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Methoden - Kapitel 3.4. Tabelle 3.6: Sequenzen, Farbmarkierung und Konzentration in einem 25µl-Ansatz der Primer sowie die Produktlänge der amplifizierten Systeme. *Konzentration der Primer je Ansatz. System Sequenz (5‘-3‘) DYS19 CTGAGTTTCTGTTATAGTGTTTTTTAATATAT ATGGGTTAAGGAGAGTGTCACTATAT DYS385 AGAGAAAGAGGAAAGAGAAAGAAAG AAAAATAATCTATCTATTCCAATTACATAGTC DYS389 ATCCAACTCTCATCTGTATTATCTATGT GACTGCTAGATAAATAGATAGATTGATAGAG DYS390 CATTTTGGTACCCCATAATATATTC AGCAATGTGTATACTCAGAAACAAG DYS391 CTCTTGTGTATCTATTCATTCAATCATA AAATTGCCATAGAGGGATAGGTAG DYS392 CTACCAATCCCATTCCTTAGTAAA AAGGAAAACAAATTTTTTTCTTGTA DYS393 GTGGTCTTCTACTTGTGTCAATAC AAAACTCAAGTCCAAAAAATGAGG DYS437 AGTGATCCTCCTACCTCAGTCTC ACCACAGATAAATATCATTCATAGATAA DYS438 GAATAGTTGAACGGTAAACAGTATATTT GAGTGAAACTCCATTTCAAATAGAA DYS439 GGAGACAGATAGATGATAAATAGAAGAT ACCATCATCTCTTTACTTATACTTTCTATC [µM]* Markierung Produktlänge (bp) 6-FAM 0,15 154-190 HEX 0,4 120-204 6-FAM 0,4 I: 103-135 II: 199-239 NED 0,2 144-184 ROX 0,2 113-145 ROX 0,2 81-111 NED 0,15 109-141 ROX 0,25 177-193 HEX 0,2 77-117 NED 0,1 87-107 Zur Vermeidung von unspezifischen Nebenprodukten wurde eine geringe Menge Ammoniumsulfat in jeden Ansatz zugegeben. Ein Standardansatz mit 25µl Volumen und variablem DNA-Einsatz setzte sich somit aus folgenden Komponenten zusammen (Tab. 3.7): Tabelle 3.7: Komponenten eines 25µl-Ansatzes für die Analyse Y-chromosomaler STRs. Komponente µl je Probe Qiagen 2x Mastermix plus 12,5 Primerset 2,25 Ammoniumsulfat (3M) 0,2 H 2 O (Fa. Ambion) 9,55 – 0 DNA-Extrakt 0,5 – 10,05 Gesamtvolumen 25 Die Cycling-Parameter orientierten sich an den Herstellerempfehlungen für das Y- Powerplex-Kit (Fa. Promega) und beinhalten zwei unterschiedliche Annealing- Temperaturen zur Reduzierung unspezifischer Produkte (Tab. 3.8): 54

Methoden - Kapitel 3.4. Tabelle 3.8: Cycling-Parameter für die Analyse Y-chromosomaler STRs. Schritt Temperatur (°C) Dauer (min) Zyklen Initial 95 5 Denaturation Annealing Elongation Denaturation Annealing Elongation 94 62 70 90 59 70 1 1,5 1 1 1,5 1 Delay 60 45 Soak 10 10 10 30 - 40 Alle PCRs wurden in einem DNA Thermal Cycler Typ Mastercycler® gradient bzw. personal der Firma Eppendorf durchgeführt. 3.4.7. Amplifikation humanpathogener Bakterien-DNA In Zusammenarbeit mit Johanna Schröder wurden zwei Analysesysteme für die Untersuchung der Knochen auf humanpathogene Bakterien-DNA entwickelt. Dabei stehen besonders solche Spezies im Fokus, die eine typhus-ähnliche Symptomatik hervorrufen (vgl. Kap. 1.3.). In dieser Arbeit wurde sich auf Salomonella typhi, S. paratyphi, Bartonella quintana, Borrelia recurrentis und Rickettsia prowazekii konzentriert. Dabei wurde sich auf die jeweiligen Zielgene gestützt, die bereits für andere Nachweise in altem Skelettmaterial genutzt wurde (z.B. Raoult et al. 2006). Die Sequenzen, an denen die Primer designt wurden, sind auf NCBI abrufbar: STY0312/6: NC_003198.1; recN-Gen: NC_011244.1; dnaA-Gen: NC_000963.1; hbpE-Gen: NC_005955.1. Zur Entstehung der Nachweissysteme und Genauswahl siehe auch Schröder (2013). Während der Entstehung des Systems zeigte sich, dass das vorliegende Nachweissystem nicht zwischen S. paratyphi A und einer weiteren Salmonellen-Spezies (S. weltevreden, Brankatschk et al. 2011) unterscheiden kann, was die Aussagekraft an dieser Stelle einschränkt. Da beide Spezies jedoch sehr ähnlich zueinander sind, wurde das System trotzdem in dieser Form angewendet. Die Tabellen 3.9 und 3.10 zeigen die Primersequenzen und Produktlängen des Duplexbzw. Triplex-Systems. Tabelle 3.9: Primersequenzen und Produktlängen der Duplex-PCR für den Nachweis von Bartonella und Rickettsia. Genort Primersequenz (5‘ – 3‘) Produktlänge Amplifikation bei [bp] hbpE AGGCTGCAGATGTAATAGTTC ATCTGTCCTCCAAAATAAAAG 103 B. quintana dnaA GCAGTGATAGAATCACCTACTAA TACATCAAGTGTTGAAACGATA 87 R. prowazekii 55

Methoden - Kapitel 3.4.<br />

Tabelle 3.6: Sequenzen, Farbmarkierung und Konzentration in einem 25µl-Ansatz der Primer sowie die<br />

Produktlänge der amplifizierten Systeme. *Konzentration der Primer je Ansatz.<br />

System Sequenz (5‘-3‘)<br />

DYS19<br />

CTGAGTTTCTGTTATAGTGTTTTTTAATATAT<br />

ATGGGTTAAGGAGAGTGTCACTATAT<br />

DYS385<br />

AGAGAAAGAGGAAAGAGAAAGAAAG<br />

AAAAATAATCTATCTATTCCAATTACATAGTC<br />

DYS389<br />

ATCCAACTCTCATCTGTATTATCTATGT<br />

GACTGCTAGATAAATAGATAGATTGATAGAG<br />

DYS390<br />

CATTTTGGTACCCCATAATATATTC<br />

AGCAATGTGTATACTCAGAAACAAG<br />

DYS391<br />

CTCTTGTGTATCTATTCATTCAATCATA<br />

AAATTGCCATAGAGGGATAGGTAG<br />

DYS392<br />

CTACCAATCCCATTCCTTAGTAAA<br />

AAGGAAAACAAATTTTTTTCTTGTA<br />

DYS393<br />

GTGGTCTTCTACTTGTGTCAATAC<br />

AAAACTCAAGTCCAAAAAATGAGG<br />

DYS437<br />

AGTGATCCTCCTACCTCAGTCTC<br />

ACCACAGATAAATATCATTCATAGATAA<br />

DYS438<br />

GAATAGTTGAACGGTAAACAGTATATTT<br />

GAGTGAAACTCCATTTCAAATAGAA<br />

DYS439<br />

GGAGACAGATAGATGATAAATAGAAGAT<br />

ACCATCATCTCTTTACTTATACTTTCTATC<br />

[µM]*<br />

Markierung<br />

Produktlänge<br />

(bp)<br />

6-FAM 0,15 154-190<br />

HEX 0,4 120-204<br />

6-FAM 0,4<br />

I: 103-135<br />

II: 199-239<br />

NED 0,2 144-184<br />

ROX 0,2 113-145<br />

ROX 0,2 81-111<br />

NED 0,15 109-141<br />

ROX 0,25 177-193<br />

HEX 0,2 77-117<br />

NED 0,1 87-107<br />

Zur Vermeidung von unspezifischen Nebenprodukten wurde eine geringe Menge<br />

Ammoniumsulfat in jeden Ansatz zugegeben. Ein Standardansatz mit 25µl Volumen<br />

und variablem DNA-Einsatz setzte sich somit aus folgenden Komponenten zusammen<br />

(Tab. 3.7):<br />

Tabelle 3.7: Komponenten eines 25µl-Ansatzes für<br />

die Analyse Y-chromosomaler STRs.<br />

Komponente<br />

µl je Probe<br />

Qiagen 2x Mastermix plus 12,5<br />

Primerset 2,25<br />

Ammoniumsulfat (3M) 0,2<br />

H 2 O (Fa. Ambion) 9,55 – 0<br />

DNA-Extrakt 0,5 – 10,05<br />

Gesamtvolumen 25<br />

Die Cycling-Parameter orientierten sich an den Herstellerempfehlungen für das Y-<br />

Powerplex-Kit (Fa. Promega) und beinhalten zwei unterschiedliche Annealing-<br />

Temperaturen zur Reduzierung unspezifischer Produkte (Tab. 3.8):<br />

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