Öffnen - eDiss - Georg-August-Universität Göttingen

Methoden - Kapitel 3.4.
Aufreinigung (EZ1)
Statt die etwa 4ml Lysat über die Waschpuffer zu reinigen,
konnten alternativ Protokolle für den EZ1-Roboter
(Qiagen) angewendet werden (Abb. 3.4), wofür das
Volumen jedoch zunächst mittels Zentrifugation verkleinert
werden musste. Die Zentrifugation wurde über
Amicons (Fa. Merck) mit einer Trenngröße von 30kDa
bei 3300rcf so lange durchgeführt, bis das gewünschte
Volumen erreicht wurde. Zwei unterschiedliche EZ1-
Protokolle kamen zum Einsatz: für das trace-Protokoll
der forensic card musste das Volumen 200µl betragen,
für das large volume-Protokoll der bone card 1500µl.
Der EZ1 wurde entsprechend den Herstellerangaben mit
dem jeweiligen Kit ausgestattet und das Protokoll nach
Herstellerangaben durchgeführt. Das Elutionsvolumen
Abbildung 3.4: EZ1 Advanced
(Qiagen).
betrug 50µl, die Extrakte wurden ebenfalls bis zur weiteren Verwendung bei 4°C
bzw. bei längerer Lagerung bei -20°C gelagert.
DNA-Extraktion aus Bodenproben
Für die Extraktion von DNA aus Bodenproben wurden 0,2g Sediment abgewogen
und mit einem Mörser fein zerstoßen. Nach Zugabe von 400µl G2-Puffer (Qiagen)
und 30µl Proteinase K wurden nach Inkubation bei 56°C für 2h 200µl Überstand in
den EZ1 überführt und nach dem trace-Protokoll extrahiert. Das Elutionsvolumen
betrug 100µl, die Lagerung fand analog wie bereits erwähnt statt.
DNA-Extraktion aus menschlichen Kontrollproben
Für die Extraktion von rezenten, menschlichen Kontrollproben wurde ein Mundschleimhautabstrich
mit Hilfe eines Wattestäbchens angefertigt. Die Watte wurde in
ein 2ml Eppendorf-Cup überführt und mit 400µl G2-Puffer (Qiagen) versetzt. Anschließend
wurden 10µl Proteinase K zugegeben und bei 56°C bei 350rpm auf dem
Heizblock für eine Stunde inkubiert. 200µl Volumen wurden anschließend in den
EZ1 überführt und nach dem trace-Protokoll extrahiert. Das Elutionsvolumen betrug
100µl, die Lagerung fand analog wie bereits erwähnt statt.
DNA-Extraktion bakterieller Proben
Von R. prowazekii wurden bereits DNA-Isolate aus der Gendatenbank geschickt
(vgl. Kap. 2.). Für die restlichen Bakterienzelllysate wurde keine gesonderte Extraktion
durchgeführt. Da die Bakterien kultiviert worden waren und die Zellen im jeweiligen
Labor zunächst in Wasser suspendiert und anschließend mittels Ultraschall
oder Hitze zerstört wurden (vgl. Kap. 2.), lag die DNA bereits in einem für eine PCR
geeigneten Medium vor.
48