DNA Isolation aus pflanzlichen und tierischen Zellen

Praktikum KSWil
DNA Isolation aus pflanzlichen und tierischen Zellen
Name Schule Klasse Datum
Theorie
Der Aufbau der DNA
Bereits zu Beginn des 20. Jahrhunderts hatten Biologen erkannt, dass die genetische Information sich im
Zellkern auf den Chromosomen befindet. Wenig später fanden Chemiker heraus, dass Chromosomen aus zwei
Molekülsorten bestehen: aus Proteinen und Desoxyribonukleinsäure, abgekürzt DNA (A für engl. acid: Säure). Da
man annahm, dass die genetische Substanz genauso vielfältig sein müsse wie die sichtbaren Merkmale, hielt
man zunächst Proteine für die Träger der Erbinformation. Deren Aufbau aus 20 verschiedenen Bausteinen, den
Aminosäuren, war bereits bekannt, ebenso die Vielfalt, die sich aus der immer wieder variierten Reihenfolge
dieser Bausteine ergab. Über DNA wusste man hingegen noch relativ wenig. Der Biochemiker MIESCHER hatte
1869 DNA als phosphorhaltige Säure beschrieben. Sie schien jedoch zu einfach gebaut um Informationen für die
Vielzahl vererbter Merkmale der verschiedenen Organismen zu enthalten. Erst die überraschenden Ergebnisse
von Bakterienversuchen veränderten diese Einschätzung.
Entdeckung der Transformation
1928 beobachtete der britische Mediziner GRIFFITH,
dass Bakterien der Gattung Pneumococcus, Erreger
einer bei Mäusen tödlich verlaufenden
Lungenentzündung, in zwei Stämmen auftreten: Beim
so genannten S-Stamm sind je zwei Zellen von einer
Schleimkapsel umgeben (S von engl. smooth: glatt, da
die Bakterienkolonien mit glatter Oberfläche
wachsen). Beim R-Stamm fehlt die Schleimkapsel (R
von engl. rough: rau), die Kolonien haben eine raue
Oberfläche. GRIFFITH stellte fest, dass nur Bakterien
des S-Stamms eine Erkrankung auslösen. Als er den
Mäusen durch Hitze abgetötete S-Pneumokokken
injizierte, überlebten die Tiere (Abbildung links).
Daraufhin mischte er abgetötete S-Pneumokokken
mit lebenden R-Pneumokokken. Die Mäuse starben,
Abb. 1: Experimente von Griffith
obwohl beide Bakterienstämme für sich ungefährlich
waren, wie die Abbildung rechts zeigt. Die krankheitserregende Eigenschaft war auf unbekannte Weise von den
abgetöteten S-Pneumokokken auf die harmlosen, aber teilungsfähigen R-Pneumokokken übertragen worden.
Diesen Vorgang nennt man Transformation. Worauf die Übertragung basiert, blieb zunächst ungeklärt.
DNA als transformierendes Prinzip
Im Jahr 1944 gelang es dem Bakteriologen AVERY, den Stoff
zu identifizieren, der die Transformation bewirkte. Er trennte
die Molekülsorten aus abgetöteten S-Pneumokokken und
setzte die Substanzen - Polysaccharide, Proteine und DNA -
jeweils einzeln Kulturen von R-Pneumokokken zu. Unter den
Nachkommen dieser R-Pneumokokken erzeugten nur
diejenigen Schleimkapseln, die mit DNA vermischt worden
waren (Abbildung vordere Seite). Eine Überprüfung ergab,
dass die transformierten Pneumokokken jetzt für Mäuse
gefährlich waren. AVERY wiederholte den Versuch in
gleicher Weise, behandelte aber die S-Pneumokokken-DNA
mit einem DNA-zerstörenden Wirkstoff. In diesem Fall kam
Abb. 2: Experimente von Avery
es nicht zu einer Informationsübertragung. AVERY hatte
damit bewiesen, dass die Information für die Ausbildung
bestimmter Merkmale in der DNA der Bakterien enthalten ist und in dieser Form auf andere Zellen übertragen
werden kann.
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Zusammensetzung der DNA
Die DNA ist ein kettenförmiges, unverzweigtes Makromolekül.
Wird sie durch Kochen mit Säure hydrolysiert, finden sich stets die
folgenden Bestandteile: der Pentosezucker Desoxyribose,
Phosphorsäure und vier verschiedene organische Basen, die
neben Kohlenstoffatomen auch Stickstoffatome enthalten
(Abbildung rechts). Es gibt zwei Typen dieser stickstoffhaltigen
Basen. Pyrimidine sind durch einen einfachen Ring aus sechs
Atomen gekennzeichnet. Zu ihnen zählen Cytosin und Thymin.
Adenin und Guanin gehören zur Stoffklasse der Purine, die aus
einem Doppelringsystem bestehen und deren Moleküle daher
etwas grösser sind. Häufig kürzt man die Basen mit ihren
Anfangsbuchstaben A, C, G und T ab.
Anordnung der Bausteine
Wird DNA mithilfe des Enzyms DNAse zerlegt, entstehen
Einheiten, die man als Nucleotide bezeichnet. Diese Monomere
sind die Kettenglieder der DNA. Sie bestehen aus je einem
Molekül Desoxyribose, einer Phosphatgruppe und einer der vier
Basen. Verbindungen aus Desoxyribose und einer der vier Basen
nennt man Nucleoside.
In einem DNA-Molekül sind viele Millionen Nucleotide so
aneinander gereiht, dass die Zuckerreste der Nucleoside jeweils
über eine Phosphatgruppe miteinander verbunden sind. Auf diese
Weise entsteht eine Zucker-Phosphat-Kette, die man als Rückgrat
des Moleküls bezeichnet. An dieses Rückgrat sind über die Zucker
die stickstoffhaltigen Basen angehängt.
Um die Verbindung genauer beschreiben zu können, werden die C-
Atome der Pentose-Ringe von 1' bis 5' durchnummeriert. (Die
hochgestellten Striche an den Ziffern dienen dazu, die C-Atome
von denen der Basen zu unterscheiden.) Demnach steht immer das
C-5'-Atom eines Desoxyribosemoleküls über eine Phosphatgruppe
mit dem C-3'-Atom des nächsten Zuckermoleküls in Verbindung.
Mithilfe dieser Zählung lässt sich auch verdeutlichen, dass die
Kette eine Polarität aufweist. An seinem so genannten 5' - Ende
trägt das Molekül eine Phosphatgruppe und am 3'-Ende eine OH-
Gruppe (Abbildung rechts).
Abb. 3: Zusammensetzung der DNA
Basenzusammensetzung
Der Biochemiker CHARGAFF untersuchte DNA-Proben
verschiedener Organismen. Dabei stellte er unter anderem fest,
dass sich die jeweiligen Anteile der vier Basen von Art zu Art Abb. 4: Aufbau der DNA
unterscheiden. Proben, die aus verschiedenen Geweben desselben
Organismus stammten, hatten jedoch die gleiche Basenzusammensetzung. Anhand seiner Ergebnisse
formulierte er die folgenden Regeln, die die Verhältnisse der Basen zueinander beschreiben:
1. Die Gesamtmenge der Purinbasen (A+G) in einer Probe entspricht der Gesamtmenge der Pyrimidinbasen (C+
T).
2. Die Menge an Adenin stimmt mit der Menge des Thymins überein. Cytosin ist stets in derselben Menge
vorhanden wie Guanin.
3. Das Verhältnis von (A+ T) zu (C+G) ist in den DNA-Proben aus verschiedenen Organismen unterschiedlich.
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Das Watson-Crick-Modell der DNA
Nachdem die DNA als der Träger der genetischen Information akzeptiert war, versuchten mehrere
Forschungsteams ihre dreidimensionale Struktur aufzuklären. JAMES WATSON und FRANCIS CRICK, zwei
junge, bis dahin recht unbekannte Forscher, veröffentlichten 1953 als Erste ein Strukturmodell, das mit allen
bekannten Eigenschaften der DNA in Einklang stand. Dabei gelang es ihnen, die Ergebnisse anderer Forscher
richtig miteinander in Verbindung zu bringen.
WATSON und CRICK kannten die Röntgenbeugungsmuster von DNA (Abbildung rechts). Röntgenstrahlen, die
beim Durchdringen kristallisierter DNA gebeugt werden, erzeugen auf
einem Röntgenfilm schwarze Flecken. Aus dem Muster kann man auf die
räumliche Struktur des untersuchten Moleküls rückschliessen. WATSON
und CRICK erkannten, dass die DNA eine schraubenförmige oder helicale
(von griech. helix: Wendel) Struktur haben musste. Aus dem Vergleich
mehrerer Aufnahmen leiteten sie ab, dass das Molekül aus zwei
gleichartigen Strängen besteht. Sie nahmen an, dass zwei DNA-Ketten
über die gesamte Länge des Moleküls schraubig umeinander gewunden
sind, also eine Doppelhelix bilden. Als Durchmesser der Doppelhelix
berechneten sie 2 nm. Ausserdem trafen sie Aussagen über die Abstände Abb. 5: Röntgenbeugungsmuster
der Basen zueinander und deren Anzahl pro Windung.
Basenpaarung
WATSON und CRICK versuchten anhand von
massstabsgetreuen Molekülmodellen die Daten aus der
Röntgenstrukturanalyse mit den Kenntnissen über die
chemischen Eigenschaften der DNA zu verbinden. Nach
anfänglichen Fehlversuchen ordneten sie die Zucker-
Phosphat-Ketten so an, dass die Stickstoffbasen ins
Innere der Doppelhelix gerichtet waren. Aus den
Arbeiten von CHARGAFF schlossen die Forscher, dass
sich von vier Basen stets nur zwei zu Paaren
zusammenschliessen: Adenin mit Thymin und Cytosin
mit Guanin. Für diese Annahme sprachen starke
Argumente: Zum einen können sich zwischen den
Molekülen Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden
(Abbildung links). Zum anderen ergab sich der
berechnete Durchmesser der Doppelhelix nur, wenn
stets eine - kleinere - Pyrimidinbase mit einer - grösseren
- Purinbase gepaart wurde. WATSON und CRICK
bezeichneten die jeweils zueinander passenden Basen
als komplementär.
Konsequenzen des Modells
Da die Basenpaarungen chemisch festgelegt sind,
bestimmt die Reihenfolge der Basen in einem Strang,
seine Basensequenz, eindeutig die Basenabfolge im
zweiten Strang. Die beiden DNA-Stränge entsprechen
sich also, auch sie sind zueinander komplementär. Dabei
zeigen ihre Zucker-Phosphat-Rückgrate eine gegenläufige
Orientierung:
Die 5' 3'-Richtung des einen Strangs verläuft
entgegengesetzt zu der des anderen Strangs. Die
Stränge sind antiparallel.
WATSON und CRICK ahnten bereits, dass die spezifische
Basenpaarung und die Festlegung der Basensequenz
eines Strangs durch den anderen von entscheidender
Abb. 6: Basenpaarung
Abb. 7: DNA-Aufbau
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Bedeutung für die genetischen Eigenschaften der DNA sein mussten. Heute weiss man, dass die Basen der
Nucleotide die Buchstaben des genetischen Alphabets darstellen. Sie codieren die Erbinformation durch ihre
Reihenfolge (Abbildung links).
DNA und Chromosom
Die Erbsubstanz eines Bakteriums wie E.
coli besteht aus einem einzigen
ringförmigen DNA-Molekül mit etwa 5
Millionen Nucleotidpaaren. Die
genetische Information des Menschen
umfasst etwa 3 Milliarden Nucleotidpaare.
Zum Vergleich: Auf eine Seite dieses
Buches passen rund 6000 Buchstaben. Bei
einem Umfang von etwa 500 Seiten sind
das 3 Millionen Buchstaben. Die
Basensequenz der menschlichen DNA
würde also 1000 solcher Bände füllen. Im
Zellkern ist diese Informationsmenge auf
46 DNA-Moleküle unterschiedlicher
Grösse verteilt, die zwischen 50 und 250
Millionen Nucleotidpaare enthalten.
Lägen sie in gestreckter Form vor, wären
Abb. 8: Aufgebrochenes Chromosom mit Scaffold-Protein
sie zwischen 1,7 cm und 8,5 cm lang. Für
alle Chromosomen zusammen ergibt das eine Strecke von über 2 m. Die Frage ist, wie diese 2 m DNA im Innern
eines Zellkerns von lediglich etwa 5 μm Durchmesser Platz finden.
Abb. 9: Chromatin
Chromatin
Die DNA aller Eukaryoten ist mit einer Vielzahl von
Proteinen verbunden (Abbildung rechts). Dieser DNA-
Protein-Komplex wird als Chromatin bezeichnet. Das
Chromatin kommt während des Zellzyklus in
verschiedenen Verpackungszuständen vor, die eng mit der
Aktivität des Chromatins zusammenhängen. Die
kompakteste Verpackung erfolgt vor der Zellteilung: Die
DNA-Moleküle werden in ihrer Transportform als Chromosomen
sichtbar. Die unterschiedlichen Verpackungszustände der
DNA lassen sich auch experimentell erzeugen. Daraus wurde
geschlossen, dass es verschiedene Verpackungsstufen gibt, die
aufeinander aufbauen.
Abb. 10: Verpackung der DNA
Ebenen der DNA-Verpackung (Abbildung unten)
Durch Präparation mit einem Streckungsmittel erscheint im
elektronenmikroskopischen Bild als Grundelement des Chromatins
eine 10 nm dicke Fibrille, die mit perlschnurartig aufgereihten
Nucleosomen besetzt ist. Nucleosomen bestehen aus DNA und
bestimmten Proteinen, den Histonen. Die DNA ist in zwei
Windungen um einen kugelförmigen Proteinkern aus acht Histon-
Untereinheiten gewunden. An der Aussenseite dieser "Perle" ist ein
weiteres Histonmolekül angeheftet. Durch diese Form der Verpackung
wird die DNA um den Faktor 7 verdichtet.
In der Interphase liegt das Chromatin als Filament von etwa 30 nm
Durchmesser vor. Dabei ist die Nucleosomenkette in Form eines
Hohlzylinders so aufgewickelt, dass immer sechs Nucleosomen in
einer Ebene liegen. Dies sorgt für eine etwa 40fache Verdichtung des
Chromatins.
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Vor Zellteilungen kondensieren die Chromatinfibrillen zu wesentlich kompakteren Strukturen, indem sie sich an
bestimmten Stellen an ein Gerüst aus Nicht-Histon-Proteinen im Zellkern anheften und Schleifen bilden. Durch
weiteres Verdrillen und Auffalten wird schliesslich die Chromatidstruktur eines Metaphase-Chromosoms
erreicht. In diesem Zustand hat ein Chromatin-Faden einen Durchmesser von etwa 700 nm. Seine Länge ist von
durchschnittlich 5 cm auf nur noch 50 μm geschrumpft. Das entspricht einer Verdichtung um das 10000fache.
Auftrag: Die DNA liegt im Zellkern in unterschiedlichen Verpackungszuständen vor. Nenne die verschiedenen
Strukturebenen und erkläre, wie sie zustande kommen.
Die Replikation der DNA
Bei der Zellteilung wird die gesamte Erbinformation einer
Zelle an die nächste Zellgeneration weitergegeben. Damit
dabei keine Information verloren geht, wird die Erbsubstanz
vorher - ähnlich wie bei einem Kopiervorgang - verdoppelt.
Den Prozess bezeichnet man als identische Verdopplung
oder Replikation der Erbinformation.
Das Grundprinzip der Replikation. Die Vervielfältigung der
DNA beruht auf dem Prinzip der komplementären
Basenpaarung. Das hatten WATSON und CRICK bereits
1953 erkannt, als sie ihr DNA-Modell veröffentlichten. Da
sich Adenin immer nur mit Thymin und Cytosin mit Guanin
verbindet, kann ein DNA-Einzelstrang als Matrize für die
Bildung des komplementären Strangs dienen. Die beiden
komplementären DNA-Stränge trennen sich voneinander,
vergleichbar mit dem Öffnen eines Reissverschlusses. An
Abb. 11: DNA-Replikation Übersicht
die nun freiliegenden Basen jedes Einzelstrangs lagern sich
jeweils Nucleotide mit komplementären Basen an. Die
Nucleotide werden miteinander zu Ketten verknüpft. Dadurch entstehen zwei Doppelstränge, deren
Basensequenzen völlig identisch sind.
Das Meselson-Stahl-Experiment
MESELSON und STAHL liessen E.-coli-Bakterien auf
einem Nährboden wachsen, der anstelle von gewöhnlichem
Stickstoff ( 14 N) das Isotop 15 N enthielt.
Die Bakterien bildeten aus diesem schweren Stickstoff
15 N-haltige Nucleotidbasen, die bei jeder
Replikation in die DNA eingebaut wurden. Auf diese
Weise entstanden Bakterien mit schwerer DNA.
Danach übertrugen die Forscher die Bakterien auf
normales Nährmedium mit 14 N. Nach jeder Zellteilung
extrahierten sie aus einem Teil der Bakterien
die DNA und untersuchten sie mithilfe der
Dichtegradientenzentrifugation. Mit dieser Methode
lassen sich die verschieden schweren DNA-Sorten Abb. 12: Experimente von Meselson und Stahl
unterscheiden. Moleküle derselben, also gleich
schweren Sorte lagern sich in derselben Höhe ab und sind als Banden sichtbar (Abbildung oben).
Enzyme der Replikation
Die Replikation der DNA ist ein kontrollierter Vorgang, der, wie jeder andere Stoffwechselprozess auch, mithilfe
von Enzymen gesteuert wird. Dabei unterliegt jeder Teilschritt des Prozesses einer enzymatischen Kontrolle. Zunächst
werden die beiden Stränge der Doppelhelix durch das Enzym Helicase entwunden und auseinander
geschoben. Dabei entsteht eine Y-förmige Struktur, die man als Replikationsgabel bezeichnet. Die Nucleotide,
die sich spontan an die freien Einzelstränge anlagern, werden von einer DNA-Polymerase miteinander verkettet.
Alle bisher bekannten DNA-Polymerasen verbinden ein freies Nucleotid immer über dessen Phosphatgruppe mit
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der OH-Gruppe des 3'-C-Atoms der Desoxyribose. Das bedeutet, dass DNA stets in 5' 3'-Richtung synthetisiert
wird. Das hat für die DNA-Replikation zwei Konsequenzen:
Zum einen benötigt die DNA-Polymerase zu Beginn
der Replikation ein Startermolekül mit einer freien OH-
Gruppe, über die das erste Nucleotid gebunden
werden kann. Diese Funktion erfüllen kurze Primer aus
RNA, die vom Enzym Primase an beiden Strängen der
Replikationsgabel angebracht werden.
Zum anderen ergibt sich daraus, dass der
Kopiervorgang nur an einem der beiden Stränge
kontinuierlich ablaufen kann. Dort heftet die DNA-
Polymerase die Nucleotide jeweils an das 3'-Ende des
wachsenden Strangs an, also in derselben Richtung,
mit der sich die Replikationsgabel über die DNA-
Matrize bewegt. Dieser Strang wird deshalb als
kontinuierlicher Strang bezeichnet. Am komplementären
Strang arbeitet die DNA-Polymerase
hingegen in die andere Richtung, also entgegengesetzt
der Bewegungsrichtung der Replikationsgabel.
Dabei entstehen in 5' 3'-Richtung zunächst DNA-
Stücke von 100 bis 200 Nucleotiden Länge, die nach
ihrem Entdecker als Okazaki-Fragmente bezeichnet werden. Die Fragmente
werden anschliessend - in 3' 5'-Richtung - durch das Enzym DNA-Ligase
miteinander verknüpft. Da an diesem Gabelast das Wachstum nicht durchgehend
erfolgt, bezeichnet man ihn als diskontinuierlichen Strang.
Eigenschaften des Replikationsvorgangs
Die Replikation eines DNA-Moleküls beginnt an spezifischen Stellen, den Replikationsursprüngen.
Bakterielle Chromosomen enthalten nur einen
Replikationsursprung. Bei Eukaryoten weist ein DNA-Molekül Hunderte
solcher Startpunkte auf.
Abb. 13: Replikation Details
Die Geschwindigkeit der Replikation beträgt beim Menschen etwa 50
Nucleotide pro Sekunde, bei Bakterien sogar 500 Nucleotide pro Sekunde. E. coli kann seine DNA, die 5 Millionen
Nucleotidpaare umfasst, in einer Stunde verdoppeln.
Ebenso beeindruckend wie die Geschwindigkeit ist die Präzision, mit der die Verdopplung der DNA erfolgt.
Statistisch unterläuft einer DNA-Polymerase beim Anfügen von 106 bis 108 Nucleotiden nur ein Fehler. Diese
Kopiergenauigkeit ist die Voraussetzung dafür, dass die genetische Information eines Organismus weitgehend
unverändert erhalten bleibt. Wenn bei der Replikation eine chemisch ähnliche oder eine nichtkomplementäre
Base in den DNA-Folgestrang eingebaut wird, kann eine Punktmutation entstehen.
Korrektur von Replikationsfehlern
Enzymatische Prozesse sorgen während und nach der Replikation dafür, dass Fehlpaarungen in der fertigen DNA
nur mit einer Häufigkeit von 1:10000000 auftreten. Die DNA-Polymerase arbeitet sehr präzise. Während der
Polymerisation der Nucleotidkette überprüft sie, ob sich zwischen dem angelagerten Nucleotid und der Base des
Matrizenstrangs Wasserstoffbrücken ausbilden. In der Regel werden nur komplementäre Basen eingebaut.
Gleichzeitig erfüllt die DNA-Polymerase eine Art Korrekturlesefunktion. Wird dennoch ein falsches Nucleotid
eingebaut, so behindert dies das Weitergleiten des Moleküls zur nächsten Bindungsstelle. In diesem Fall kann die
DNA-Polymerase auch als Exonuclease fungieren: Sie trennt das fehlgepaarte Nucleotid vom wachsenden Ende
der DNA-Kette ab und die richtige Base kann sich anlagern.
Fehler in der DNA können jedoch auch im Nachhinein entstehen, zum Beispiel durch Umwelteinflüsse wie
Chemikalien, UV-Licht oder radioaktive Strahlung. Die Zelle verfügt über ein System verschiedener
Reparaturenzyme um solche DNA-Schäden in den meisten Fällen auszugleichen.
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Wie kann DNA aus Zellen isoliert werden?
Schritt 1. Sammeln von Zellen
Die beste Variante ist das Sammeln von Einzellzellen oder kleinen Zellverbänden. Gewebe müssen häufig
zerstört und die Zellen abgetrennt werden. Die Innenseite des Mundes ist eine gute Quelle für Zellen. Diese
Zellen teilen sich sehr oft und werden kontinuierlich abgelöst, so dass sie in grosser Anzahl zur Verfügung
stehen. Ein einfaches Auswaschen der Innenseite des Mundes durch Kauen an den Wangenseiten, vorsichtig,
aber gründlich, ermöglicht es, eine Menge Zellen zu sammeln, aus denen die DNA isoliert werden kann.
Pflanzliche Gewebe werden in der Regel stark zerkleinert und sorgfältig gemörsert.
Schritt 2. Lyse der Zellen und Aufbrechen der Phosphlipid-Doppelschicht Membranen
Der nächste Schritt bei der DNA Extraktion ist das Aufbrechen der Zellmembranen. Ein Detergens löst auf Fetten
basierende Moleküle auf. Die Membranen der Zellen und Zellkerne bestehen hauptsächlich aus Fetten (Sie
haben wahrscheinlich schon gehört, dass Zellmembranen aus „einer Phosopholipid-Doppelschicht“ bestehen).
Nach dem Abschaben der Zellen geben Sie sie in eine Lösung, die Detergens enthält.
Schritt 3. Einsetzen von Protease, um die zellulären Proteine zu zerstören
Proteine stören die Präzipition von DNA. Diese Proteine können leicht entfernt werden, ohne die DNA zu
zerstören, wenn man spezifische Enzyme, genannt Proteasen einsetzt, die Proteine verdauen. Die Proteasen
zerstören die Peptidbindungen zwischen den Aminosäuren der Proteine. Zerstört man alle Proteine, wird man
auch DNasen entfernen, Enzyme, die DNA verdauen (weil Enzyme Proteine sind). Damit erreicht man, dass die
DNA nicht in zu kleine Stücke zerschnitten wird
Schritt 4. DNA wird unlöslich gemacht
Die DNA löst sich im Zellextrakt relativ gut, weil die Phosphatgruppen im Rückgrat der DNA eine negative
elektrische Ladung haben und sich somit gegenseitig abstossen. Gibt man Salz zu, so werden die positiv
geladenen Natriumionen aus dem Salz von der negativen Ladung der DNA angezogen und neutralisieren die
elektrische Ladung der DNA. Dies ermöglicht den DNA Molekülen eine Annäherung.
Schritt 5. Fällen der DNA mit kaltem Alkohol
Um die DNA von anderen Molekülen im Zellextrakt zu trennen, gibt man Alkohol zur Probe. Durch die Zugabe
von kaltem Alkohol wird die DNA ausfallen, denn sie ist in Alkohol schlechter löslich als in Wasser. Je kälter das
Ethanol ist, desto schlechter ist die DNA löslich. Dies ist vergleichbar mit der Löslichkeit von Zucker im Tee;
Zucker löst sich besser in heissem Tee als in Eistee.
In Anwesenheit von hohen Salzkonzentrationen und kaltem Alkohol, wird die DNA, die aus den Zellen
freigesetzt wurde, ausfallen und aggregieren, bis sie mit blossem Auge erkennbar ist. Die anderen Moleküle des
Zellextraktes wie Aminosäuren und Kohlehydrate bleiben in Alkohol und in Wasser gelöst und sind nicht
sichtbar. Es sind viele tausend DNA Stränge nötig, um eine Faser zu bilden, die so lang ist, dass man sie erkennen
kann. Jeder Strang trägt tausende von Genen, so dass man Material betrachtet, das Millionen von Genen enthält.
Achtung: daran denken, dass wir eine Ansammlung von DNA aus tausenden von Zellen sehen.
Sy/Zö Seite 7 21.02.2013

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Kernfragen:
1. Erkläre in einfachen Worten, den Unterschied zwischen Chromosomen, Genen und DNA.
2. Enthält eine Leberzelle die gleichen Chromosomen wie eine Wangenzelle? Erläutere die Antwort.
3. Wenn man eine Kopie eines Gens (mRNA), das ein Protein kodiert, das im Magen vorkommt, isolieren will,
könnte diese Kopie in Wangenzellen vorkommen? Erläutere die Antwort.
4. Beschriften Sie die Kompartimente der Zelle, inklusive Zellmembran, Cytoplasma und Nukleus.
5. In welchem Zellkompartiment erwartest du die genomische DNA?
6. Warum braucht man eine Zwischenstufe, wie die mRNA, um die Information der genomischen DNA zu
kopieren, damit sie in Proteine übersetzt werden kann?
7. Welches ist der erste Schritt zur Isolierung von DNA aus Zellen?
8. Sobald die Membranen aufgelöst sind, wird die DNA in die Lösung freigesetzt, aber auch andere Arten von
zellulären Molekülen. Zähle einige Arten von Molekülen neben der DNA auf, die in einer Zelle zu erwarten
sind.
9. Welche Methode, oder welches Reagenz könnte verwendet werden, um diese unerwünschten Moleküle zu
entfernen?
10. Welche Proteine kommen zusammen mit DNA in der Zelle vor?
11. Die Protease in diesem Versuch arbeitet am besten bei 50°C. Ist es möglich, dass diese Protease aus dem E.
coli Bakterium isoliert wurde? Erläutere die Antwort. Hinweis: Wo lebt E. coli?
12. Weichmacher im Fleisch werden oft eingesetzt, um zähe Fleischstücke, wie Steak weich zu machen. Steak
besteht aus Protein reichem Muskelgewebe der Kühe. Erklären, wie Weichmacher im Fleisch funktionieren?
13. Setze die Ergebnisse links mit den Arbeitsschritten rechts zusammen.
__ Erniedrigen der DNA Löslichkeit in Wasser
A. Mit einer Bürste an der Innenseite der Wange schaben
__ Auflösen der Zellmembranen B. Zugabe von Protease, Inkubation bei 50°C
__ Präzipitieren der DNA
C. Mischen mit einer Detergens Lösung
__ Zerstören von Proteinen
D. Kalter Alkohol wird über den Zellextrakt geschichtet
__ Ernte der Zellen
E. Zugabe von Salz
14. Warum wird bei der Gewinnung der pflanzlichen DNA die ursprüngliche Lösung auf 60°C erhitzt?
15. Was bewirkt die Zugabe von Detergentien (Spülmittel)?
16. Welche Bedeutung hat die Zugabe von Kochsalz bei der Gewinnung der pflanzlichen DNA?
17. Welche Funktion hat die Zugabe von Feinwaschmittel nach dem Filtrieren?
Sy/Zö Seite 8 21.02.2013

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Ziele:
I. Isolation pflanzlicher und tierischer DNA erleben.
II. Einblick in molekularbiologische Arbeitsweise erhalten.
III. Das Prinzip von Löslichkeit und Ausfällung erleben.
Material:
1. Isolation menschlicher DNA
• Wasserbad, eingestellt auf 50°C
• Dispenser mit Leitungswasser
• Eiskalte Flasche mit 95% Ethanol im Eisblock -20°C
• Fläschchen mit Lyse Puffer
• 15ml Kunststoff-Reagenzröhrchen mit weissem Deckel
• 10ml Spritze mit Nadel
• Blaues Mikro Testgefäss, beschriftet „Prot+Salt“
• Mikropipetten
• Glasgefäss zu Aufbewahren der DNA oder Anhänger
• Mikrogefässständer
• Reagenzglasständer
• Permanent Marker
• Wegwerfpapier Tasse oder Becher für gebrauchte Spitzen
2. Isolation pflanzlicher DNA
• 50ml Leitungswasser
• 5ml Spülmittel
• 1 Pulverspatel
• Kochsalz
• 1 kleine, oder eine halbe grosse Tomate
• Rüstmesser
• Schneidunterlage
• Becherglas
• Wasserbad 60°C
• Mörser + Pistill
• Trichter
• Kaffeefilter
• Reagenzglas
• Parafilm
• Feinwaschmittel Suspension 10%
• Ethanol (95%, -20°C)
• Eis
• Pasteurpipette geschlossen mit Haken
• Pasteurpipette
• 1,5ml Eppendorfer-Röhrchen
• Mikropipetten
• Eppendorfer-Zentrifuge
Sy/Zö Seite 9 21.02.2013

Praktikum KSWil
Arbeit:
1. Isolation menschlicher DNA
a) Das 15ml Reagenzröhrchen mit den Initialen beschriften und beim Dispenser 3ml Wasser einfüllen.
b) Das Wasser aus dem Röhrchen in den Mund kippen und mindestens 1 Minute lang den Mund gut
durchspülen um Schleimhautzellen zu sammeln. Mit den Zähnen die Wangeninnenwände ein bisschen
kauen, um möglichst viele Zellen abzuschaben. Nicht Schlucken.
c) Den Mundinhalt zurück ins Reagenzröhrchen geben und mit der Mikropipette 2ml Lyse-Puffer
dazugeben. Das Röhrchen mit dem weissen Deckel verschliessen und vorsichtig 5-mal kippen.
Veränderungen in der Probe notieren.
d) Hier wird die Arbeit geteilt: Ein Teammitglied fährt weiter mit der Arbeit der folgenden Schritte, das
andere Teammitglied macht die Aufgabe 2).
e) Das „Prot+Salt“ Gefäss nehmen und mit der Mikropipette 250 µl Protease mit Salz in die Gefässe mit
den Zellen geben. Die Zellextrakt-Gefässe gut verschliessen und 5-mal kippen, um den Inhalt zu
mischen.
f) Anschliessend werden die Proben für 10 Minuten in ein 50°C Wasserbad (am gemeinsamen Arbeitsplatz)
stellen. Jetzt kann die Protease wirken.
g) Die Gefässe aus dem Wasserbad entnehmen und in den Reagenzglasständer stellen.
h) Eine 10ml Spritze mit eiskaltem Ethanol 95% füllen.
i) Das Röhrchen im 45° Winkel kippen und langsam den Alkohol zu geben, den Alkohol langsam an der
Gefässwand entlang fliessen lassen. Man sollte sehen können, wie sich zwei Phasen bilden (obere und
untere). Während man den Alkohol zugibt genau die Stelle, an der sich die Alkohol- und die Zellextrakt-
Phase berühren beobachten. Beschreibe die Beobachtungen.
j) Jetzt die Gefässe aufrecht in den Reagensglasständer zurückstellen und 5 Minuten ganz in Ruhe bei
Raumtemperatur stehen lassen.
k) Betrachte nach diesen 5 Minuten nochmals den Inhalt des Gefässes, insbesondere den Bereich, wo sich
die Alkohol- und Zellextrakt-Phase treffen. Was ist zu erkennen? Beschreibe die Beobachtungen.
l) Das fasrige weisse oder durchsichtige Material ist die DNA! Wenn nur spärlich weisse Schlieren zu
erkennen sind, das Gefäss vorsichtig 2-3mal kippen, die DNA wird zusätzlich ausflocken.
m) Um einen DNA Anhänger herzustellen vorsichtig die ausgefallene DNA zusammen mit ca. 750 µl bis 1 ml
Alkohol-Lösung in das spezielle Glasgefäss überführen. Das Gefäss so versiegeln, dass es zu einem
Anhänger vervollständigt werden kann.
Sy/Zö Seite 10 21.02.2013

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2. Isolation pflanzlicher DNA
a) In einem Becherglas werden 50 ml Wasser, 5 ml Spülmittel und ein gestrichen voller Spatel Kochsalz gemischt.
Die geschnittene Tomate wird zu dieser Lösung gegeben und mit dem Spatel gut verrührt.
b) Das Becherglas wird für 15 Min in ein 60°C warmes Wasserbad gestellt.
c) Anschliessend wird das Gemisch für 5 Min in kaltem Wasser gekühlt.
Mit dem Teesieb wird die Masse abgesiebt und die Flüssigkeit verworfen.
d) Die Tomatenstücke werden in einem Mörser zerquetscht, bis ein körniges Mus entsteht. Die Reibung soll
nicht extrem stark sein, weil sonst zuviel DNA zerreisst.
e) Die Suspension wir über einen Trichter mit Filterpapier abfiltriert.
f) 2ml des Filtrates werden in ein Reagenzglas transferiert und mit 1 ml Feinwaschmittel-Suspension
versetzt und gut gemischt.
g) 7ml kalter Alkohol 95%, -20°C dazuspritzen.
h) Das Probenröhrchen 5 Min auf Eis stehen lassen.
i) Die DNA fällt schlierenartig in der Alkohol-Lösung aus.
j) Die DNA wird sorgfältig mit zweimal einem Volumen von 500µl aus dem Reagenzglas gefischt und in ein
1,5 ml Eppendorfer-Röhrchen übertragen. Damit isoliert man die längeren DNA-Ketten.
k) Durch schütteln der restlichen Suspension bilden sich Klumpen von DNA, die sorgfältig mit weiteren
500µl in dasselbe Eppendorfer-Röhrchen pipettiert werden.
l) Die Proben werden bei 6000rpm 3 Minuten zentrifugiert.
m) Den Überstand sorgfältig abpipettieren und verwerfen.
n) Das DNA-Pellet wird nun zweimal mit Ethanol -20°C gewaschen. Das heisst: 0,5 ml kaltes Ethanol
zugeben, aufschlämmen durch Auf- und Abpipettieren, zentrifugieren und Überstand verwerfen - diesen
Vorgang wiederholen!
o) Dem gewaschenen DNA-Pellet 200μl H 2 O zugeben, resuspendieren und zentrifugieren. Der Überstand
wird zur Messung der Extinktion gebraucht.
p) Die DNA kann so mehrere Tage bei 4°C und praktisch unbefristet bei -20°C aufbewahrt werden.
DNA Nachweis im UV-Spektrometer
DNA absorbiert UV-Licht bei 260 nm Wellenlänge optimal. Die Menge der UV-Strahlung, die von einer DNA-
Lösung absorbiert wird, ist ihrem DNA-Gehalt proportional. Der Extinktionswert 1,0 entspricht bei 260 nm einer
Konzentration von 50 µg doppelsträngiger DNA pro ml der gemessenen Lösung.
Die Reinheit der DNA-Lösung kann bestimmt werden durch den Quotienten der Extinktionen bei 260 nm und
280 nm (A260/A280). Beim Wert 1.8 handelt es sich um eine reine Probe. Kleinere Werte weisen auf eine
Verunreinigung durch Proteine oder RNA hin.
Sy/Zö Seite 11 21.02.2013