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Methoden - Kapitel 3.4.
werden und nur das amplifizierte Produkt übrig bleiben. Für die Aufreinigung wurde
ein kommerzielles Kit (MinElute® PCR Purification Kit, Qiagen) nach Herstelleranleitung
verwendet. Doppelsträngige DNA-Fragmente, die länger als 70 Basenpaare
sind, werden an einer silikatbeschichteten Membran zurückgehalten, während sie für
die übrigen Komponenten durchlässig ist.
Die aufgereinigten Produkte wurden mit Hilfe der Cycle-Sequencing-Reaktion von
Sanger et al. (1977) direktsequenziert. Dabei wurden für alle Proben sowohl forward-Sequenzierungen
(H-Strang) als auch reverse-Sequenzierungen (L-Strang)
durchgeführt. Das Reaktionsvolumen betrug 20µl und setzte sich aus folgenden
Komponenten zusammen (Tab. 3.13):
Tabelle 3.13: Komponenten eines 20µl-Ansatzes für die Sequenzierungsreaktion
nach Sanger.
Komponente
BigDye TM Terminator Ready Reaction
Mix (PE Applied Biosystems)
Sequencing Buffer (5x)
(PE Applied Biosystems)
µl je Probe
Primer 0,6
Aufgereinigtes PCR-Produkt 0,5-1
Ampuwa 13,9-13,4
Gesamtvolumen 20
2
3
Die Sequenzierreaktion fand mit folgenden Parametern statt (Tab. 3.14):
Tabelle 3.14: PCR-Parameter für die Sequenzierungsreaktion.
Schritt Temperatur (°C) Dauer (min) Zyklen
Initial 96 10
Denaturation
Annealing
Elongation
96
50
60
10sec
5sec
4
Soak 10 10
25
Nach dieser Sequenzierungs-PCR mussten die erhaltenen Produkte erneut gereinigt
werden, da überschüssige, fluoreszenzmarkierte ddNTPS, Nukleotide und Polymerase
zu einem starken Hintergrundrauschen führen bzw. die Analysierbarkeit der Probe
stark einschränken. Für die Aufreinigung wurde das NucleoSeq Kit der Firma Macherey-Nagel
verwendet, das auf dem Prinzip der Gelfiltration beruht. Die Durchführung
wurde nach Angaben des Herstellers vorgenommen.
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