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Methoden - Kapitel 3.4.
3.4. DNA-Analytik
3.4.1. Kontaminationsprävention
Die Analyse von alter bzw. degradierter DNA, die meistens in geringen Mengen vorliegt,
ist überhaupt erst durch das Konzept der PCR möglich geworden. Die hohe
Sensitivität dieser Reaktion, die es gewährleistet, auch geringste Spuren von DNA zu
vervielfältigen, ist gleichzeitig aber auch ihr größter Nachteil: bereits ein Eintrag
kleinster Mengen rezenter DNA reicht aus, um die Analyse der eigentlichen Probe zu
überdecken und kann so zu falschen Ergebnissen führen. Deswegen muss beim Bearbeiten
der Proben das Kontaminationsrisiko so gering wie möglich gehalten werden.
Um den Erfolg der Prävention zu überprüfen, wurden regelmäßig Leerkontrollen
in die PCR mit eingebracht.
Kontamination durch den Bearbeiter
Die größte Gefahr durch rezente Kontamination geht vom Bearbeiter selbst aus:
Hautschuppen, Haare, Speichel oder Tränenflüssigkeit können in die PCR eingebracht
werden, selbst geringste Mengen an rezenter DNA können dann zu falschpositiven
Ergebnissen führen (Kitchin et al. 1990). Um dieses Risiko zu senken,
wurde während der gesamten Probenvorbereitung und im Prä-PCR-Bereich ein
Schutzkittel sowie Mundschutz, OP-Haube und Einmalhandschuhe getragen. Um
mögliche Kontaminationen sofort als solche zu identifizieren, wurde außerdem der
genetische Fingerabdruck und weitere genetische Daten aller im Institut Arbeitenden
in einer Datenbank gespeichert, so dass die gewonnenen Ergebnisse abgeglichen
werden können.
Kontamination durch das verwendete Material
Auch das verwendete Material, wie z.B. die Eppendorf-Cups, die Pipettenspitzen und
die verwendeten Chemikalien, können mit DNA verunreinigt sein (Schmidt et al.
1995). Um die Möglichkeit von falschen Ergebnissen durch solche Verunreinigungen
zu minimieren, wurden die Materialien vor der Benutzung mit UV-Licht bestrahlt,
die enthaltene DNA also künstlich degradiert. Zusätzlich wurde in einem speziellen
UV-Kabinett pipettiert, bei dem nach erfolgter Arbeit alle Oberflächen mit
UV-Licht bestrahlt wurden. Somit soll die Anzahl intakter Zielsequenzen möglichst
unter die Nachweisgrenze gebracht werden.
Kreuzkontamination zwischen den Proben
Um eine Kontamination zwischen den Proben zu verhindern, wurden hauptsächlich
Einwegmaterialien (z.B. Pipettenspitzen) verwendet. Wo diese Praxis unrentabel
wäre, also z.B. bei Bohrköpfen, Pinzetten oder Skalpellen, wurden die verwendeten
Materialien nach jeder Benutzung gründlich mit Seife (Alconox®), destilliertem
Wasser und 70%igem Ethanol gereinigt. Dies gilt auch für die gesamten Arbeitsflächen
sowie alle Oberflächen, an denen es zu Kontamination von z.B. Knochenpulver
hätte kommen können.
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