Mikrobiologie Kursablauf - Kantonsschule Wil
Mikrobiologie Kursablauf - Kantonsschule Wil
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<strong>Kantonsschule</strong> <strong>Wil</strong><br />
Lipasepraktikum<br />
Biologiepraktikum: 3. Semester<br />
Labor<br />
Name Schule Klasse Datum<br />
1. Theorie<br />
Lipasen sind Enzyme, die von Lipiden wie Glyceriden oder Cholesterinestern freie Fettsäuren abspalten<br />
(Lipolyse). Diese Enzyme spielen physiologisch eine wichtige Rolle, indem sie die Fettverdauung<br />
bewerkstelligen und die im Körper gespeicherten Fettreserven so verfügbar machen. Ausserdem<br />
gibt es eine Unzahl technologischer Anwendungen für diese Proteine.<br />
Im engeren Sinn bezeichnet Lipase in der medizinischen Diagnostik die pankreasspezifische Lipase<br />
(Pankreaslipase).<br />
Am Abbau der Fette sind sowohl Lipasen, als auch Esterasen beteiligt. Lipasen unterscheiden sich<br />
von Esterasen durch Unterschiede im Substratspektrum. Lipasen bevorzugen wasserunlösliche Substrate,<br />
sie sind aber auch in der Lage Triglyceride aus kurzkettigen Fettsäuren umzusetzen. Im Gegensatz<br />
dazu hydrolysieren Esterasen nur kurzkettige, wasserlösliche Substrate. Ausserdem unterscheiden<br />
sich die Esterasen von den Lipasen durch ihre Raumstrukturen. Lipasen haben einen Deckel<br />
(engl. lid) über dem aktiven Zentrum, welcher bei Esterasen fehlt. Esterasen und Lipasen kommen<br />
ausserdem in allen Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen als zelluläre oder extrazelluläre Proteine<br />
vor. Lipasen gehören zur Familie der Serin-Hydrolasen und haben für ihre spezifischen Reaktionen,<br />
ein Reaktionsgleichgewicht, das vom Wassergehalt des Gesamtsystems abhängig ist.<br />
Abb. 1: Dreidimensionale Struktur von Lipase<br />
Lipasen besitzen oft keine klaren<br />
Übereinstimmungen in der Aminosäurensequenz.<br />
Bei Betrachtung der räumlichen<br />
Struktur hingegen wird schnell<br />
klar, dass Lipasen gemeinsame 3D-<br />
Strukturen aufweisen. Demnach bilden<br />
die Lipasen eine Familie von α/β-<br />
Hydrolase-Faltungen, die bei allen Lipasen<br />
vorhanden ist. Sie besteht darin,<br />
dass im Zentrum der Lipasen acht nahezu<br />
parallel angeordnete β-Faltblätter<br />
platziert sind, die wiederum von α-<br />
Helices eingeschlossen sind, mit Ausnahme<br />
des zweiten β-Faltblattes, welches<br />
zudem invers in die Struktur eingeordnet<br />
ist.<br />
Mit wenigen Ausnahmen liegen die Aminosäuren, die für die katalytische Wirkung der Lipasen verantwortlich<br />
sind, an denselben Positionen. Diese Aminosäuren bilden eine katalytische Triade, die<br />
normalerweise aus Ser, His und Asp Aminosäuren gebildet wird.<br />
Beispiele von verschiedenen Lipasen:<br />
• Die Lipoproteinlipase (LPL) befindet sich auf der extrazellulären Membranseite von Endothelzellen<br />
in verschiedenen Gewebe (unter anderem Fettgewebe); sie kann die im Blut an<br />
Lipoproteine gebundenen Fette spalten und damit für die zelluläre Aufnahme vorbereiten.<br />
Die hepatische Triglycerid-Lipase ist beispielsweise in der Leber lokalisiert.<br />
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<strong>Kantonsschule</strong> <strong>Wil</strong><br />
Biologiepraktikum: 3. Semester<br />
• Die Pankreaslipase (synonym: Steapsin) wird in den exokrinen Drüsenzellen der Bauchspeicheldrüse<br />
synthetisiert und gelangt über den Ductus pancreaticus in das Duodenum. Dort<br />
spaltet sie die Nahrungsfette in Fettsäuren, Glycerin und Mono- beziehungsweise Diacylglycerine.<br />
Diese können dann in Form von Mizellen zusammen mit Hilfe von Gallensalzen in die<br />
Enterozyten aufgenommen werden. Nur ein kleiner Teil der Pankreas-Lipase geht ins Blut.<br />
Sie hat dort eine biologische Halbwertszeit von 7-14 Stunden.<br />
• Eine weitere wichtige Lipasenart ist die Hormonsensitive Lipase. Sie spaltet die in Adipozyten<br />
(Fettzellen) gespeicherten Triglyceride und wirkt somit lipolytisch.<br />
Anwendungen in der Industrie und Technik<br />
Lipasen werden in der Fettchemie zur Herstellung von Seifen, von Fetten mit verbesserter Streichfähigkeit<br />
und zur Herstellung von Kakaobutteräquivalenten verwendet.<br />
Vielen Waschmitteln wird Lipase zu Erhöhung der Reinigungsleistung beigemischt.<br />
Im Rohmilchkäse wirken Lipasen aromabildend. Butter wird schneller ranzig durch Lipasen. Beim<br />
Pasteurisieren werden die Lipasen der Milch grösstenteils zerstört.<br />
Lipasen werden auch als Biokatalysatoren in der organischen Synthese (z.B. zur Herstellung von Zuckerestern<br />
im Industriemassstab) und in der Lebensmittelindustrie zur Geschmacksstoff-herstellung<br />
verwendet.<br />
Lipasen können aus einer Vielzahl unterschiedlicher Quellen isoliert werden, wobei für industrielle<br />
Zwecke zumeist Schweinepankreaslipase (PPL) oder Lipasen von bestimmten Mikroorganismen<br />
genutzt werden. Schweinepankreaslipase ist die am genauesten beschriebene pankreatische Lipase<br />
und besteht aus 449 Aminosäuren mit 7 Disulfidbrücken.<br />
Die Erkenntnisse über Enzymaktivitäten aus dem Praktikum des 3. Semesters werden für diese Arbeit<br />
mit Lipase vorausgesetzt (siehe „Vom Lehrer; Biologie; Praktikum; 3. Semester; Enzympraktikum“).<br />
2. Ziele<br />
I. Kennenlernen des Enzyms Lipase<br />
II.<br />
III.<br />
Testen der Enzymaktivität und der Temperaturabhängigkeit<br />
Korrekte Auswertung von Datenreihen<br />
3. Material<br />
3.1. Konzentrationsabhängige Enzymaktivität von Lipase<br />
Tab.1: Verwendetes Material zur Bestimmung der Enzymaktivität in Abhängigkeit der Konzentration<br />
Labormaterial Reagenzien Geräte/Apparaturen<br />
6 Reagenzgläser 15ml<br />
Reagenzglasständer<br />
Filzschreiber<br />
Stoppuhr<br />
Reagenzglasorgel zum Vergleich der<br />
Entfärbung<br />
Lipasesuspensionen:<br />
2%, 4%, 6%, 8%, 10%<br />
8%iges Natriumcarbonat<br />
Milch<br />
Phenolphthalein<br />
Mikropipetten: 1 ml und 5ml und dazu<br />
passende Spitzen<br />
Fotokamera (selber mitbringen)<br />
Kn/Sy/Zö/Ws Seite 2 07.03.2013
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3.2. Temperaturabhängige Enzymaktivität von Lipase<br />
Tab.2: Verwendetes Material zur Bestimmung der Enzymaktivität in Abhängigkeit der Temperatur<br />
Labormaterial Reagenzien Geräte/Apparaturen<br />
6 Reagenzgläser 15ml<br />
Reagenzglasständer<br />
Filzschreiber<br />
Stoppuhr<br />
Lipasesuspension 5%<br />
8%iges Natriumcarbonat<br />
Milch<br />
Phenolphthalein<br />
Biologiepraktikum: 3. Semester<br />
Mikropipetten:<br />
1 ml und 5ml<br />
dazu passende Spitzen<br />
Wasserbäder:<br />
0°C, 10°C, 20°C, 30°C, 40°C, 50°C<br />
4. Versuchsdurchführung<br />
4.1. Konzentrationsabhängige Enzymaktivität von Lipase<br />
3ml der vorgegebenen Lipaselösungen werden mit je 600µl 8%iger Natriumcarbonatlösung versetzt<br />
und mit 2 Tropfen Phenolphthalein gefärbt. Nach Zugabe von 2ml Milch wird die Entfärbezeit gemessen.<br />
Alle 3 Minuten den Verlauf fotografisch protokollieren. Lies den Umschlagspunkt an der<br />
Vergleichsorgel am Lehrerpult ab. Sammle für die Auswertung die Daten aller Praktikumsgruppen.<br />
4.2. Temperaturabhängige Enzymaktivität von Lipase<br />
Für jedes Temperaturbad werden 3ml 5%ige Lipaselösung mit 600µl 8%iger Natriumcarbonatlösung<br />
versetzt und mit 2 Tropfen Phenolphthalein gefärbt. Anschliessend werden die Proben mind. 5 Minuten<br />
temperiert. Nach Zugabe von 2ml entsprechend vorgewärmter Milch werden die Entfärbezeiten<br />
bei den entsprechenden Temperaturen gemessen. Sammle auch hier für die Auswertung die<br />
Daten aller Praktikumsgruppen.<br />
5. Resultate<br />
6. Auswertung<br />
Beachtet bei der Auswertung die unterschiedlichen Ergebnisse der einzelnen Gruppen. Versucht mit<br />
den Differenzen umzugehen (auch mathematisch). Statistische Aussagen sind erwünscht.<br />
7. Interpretation<br />
8. Zusammenfassung<br />
9. Quellen<br />
http://www1.tu-darmstadt.de/fb/ch/Fachgebiete/OC/AKSchmidt/Avimec/AB/Versuchsskript.pdf (20.2.2012)<br />
http://de.wikipedia.org/wiki/Lipasen (20.2.2012)<br />
Kn/Sy/Zö/Ws Seite 3 07.03.2013
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