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Methoden - Kapitel 3.4.
Carry-over
Als Carry-over wird das Verschleppen von PCR-Produkten vorhergehender Amplifikationen
in die Gefäße der aktuellen PCR bezeichnet, wo sie bevorzugt amplifiziertwerden
(Kwok 1990). Um solches zu verhindern, wurde eine strikte Trennung von
Prä- und Post-PCR-Laboren eingeführt. Außerdem gilt die Einbahnstraßenregelung,
d.h. die Bearbeiter dürfen die Laboratorien mit derselben Kleidung nur von Prä- in
Richtung Post-PCR-Bereich betreten.
3.4.2. DNA-Extraktion
Im Laufe dieser Arbeit wurden die Extraktionsverfahren mehrfach überarbeitet und
weiter optimiert. Grundsätzlich kamen zwei verschiedenen Vorgehen zum Einsatz:
zum einen die Verwendung des Biorobot EZ1® der Firma Qiagen, zum anderen eine
manuelle Extraktion mit Hilfe der MinElute® Säulchen (ebenfalls Fa. Qiagen). Beide
Vorgehen haben Vor- und Nachteile, die sich gemeinsam jedoch gut ergänzen können.
So stellt der Biorobot eine gleich bleibende Probenbehandlung sicher und liefert
hochreine DNA-Extrakte, es kommt jedoch zu einem gewissen Grad zu einem DNA-
Verlust, d.h. nur eine bestimmte Menge an DNA kann aus der Probe gewonnen werden.
Bei dem manuellen Extraktionsverfahren hingegen kann deutlich mehr DNA
pro Probe isoliert werden, wobei die Aufreinigung unter Umständen nicht vollständig
stattfindet und Spuren von Inhibitoren weiterhin im Extrakt vorhanden sind. Je nach
Probenbeschaffenheit kann sich eine der beiden Verfahren als das bessere herausstellen,
wobei aufgrund der höheren DNA-Ausbeute und der geringeren Kosten zunächst
immer das manuelle Protokoll angewendet worden ist. Nur bei offensichtlich stark
inhibierten Extrakten wurde zusätzlich das Biorobot-Protokoll durchgeführt. Im Folgenden
sind die einzelnen Schritte der Protokolle aufgeführt. Dabei sind die Vorbereitung
und die Lyse des Knochenpulvers bei beiden Vorgehensweisen gleich, nur
die Aufreinigungsschritte unterscheiden sich. Die Volumina der Reagenzien sind auf
den Einsatz von 0,25g Knochenpulver optimiert. Entsprechend kann das Protokoll
für mehr oder weniger Knochenpulver angepasst werden.
Vorbereitung
Für beide Protokolle muss der Knochen zunächst pulverisiert werden. Dazu wurde
ein etwa 1 x 2cm großes Stück mit Hilfe eines Handbohrers mit Diamantsägeblatt
herausgesägt, die Oberfläche zum Schutz vor anhaftender Kontamination abgetragen
und anschließend mittels Stahlmörser zerkleinert. Die erhaltenen Fragmente wurden
in einer Kugelschwingmühle bei 24 Schwingungen pro Sekunde für eine Minute zu
einem feinen Pulver zerstoßen. Bei längerer Lagerung wurde das Pulver bei -20°C
tiefgefroren. Die eingesetzte Knochenmenge pro Extrakt betrug in der Regel 0,25g,
die mittels Feinwaage abgewogen wurden.
Lyse
Während im Folgenden das eingesetzte EDTA die Auflösung der Knochenmatrix
durch Bindung der Calcium-Ionen bewirkt, ist die Zugabe von Proteinase K als auch
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