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Methoden - Kapitel 3.4.
3.4.8. Auswertung der Amplifikationen
Nach der Durchführung einer PCR wurden die
Proben auf eine erfolgreiche Amplifikation
überprüft. In einer horizontalen Elektrophoresekammer
wurden die Produkte der Länge nach
aufgetrennt und unter UV-Licht sichtbar gemacht
und fotografiert. Dafür wurde der Gel
Jet Imager & Analyser mit der Software Gel-
Capture der Firma Intas verwendet (Abb. 3.9).
Je 6µl PCR-Produkt wurden auf ein 2,5%iges
Agarosegel aufgetragen, das genaue Rezept und
die Vorgehensweise finden sich in Hummel
2003 (S. 250ff). Anhand der Stärke der Signale
Abbildung 3.10. ABI Prism 310 Genetic
Analyzer mit angeschlossenen Peripherigeräten
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Abbildung 3.9: Gel Jet Imager der Firma
Intas mit angeschlossenen Peripheriegeräten
konnte abgeschätzt werden, wie viel Produkt in die weiteren Analyseschritte eingebracht
werden müssen.
Fragmentlängenanalyse
Die Analyse der STRs erfolgt mit Hilfe eines
Polyacrylamidgels (Pop-4®, PE Applied Biosystems)
in einer Kapillargelektrophorese (ABI
Prism 310 Genetic Analyzer, Abb. 3.10). Die
Fragmente werden dabei durch die unterschiedlichen
Farbmarkierungen von einem Laser detektiert,
der die Laufzeit mit einem mitgeführten
Längenstandard (GS ROX 500 für die Heptaplex-
und Sexplex-Ansätze, LIZ 600 für Y-
STR-Ansätze) mittels einer Software (672 Genescan-Analysis
Software und Genescan-
Collection Software (Version 2.0.2.) zur Fragmentlängenanalyse,
PE Applied Biosystems)
vergleicht. Die Software stellt die erhaltenen
Fragmente in Peaks der jeweiligen Farbe dar.
Die Probenvorbereitung und Methodik findet sich in Hummel 2003 (S. 255ff). Eine
mitgeführte Allelleiter der häufigsten Fragmentlängen in Europa erlaubt eine direkte
Bestimmung der Allele des Individuums (Bär et al. 1997). Für jede Elektrophorese
muss dabei eine Allelleiter mitgeführt werden, da es zwischen den einzelnen Durchführungen
zu Laufunterschieden kommen kann. Die Nomenklatur der Allele richtet
sich dabei nach der Anzahl der gefundenen Wiederholungseinheiten.
Sequenzierung
Bevor die PCR-Produkte in das Taq-Cycle-Sequencing eingebracht werden konnten,
mussten diese aufgereinigt werden. Die Taq-Polymerase, nicht verbrauchte dNTPs,
Magnesium- und Chloridionen sowie überschüssige Primer sollen dabei entfernt