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Methoden - Kapitel 3.4. Tabelle 3.10: Primersequenzen und Produktlängen der Triplex-PCR für den Nachweis von Salmonella und Borrelia. Genort Primersequenz Produktlänge [bp] STY0312 STY0316 recN GGGCTTGCCGAGACACAG TTAAGGCCTCGTCCATAAAAAC AGGAGGGGAATATCTCACTGG TGATCCCGTACAGACTGGTTATC TTATTTGGTTACAAAATTAAAGATGATG CCTAAAAAATAAACAACGTCTAAACTCA 100 88 Amplifikation bei Salmonella typhi / paratyphi A / weltevreden S. enterica spec. (außer paratyphi A / weltevreden) 111 B. recurrentis In ersten Test-PCRs wurde ein Protokoll für die erfolgreiche Amplifikation mit Hilfe diverser Kontrollproben optimiert. Dazu gehören Positivkontrollen, menschliche Kontrollproben sowie DNA-Extrakte aus Bodenproben (im Detail siehe Schröder 2013). Das optimierte Protokoll setzte sich aus folgenden Parametern zusammen (Tabellen 3.11 und 3.12): Tabelle 3.11: Komponenten eines 25µl-Ansatzes für die Amplifikation humanpathogener Sequenzen. Komponente µl je Probe AmpliTaq Gold 360 MasterMix 12,5 Primer je 0,5 H 2 O (Fa. Ambion) 9,5 – 0 DNA-Extrakt 0,5 – 10,0 Gesamtvolumen 25 Tabelle 3.12: Cycling-Parameter für die Amplifikation humanpathogener Sequenzen. Schritt Temperatur (°C) Dauer (min) Zyklen Initial 95 5 Denaturation Annealing Elongation 94 * 72 Delay 72 7 1 1 1 Soak 10 10 40 - 50 * Annealing Temperatur: bei Bartonella/Rickettsia: 56°C; bei Salmonella/Borrelia: 54°C; Alle PCRs wurden in einem DNA Thermal Cycler Typ Mastercycler® gradient bzw. personal der Firma Eppendorf durchgeführt. 56
Methoden - Kapitel 3.4. 3.4.8. Auswertung der Amplifikationen Nach der Durchführung einer PCR wurden die Proben auf eine erfolgreiche Amplifikation überprüft. In einer horizontalen Elektrophoresekammer wurden die Produkte der Länge nach aufgetrennt und unter UV-Licht sichtbar gemacht und fotografiert. Dafür wurde der Gel Jet Imager & Analyser mit der Software Gel- Capture der Firma Intas verwendet (Abb. 3.9). Je 6µl PCR-Produkt wurden auf ein 2,5%iges Agarosegel aufgetragen, das genaue Rezept und die Vorgehensweise finden sich in Hummel 2003 (S. 250ff). Anhand der Stärke der Signale Abbildung 3.10. ABI Prism 310 Genetic Analyzer mit angeschlossenen Peripherigeräten 57 Abbildung 3.9: Gel Jet Imager der Firma Intas mit angeschlossenen Peripheriegeräten konnte abgeschätzt werden, wie viel Produkt in die weiteren Analyseschritte eingebracht werden müssen. Fragmentlängenanalyse Die Analyse der STRs erfolgt mit Hilfe eines Polyacrylamidgels (Pop-4®, PE Applied Biosystems) in einer Kapillargelektrophorese (ABI Prism 310 Genetic Analyzer, Abb. 3.10). Die Fragmente werden dabei durch die unterschiedlichen Farbmarkierungen von einem Laser detektiert, der die Laufzeit mit einem mitgeführten Längenstandard (GS ROX 500 für die Heptaplex- und Sexplex-Ansätze, LIZ 600 für Y- STR-Ansätze) mittels einer Software (672 Genescan-Analysis Software und Genescan- Collection Software (Version 2.0.2.) zur Fragmentlängenanalyse, PE Applied Biosystems) vergleicht. Die Software stellt die erhaltenen Fragmente in Peaks der jeweiligen Farbe dar. Die Probenvorbereitung und Methodik findet sich in Hummel 2003 (S. 255ff). Eine mitgeführte Allelleiter der häufigsten Fragmentlängen in Europa erlaubt eine direkte Bestimmung der Allele des Individuums (Bär et al. 1997). Für jede Elektrophorese muss dabei eine Allelleiter mitgeführt werden, da es zwischen den einzelnen Durchführungen zu Laufunterschieden kommen kann. Die Nomenklatur der Allele richtet sich dabei nach der Anzahl der gefundenen Wiederholungseinheiten. Sequenzierung Bevor die PCR-Produkte in das Taq-Cycle-Sequencing eingebracht werden konnten, mussten diese aufgereinigt werden. Die Taq-Polymerase, nicht verbrauchte dNTPs, Magnesium- und Chloridionen sowie überschüssige Primer sollen dabei entfernt
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Tabelle 3.10: Primersequenzen und Produktlängen der Triplex-PCR für den Nachweis von Salmonella<br />
und Borrelia.<br />
Genort Primersequenz Produktlänge<br />
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STY0312<br />
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recN<br />
GGGCTTGCCGAGACACAG<br />
TTAAGGCCTCGTCCATAAAAAC<br />
AGGAGGGGAATATCTCACTGG<br />
TGATCCCGTACAGACTGGTTATC<br />
TTATTTGGTTACAAAATTAAAGATGATG<br />
CCTAAAAAATAAACAACGTCTAAACTCA<br />
100<br />
88<br />
Amplifikation bei<br />
Salmonella typhi /<br />
paratyphi A /<br />
weltevreden<br />
S. enterica spec.<br />
(außer paratyphi A<br />
/ weltevreden)<br />
111 B. recurrentis<br />
In ersten Test-PCRs wurde ein Protokoll für die erfolgreiche Amplifikation mit Hilfe<br />
diverser Kontrollproben optimiert. Dazu gehören Positivkontrollen, menschliche<br />
Kontrollproben sowie DNA-Extrakte aus Bodenproben (im Detail siehe Schröder<br />
2013). Das optimierte Protokoll setzte sich aus folgenden Parametern zusammen<br />
(Tabellen 3.11 und 3.12):<br />
Tabelle 3.11: Komponenten eines 25µl-Ansatzes für die<br />
Amplifikation humanpathogener Sequenzen.<br />
Komponente<br />
µl je Probe<br />
AmpliTaq Gold 360 MasterMix 12,5<br />
Primer je 0,5<br />
H 2 O (Fa. Ambion) 9,5 – 0<br />
DNA-Extrakt 0,5 – 10,0<br />
Gesamtvolumen 25<br />
Tabelle 3.12: Cycling-Parameter für die Amplifikation humanpathogener<br />
Sequenzen.<br />
Schritt Temperatur (°C) Dauer (min) Zyklen<br />
Initial 95 5<br />
Denaturation<br />
Annealing<br />
Elongation<br />
94<br />
*<br />
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Delay 72 7<br />
1<br />
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Soak 10 10<br />
40 - 50<br />
* Annealing Temperatur: bei Bartonella/Rickettsia: 56°C; bei Salmonella/Borrelia:<br />
54°C;<br />
Alle PCRs wurden in einem DNA Thermal Cycler Typ Mastercycler® gradient bzw.<br />
personal der Firma Eppendorf durchgeführt.<br />
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