration 1·10 -2 mol/l soll
zweimal hergestellt werden. Wiegen Sie 150 mg Urease ab und lösen Sie sie in
150 ml Wasser.
Die Messgröße, mit der die Ammoniumcarbonatkonzentration zeitaufgelöst gemessen
wird, ist die Leitfähigkeit der Lösung. Diese ist im betreffenden Konzentrationsbereich
in sehr guter Näherung proportional zur Ionenkonzentration (im Allgemeinen ist sie dies
natürlich nicht, da die molare Leitfähigkeit mit der Wurzel der Konzentration abnimmt:
Kohlrausch’sches Quadratwurzelgesetz!).
a) Nehmen Sie am Schreiber folgende Einstellungen vor: 6 Skalenteile(Skt.)/min,
100 mV/Skt. Füllen Sie jeweils 100 ml der Harnstofflösungen in das temperierte
(25°C) Reaktionsgefäß und hängen Sie die pH- und die Leitfähigkeitselektrode
hinein. Achten Sie hierbei darauf, dass die Leitfähigkeitselektrode am Rand des
Gefäßes hängt und so tief wie möglich in die Lösung eintaucht.
Schalten Sie den Schreiber ein und fügen Sie unter Rühren 10 ml der Ureaselösung
hinzu, um die Reaktion zu starten. Nehmen Sie die Spannungskurve für ca. 60 s
auf und notieren Sie den pH-Wert simultan (am besten direkt an die Kurve schreiben).
Am Ende einer Messung sollten Reaktionsgefäß, Elektroden und Rührer gut
gespült werden.
b) Füllen Sie die (zweite) Lösung mit 1·10 -2 mol/l Harnstoff in das Reaktionsgefäß
und nehmen Sie die Spannungskurve etwa 80-90 Minuten lang auf. Ändern Sie die
Schreibereinstellungen auf 1V/Skt. bzw. 1 Skt./min. Notieren Sie ebenfalls den
pH-Wert in regelmäßigen Abständen.
c) Zur Kalibrierung: Messen Sie die Leitfähigkeit bzw. den Schreiberausschlag der
unter 1a) bereiteten Ammoniumcarbonatlösung, indem Sie ausgehend von 100 ml
destilliertem Wasser in mehreren Schritten je 2 ml zugeben und den Schreiberaus-
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Hydrolyse von Harnstoff / Michaelis-Menten-Kinetik 11
schlag nach Einstellen eines konstanten Leitfähigkeitswertes dokumentieren. Hierbei
bietet sich auch die Möglichkeit die Mischzeit abzuschätzen, vor deren Ablauf
die Auswertung der Steigung der unter a) aufgenommenen Kurven in jedem Falle
nicht ratsam ist.
3) Auswertung
a) Tragen Sie die vom Schreiber unter 2c) angezeigten Spannungswerte in einem
Diagramm gegen die jeweilige Konzentration der Lösung auf und ermitteln Sie
den Kalibrierfaktor mittels linearer Regression.
b) Bestimmen sie die Konstanten v max , K M , k 2 und die Aktivität des Enzyms sowie die
jeweils dazugehörigen Fehler aus den Anfangssteigungen v 0 und der zugehörigen
Harnstoffkonzentration [S] 0 der unter 2a) aufgenommen Kurven zunächst ohne
den pH-Wert zu berücksichtigen (Lineweaver-Burk-Plot, Gl. 12). Zur Ermittlung
der Anfangssteigung verwerfen sie etwa die ersten 20 Sekunden, da so lange etwa
die Mischzeit beträgt!
c) Ermitteln Sie mit einem geeigneten Mittelwert des pH-Wertes die Konstanten
v max * und k 2 *, indem Sie die ermittelten Konstanten v max und k 2 um den Faktor
f(pH) korrigieren (Gl. 13). Berechnen sie die Aktivität des Enzyms (in U/mg) unter
den Bedingungen (pH, Temperatur), die auf der Flasche angegeben sind (bei
30°C ist die Reaktion ca. um den Faktor 1,25 schneller als bei 25°C). Beachten sie,
dass sie eventuell v max * noch durch den entsprechenden pH-Faktor für die Angabe
auf der Flasche teilen müssen. Ermitteln Sie auch hier den Fehler und vergleichen
Sie die Ergebnisse mit der Angabe auf der Flasche!
d) In diesem Teil der Auswertung geht es darum, die aufgenommene Konzentrations-
Zeit-Kurve mit Daten zu vergleichen, die nach den im Theorieteil vorgestellten
Modellen berechnet werden. Dies geschieht mit dem Programm Mathematica ® ,
das auf den Auswerterechnern im Praktikum installiert ist. Ein vorgefertigtes Sheet
liegt auf dem Desktop und man braucht nur noch einzelne Werte einzufügen (siehe
Anleitung in Anhang 4).
Übertragen sie zunächst die unter 2b) aufgenommene Spannungskurve in eine
Konzentrations-Zeit-Kurve (Intervall von 2 Minuten) und erstellen sie hieraus eine
ASCII-Datei mit dem Namen Daten1.DAT. Hierzu kann man einfach in Origin ®
die betreffenden Spalten auswählen und die Datei mit DateiExportierenASCII
erstellen, oder in Excel ® DateiSpeichern unter Dateityp (Unicode) .txt. Das
Dezimaltrennzeichen muss der Punkt sein. Dies geht am einfachsten, wenn man
die ASCII-Datei mit WordPad öffnet und unter BearbeitenErsetzen die gewünschte
Änderung vornimmt.
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Hydrolyse von Harnstoff / Michaelis-Menten-Kinetik 12
Auf den Auswerterechnern im Praktikum liegt die Datei Harnstoff.nb bereit. Kopieren
sie einfach die von ihnen erstellte ASCII-Datei Daten1.DAT auf den Desktop
und folgen sie den Anweisungen in Anhang IV. Sie erhalten drei neue Dateien,
mit den Namen ohnepH.DAT, mitpH.DAT und komplett.DAT. Diese können sie
mit Excel oder Origin öffnen und graphisch darstellen. Sie enthalten berechnete
Daten der Konzentration in mol/l in Abhängigkeit von der Zeit in Minuten. "ohnepH.DAT"
wurde nach Gl. 15 und den Daten aus 3b) "mitpH.DAT" ebenfalls
nach Gl. 15 aber mit den Daten aus 3c) und "komplett.DAT" nach dem allgemeinen
Zusammenhang Gl. 18/19 numerisch berechnet.
4) Diskussion
Vergleichen sie die unter 3c) erhaltenen Werte mit Literaturdaten (Angabe auf der Flasche)
und diskutieren sie etwaige Abweichungen. Wie genau schätzen sie die Meßmethode
ein (qualitativ) und welche Verbesserungen würden sie vornehmen, um zu genaueren
Messungen zu gelangen. Ist die Leitfähigkeitsmessung gut geeignet, um die
Konzentration des Produktes zu verfolgen (Abweichung bei der Kalibrierung, Zeitauflösung)?
Welche Probleme ergeben sich, wenn man die Messungen unter konstanten pH-
Bedingungen durchführen will und wie könnte man diese lösen (Leitfähigkeit, selektiverer
Nachweis des Produktes)?
Stellen sie die unter 3d) gemessene Konzentrations-Zeit-Kurve zusammen mit den berechneten
Kurven graphisch dar. Welche Aussage lässt sich treffen? Welche Vorteile/Nachteile
hat die Methode der Anfangsgeschwindigkeiten hinsichtlich der Ermittlung
von Reaktionsmechanismen? Wie stark ist der Einfluss des pH-Wertes und der Produkthemmung
(qualitativ)? Wie genau wird die experimentelle Kurve durch die Modellfunktion
unter Berücksichtigung von pH- und Produktabhängigkeit der Geschwindigkeit beschrieben
und wie erklären sie sich eine eventuelle Abweichung (beziehen sie hierzu die
von ihnen während der Messung notierten pH-Werte mit in ihre Überlegungen ein)?
Literatur
[1] M. Fidaleo, R. Lavecchia, Kinetic Study of Enzymatic Urea Hydrolysis Kinetic
Study of Enzymatic Urea Hydrolysis in the pH Range 4–9, Chem. Biochem. Eng. Q. 17
(4) 311–318 (2003)
[2] Tipton K. F., Dixon H. B. F., Methods Enzymol. 63, (1979), 183
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Hydrolyse von Harnstoff / Michaelis-Menten-Kinetik 13
I) Herleitung der pH-Abhängigkeit
Anhang
Ziel der Ableitung ist, die Konzentration der Übergangsspezies UHS - unter der Annahme eines
stationären Zustandes zu bestimmen, da sich die Produktbildungsgeschwindigkeit als
d[P]
−
= k
2[UHS
]
(A1)
dt
schreiben lässt. Die Behandlung nach dem Bodensteinschen Quasistationaritätsprinzip ergibt
zunächst den zu Gl. 6 analogen Ausdruck:
−
− [UH ][S]
[UHS ] = (A2)
K M
Des Weiteren muss man nun die unbekannte Konzentration des freien [UH - ] durch die eingesetzte
Konzentration [U] 0 ausdrücken. Dazu werden die (bekannten) Gleichgewichtskonstanten
der beiden Säure-Base Gleichgewichte verwendet:
[UH
−
] = [U]
0
−[UH
] −[U
2
2−
−
2−
] −[UHS
] −[UH
S] −[US
]
Ausdrücken der unbekannten Konzentrationen durch die Dissoziationskonstanten, die Hydroniumionenkonzentration,
[UH - ] und [UHS - ] liefert:
[UH
−
2
(A3)
− +
−
− +
−
[UH ][H ] [UH ]K
E,2
[UH ][H ] [UHS ]K
−
ES,2
] = [U]
0
−
− −[UHS
] −
−
(A4)
+
+
K [H ]
K
[H ]
E,1
Einsetzen von Gl. A2 ergibt:
⎛ +
⎛
+
⎞⎞
−
= − ⎜[H
] K
E,2 S
⎜
[H ] K
ES,2
[UH ] [U] −
+ +
⎟⎟
0
[UH ]
⎜
+ + 1
+
(A5)
⎟
⎝
K [H ] K ⎝ K [H
+
E,1
M ES,1
] ⎠⎠
Benutzt man nun wiederum Gl. A2, um [UHS - ] in Gl. A1 durch [UH - ] zu ersetzen, erhält man
d[P]
dt
=
⎛
⎜
[H
1+
⎝ K
+
] K
+
[H
woraus unmittelbar die Gln. 13 und 14 folgen.
K
M
E,1
k
2
E,2
+
[U]
0
[S]
⎞ ⎛
⎟ + ⎜
[H
S
]
⎠ ⎝ K
+
ES,1
] K
+
[H
ES,1
ES,2
+
⎞
+ 1⎟
]
⎠
(A6)
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Hydrolyse von Harnstoff / Michaelis-Menten-Kinetik 14
II) Herleitung der Konzentrations-Zeit-Funktion
Ausgangspunkt für die Herleitung ist das Geschwindigkeitsgesetz Gl. 7:
d[P]
dt
v [S]
[S] + K
max
= (A7)
M
Unter der Bedingung eines stationären Zwischenzustandes erhält kann man die Abnahmegeschwindigkeit
des Substrats durch Bildungsgeschwindigkeit der Produkte ausdrücken.
d[S]
dt
d[P]
dt
v [S]
[S] + K
max
= − = −
(A8)
M
Ist die Funktion [S](t) nun im betrachteten Bereich stetig, eindeutig und streng monoton (die
ersten beiden Bedingungen sollten immer erfüllt sein und für die dritte ist erfüllt, weil die
Konzentration von Harnstoff ständig abnimmt), so kann man die Ableitung der Umkehrfunktion
t([S]) folgendermaßen schreiben:
dt
d[S]
⎛ d[S] ⎞
= ⎜ ⎟
⎝ dt ⎠
−1
K
M
= − −
v [S]
max
1
v
max
(A9)
Diese lässt sich sofort integrieren, wodurch man erhält:
K [S]
= ([S]
) − C1
(A10)
v v
M
t − ln +
max
max
Elementare Umformung ergibt dann:
− v
max
K
t + C
M
2
= ln
[S]
K
([S]
) + mit C
2
= v
maxC1
M
(A11)
Dies kann man alsdann auch schreiben als
e
was für [S](t) ergibt:
−vmaxt+
C
K
K
M
M
2
=
[S]
K
M
e
[S]
K
M
(A12)
[S](t) = K
M
⎧
⎪e
W⎨
⎪
⎩
−v
max
K
K
t+
C
M
M
2
⎫
⎪
⎬
⎪
⎭
(A13)
Um zu Gl. 15 zu gelangen, muss man noch die Integrationskonstante C 2 bestimmen. Diese
folgt aus der Anfangsbedingung [S](0)=[S] 0 .
C2
C2
⎧ ⎫
K
[S] 0
M KM
⎪e
⎪ e [S]
0 KM
[ S] ( 0) = K
MW⎨
⎬ → = e
(A14)
⎪ K
M ⎪ K
M
K
M
⎩ ⎭
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Hydrolyse von Harnstoff / Michaelis-Menten-Kinetik 15
Hieraus folgt direkt
[S] 0
⎛ ⎞
⎜ KM
C = ⎟
2
K
M
ln [S]
0
e
(A15)
⎜ ⎟
⎝ ⎠
und damit Gl. 15.
III) Herleitung der Reaktionsgeschwindigkeit mit Produkthemmung
Ausgangspunkt der Herleitung ist abermals die Annahme eines stationären Zustandes für
Spezies US, diesmal allerdings unter Beachtung der Gleichgewichtstontanten K P , die angibt,
wie viel freies Enzym in der "Sackgasse" landet.
d[US]
k1[U][S]
Ansatz:
= k1[U][S]
− k
−1[US]
− k
2[US]
= 0 → [US] =
(A16)
dt
k + k
Die unbekannte Konzentration des freien Enzyms stellt sich dann wie folgt dar:
[ U] = [U]
0
− [US] − ([UP] + [USP])
(A17)
2
−1
Substitution von
[U][S]
[ US] = und
K M
([U]
+ [S])
[P]
[UP] + [USP] =
(A18)
K P
führt zu
[U]
0
= (A19)
[S]
1+
K
M
[U]
[P] [P][S]
+ +
K K K
P
M
P
und unter Verwendung der ersten Beziehung in (18) endlich:
d[P]
dt
= k
2
[U][S] =
k
2
[U]
⎛ [P] ⎞ +
( K ) ⎜
⎟ M + [S] 1
⎝ K
P ⎠
0
[S]
(A20)
IV) Beschreibung des zur Auswertung benötigten Mathematica ® -Sheets
Zunächst muss das Verzeichnis in der ersten Zeile mit shift + enter bestätigt werden. Danach
sind die Werte für pH, v max , v max *, K M und [S] 0 einzutragen. Achten Sie darauf, dass Sie als
Einheiten mol/L bzw. mol/(L⋅min) verwenden. Dann noch einmal shift + enter drücken. Die
ASCII-Dateien komplett, ohnepH und mitpH befinden sich nun auf dem Desktop. Zur Kontrolle
wird der Plot unten gleich angezeigt.
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Hydrolyse von Harnstoff / Michaelis-Menten-Kinetik 16
Beachten Sie, dass das Mathematica-Programm drei verschiedenen Maximalgeschwindigkeiten
kennt. Die erste ("vm", in Zeile 3) ist die von Ihnen bestimmte hypothetische Maximalgeschwindigkeit
v max * aus Gleichung 13. Die zweite ("v", in Zeile 5) ist die von Ihnen mittels
des Lineweaver-Burk-Plots experimentell bestimmte Maximalgeschwindigkeit. Die dritte
("vcorr", in Zeile 10) ist die zur Langzeitmessung 2b gehörige Maximalgeschwindigkeit und
wird vom Programm aus vmax* und dem von Ihnen in 2b gemessenen mittleren pH-Wert der
Lösung berechnet. Dieser pH-Wert ist nicht derselbe wie der der Messungen aus 2a!
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