Öffnen - eDiss - Georg-August-Universität Göttingen
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Methoden - Kapitel 3.4.<br />
SDS notwendig für den Abbau von Proteinstrukturen, damit sich die DNA anschließend<br />
frei in der Lösung befindet. 0,25g Knochenpulver wurden mit 3900µl EDTA<br />
(0,5M, pH 8,0, Fa. Invitrogen) und 100µl Proteinase K (Fa. Merck) versetzt und über<br />
Nacht bei 37°C für 18 Std. im Rotator inkubiert. Es folgte eine weitere Zugabe von<br />
50µl Proteinase K und eine Inkubation für 2h bei 56°C. Für einen letzten Inkubationsschritt<br />
wurden 50µl SDS (20mg/ml, Fa. Sigma Life Science) zugegeben und bei<br />
65°C 5min rotiert. Zur Sedimentierung von nicht löslichen Feststoffen wurde abschließend<br />
für 3min bei 3300rcf zentrifugiert.<br />
Aufreinigung (manuelles Protokoll)<br />
Durch die verschiedenen Waschpuffer soll die DNA von anderen Bestandteilen des<br />
Lysats getrennt werden. Im ersten Waschschritt wurden 16ml PB-Buffer (Qiagen)<br />
und 100µl Natriumacetatpuffer (pH 5.2, Fa. Sigma Life Science) in einem FalconTube<br />
(Fa. Sarstedt) vorgelegt und das zentrifugierte Lysat hinzugefügt. Nach manueller<br />
Mischung und anschließender Zentrifugation bei 3300rcf für 3min wurde das Gemisch<br />
mittels Vakuum über MinElute-Säulchen (Qiagen) abgesaugt. Dafür wurde<br />
das QiaVac-System (Qiagen) mit entsprechender Ausstattung inkl. Trichteraufsatz<br />
für große Volumina genutzt (Abb. 3.3). Das angelegte Vakuum betrug -800mbar.<br />
Nach erfolgreicher Durchführung erfolgten<br />
weitere Waschschritte jeweils mittels<br />
PE-Buffer (Qiagen). In einem ersten<br />
Durchgang wurden 700µl Puffer auf die<br />
Säule gegeben und nach 5min abgesaugt.<br />
Es folgte eine zweimalige Wiederholung<br />
mit 700µl Puffer ohne Wartezeit. Um den<br />
ethanolhaltigen Puffer vollständig aus der<br />
Säule zu entfernen, wurde abschließend<br />
für 1min bei 16.100rcf zentrifugiert und<br />
die Säule bei geöffnetem Deckel 15min<br />
stehen gelassen.<br />
Abbildung 3.3: QiaVac-System. Die Vakuumpumpe<br />
(rechts) baut das Vakuum für den Probenständer<br />
(links) auf.<br />
Die Säulen wurden für die Eluierung der DNA auf 1,7ml-Cups (Sarstedt) gesteckt.<br />
30µl des auf 56°C erhitzten Wassers (Ambion) wurde auf die Säule pipettiert und<br />
nach 5min bei 16.100rcf für 1min zentrifugiert. In einem zweiten Schritt wurden<br />
erneut 30µl Wasser zugegeben und abzentrifugiert. Die Säule wurde anschließend<br />
verworfen und das Extrakt bis zur weiteren Verwendung bei 4°C bzw. bei längerer<br />
Lagerung bei -20°C gelagert.<br />
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