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Methoden - Kapitel 3.4.
3.4.3. Primerdesign
Neben der DNA-Extraktion ist ein hochsensitives Analysesystem entscheidend für
eine erfolgreiche, PCR-gestützte Analyse. Neben den optimalen Verhältnissen der
Chemikalien zueinander wird dies durch die Wahl der Primer erreicht. Die Primer
müssen zum einen spezifisch für den zu untersuchenden Genort sein, gleichzeitig
dürfen keine unspezifischen Nebenprodukte gebildet werden. Zum anderen müssen
sie hochsensitiv sein, um selbst geringste Mengen an DNA analysieren zu können.
Die Spezifität wird entscheidend durch die Länge der Primer beeinflusst. Für das
menschliche Genom mit etwa 3,2 Milliarden Basen wird statistisch gesehen ab einer
Länge von 18 Basen die Sequenz eines Primers einmalig. Dies gilt jedoch nur für
eine rein zufällige Basenabfolge – Sequenzdopplungen im Genom oder Analogien zu
anderen Spezies müssen immer überprüft werden. Gerade in den letzten Jahren hat
sich die Überprüfung der Spezifität durch die Möglichkeiten des basic local alignment
search tools (BLAST, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) entscheidend
vereinfacht. Durch eine einfache Eingabemaske kann durch Zugriff auf die Sequenzbibliothek
des National Centre for Biotechnological Information (NCBI,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) auf mögliche Nebenprodukte geprüft werden.
Die Spezifität der Primer kann weiter entscheidend
durch ein geeignetes Energieprofil
beeinflusst werden (vgl. Abb. 3.5, Hummel
2003). Durch eine hohe Bindungsenergie
am 5’-Ende der Primer und eine relativ
niedrige Bindungsenergie am 3’-Ende wird
eine Amplifikation nur dann stattfinden,
wenn der Primer tatsächlich komplett auf
die Bindungsstelle passt. Stattdessen könnte
ein umgekehrtes Energieprofil dazu führen,
dass auch unspezifische Nebenprodukte
entstehen können: Ein fest gebundenes 3’-
Ende ermöglicht dann eine Amplifikation,
auch wenn das 5’-Ende nicht passt.
Abbildung 3.5: Optimales Energieprofil eines
hypothetischen Primers. Die Bindung am 5‘-
Ende ist wesentlich höher als am 3‘-Ende. y-
Achse = Bindungsenergie in kcal/mol.
Die Sensitivität des Analysesystems wird durch die Vermeidung von primerinternen
Strukturen, wie beispielsweise Dimere oder Hairpins, bedingt. In der Literatur wird
deshalb häufig eine obere Grenze für Primer bei 30 Basen angegeben, um die Gefahr
der Bildung primerinterener Strukturen zu reduzieren. Heutige Software kann diese
Strukturen jedoch sehr effizient voraussagen, so dass auch Primer über 30 Basen
Länge keinen Tabu mehr darstellen. Das Primerdesign wurde mit Hilfe der Software
PrimerSelect des Softwarepakets Lasergene 10 (Fa. DNASTAR) durchgeführt.
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