Trinkwasserverordnung 2001
Trinkwasserverordnung 2001
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<strong>Trinkwasserverordnung</strong> <strong>2001</strong><br />
Die neuen mikrobiologischen<br />
Verfahren der TrinkwV –<br />
Erfahrungen – Interpretation der<br />
Ergebnisse<br />
Ernst-August Heinemeyer<br />
Niedersächsisches Landesgesundheitsamt<br />
Außenstelle Aurich
Neue Normen<br />
quantitative Trinkwassermikrobiologie<br />
• E. coli ISO 9308-1<br />
• coliforme Bakterien ISO 9308-1<br />
• Enterokokken ISO 7899-2<br />
• Clostridium perfringens<br />
TrinkwV<strong>2001</strong><br />
• Koloniezahlen EN ISO 6222<br />
• Koloniezahlen<br />
Anl. 1 Nr. 5 AF<br />
• Pseudomonas aeruginosa EN ISO 12780
Untersuchungsdauer<br />
TrinkwV-1990 / TrinkwV<strong>2001</strong><br />
Parameter<br />
Untersuchungsdauer in Tagen<br />
TrinkwV1990<br />
TrinkwV<strong>2001</strong><br />
neg.<br />
positive Probe<br />
neg.<br />
positive Probe<br />
E. coli 2 4 - 5 1 2 - 3<br />
coliforme Bakterien 2 4 - 5 1 2 – 3<br />
- altern. Verfahren Colilert 1 1<br />
Koloniezahlen 20°C/22°C 2 2 3 3<br />
Koloniezahlen 36 °C 2 2 2 2<br />
Enterokokken 2 3 2 2<br />
Clostridium perfringens 2 4 1 1 *)<br />
Pseudomonas aeruginosa 2 4 1 2-33 (ggf.länger)<br />
*) bei Verwendung des mCP Agars; ; die Verwendung des TSC Agars erfordert weitere<br />
Subkulturen, die die Untersuchung auf etwa 2-32<br />
3 verlängern.
Koloniezahlen<br />
Koloniezahlen EN ISO 6222<br />
Koloniezahlen<br />
Anl. 1 Nr. 5 AF
Vergleich der Koloniezahlbestimmungsmethoden:<br />
alte und neue <strong>Trinkwasserverordnung</strong><br />
Methode Test 1 (n=50) Test 2 (n=100)<br />
m ± s [KBE/ml] m ± s [KBE/ml]<br />
TrinkwV 20°C, 2 d +Lupe 14,3 ± 6,6 5,0 ± 2,5<br />
EN-ISO 22°C, 3 d - Lupe 101,9 ± 61,9 9,3 ± 4,4<br />
TrinkwV 36°C, 2 d + Lupe 8,2 ± 3,9 1,8 ± 1,7<br />
EN-ISO 36°C, 2 d - Lupe 17,9 ± 14,8 2,4 ± 2,1<br />
(Mittelwerte und Standardabweichung von 10 Laboratorien der<br />
AWWR, n. Tuschewitzky)
Koloniezahlen EN ISO 6222 und TrinkwV-90 im<br />
Vergleich (Ringversuch 1/2003)<br />
20 °C-AF 22 °C-NF 36 °C-AF 36 °C-NF<br />
Anzahl 157 68 155 67<br />
Mittelwert 20,7 21,1 21,0 20,6<br />
Median 21 21 21 20
KBE bei 20 °C und 36 °C<br />
(XY-Diagramm; RV 3/2002)<br />
80<br />
70<br />
KBE / ml bei 20 °C<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
20 30 40 50 60 70 80<br />
KBE / ml bei 36 °C
KBE – Fehlerquellen<br />
• das Ablesen der KBE erfolgt ohne (korrekte) Lupe<br />
• die Gießtemperatur des Agars ist zu hoch<br />
• die Gießtemperatur des Agars ist zu gering<br />
(Klumpenbildung)<br />
• Die Nährbodenqualität ist ungleichmäßig<br />
• falsche Zusammensetzung des Nährbodens<br />
(Eigenrezepturen)<br />
• keine Verwendung kalibrierter Pipetten<br />
• ungenügendes Schütteln der Probenflasche vor dem<br />
Pipettieren<br />
• falsche Bebrütungstemperaturen<br />
• Stapelhöhe der Agarplatten
E. coli ISO 9308-1<br />
coliforme Bakterien ISO 9308-1
Nachweis von E. coli / coliformen Bakterien<br />
ISO 9308-1<br />
(Lactose<br />
TTC Agar)<br />
Bromthymolblau<br />
coliforme Bakterien (Laktose-Vergärung)<br />
Bromthymolblau<br />
(blau bei pH 7,6) (gelb bei pH 6,0)<br />
Säurebildung<br />
Hemmung der gram positiven Begleitflora durch:<br />
Tergitol-7 7 (Natriumheptadecylsulfat(<br />
Natriumheptadecylsulfat) ) u.<br />
TTC (Triphenyltetrazoliumchlorid(<br />
Triphenyltetrazoliumchlorid)
TTC Ringversuchsprobe I/2003
Laktose-positive Kolonien auf TTC Agar<br />
E. coli / coliforme Bakt. (TTC Agar, RV 2/02)<br />
Mittelwert und Standardabweichungen sind zufallsverteilt aus 20 Teilnehmerergebnissen berechnet Gruppe A<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
5<br />
6<br />
11<br />
12<br />
14<br />
16<br />
17<br />
20<br />
21<br />
25<br />
26<br />
27<br />
28<br />
31<br />
36<br />
38<br />
39<br />
42<br />
44<br />
46<br />
53<br />
55<br />
56<br />
58<br />
60<br />
101<br />
102<br />
110<br />
113<br />
117<br />
119<br />
126<br />
127<br />
128<br />
131<br />
140<br />
141<br />
150<br />
154<br />
155<br />
156<br />
161<br />
162<br />
165<br />
170<br />
171<br />
175<br />
176<br />
178<br />
180<br />
182<br />
198<br />
200<br />
206<br />
208<br />
212<br />
218<br />
218<br />
219<br />
221<br />
228<br />
229<br />
232<br />
233<br />
236<br />
237<br />
243<br />
NLGA AS Aurich<br />
Z RV 2/2002<br />
Labor ID Nr<br />
X-3S X-2S X-quer X+2S X+3S [n] Laktose+ Kolonien<br />
Abb. 3<br />
n E. coli + colif. Bakt. / 100 ml
TTC „negative Kultur“
E. coli / coliforme Bakterien<br />
• EN ISO 9308-1<br />
• 8.3 Inkubation und Differenzierung<br />
• Anmerkung 1:<br />
Eine Verlängerung der Inkubationszeit auf (44 ±<br />
4) h kann eine erhöhte Sensitivität des Testes<br />
zur Folge haben und kann besonders für solche<br />
Platten nützlich sein, die nach (21 ± 3) h keine<br />
typischen Kolonien aufweisen.
TTC Oberseite
TTC Unterseite
Trinkwasserprobenbearbeitung im Vergleich vor- und<br />
nach der Umstellung der Bebrütungsdauer<br />
(im Januar wurden 44 h, im März nur noch 21 h bei 36 °C bebrütet)<br />
t)<br />
Testmonat<br />
Untersuchungen<br />
Trinkwasserproben<br />
verdächtig<br />
nach 24 / 44 h<br />
davon positiv<br />
Januar 2003 144 32 6 *)<br />
März 2003 150 6 1<br />
*) davon 4 Proben aus einer Untersuchungsserie
Testprinzip Colilert<br />
Nachweis je eines<br />
spezifischen Enzyms<br />
Coliforme Keime:<br />
β-Galactosidase<br />
Laktose + H 2 O → Glukose + Galaktose<br />
E. coli:<br />
zusätzlich β-Glucuronidase<br />
Dauer: bei positivem Ergebnis 19 ± 1 h (grenzwertig bis 22 h)
TTC-Agar - Colilert (lactose + Kolonien/MPN-Zahlen)<br />
Mittelwert und Standardabweichungen sind zufallsverteilt aus 20 Teilnehmerergebnissen berechnet<br />
[n] lactose-positive Kolonien<br />
0 10 20 30 40 50 60 70<br />
ab hier Colilert<br />
LGA AS Aurich<br />
V 1 / 2003<br />
Labor ID Nr<br />
X-3S X-2S X-quer X+2S X+3S lac-positive Kolonien<br />
colilert
Klebsiella pneumoniae<br />
Serratia marcescens
Was sind eigentlich Coliforme Bakterien ?<br />
Laktose +<br />
Gasbildung<br />
Laktose + / -<br />
Gasbildung<br />
ß-Galaktosidase<br />
Coliforme Bakterien nach Trinkw-1990<br />
Coliforme Bakterien nach Trinkw-<strong>2001</strong>- ISO 9308-1<br />
Coliforme Bakterien nach Trinkw-<strong>2001</strong>- alternatives Verfahren (Colilert)
Laktoseabbau und ß-Galaktosidase<br />
Farmer (Manual Clin. Microb. 1995)<br />
von 121 Enterobakterien - Species<br />
• bauen 38 Spezies zu ≥ 50 % Laktose zu<br />
Säure (± Gas) ab<br />
• besitzen 80 Spezies zu ≥ 50 % eine ß-<br />
Galactosidase
Enterokokken<br />
ISO 7899-2
Nachweis von Enterokokken (ISO 7899-2)<br />
A Filtration + Inkubation auf Membranfilteragar nach Slanetz & Bartley<br />
2,3,5 Triphenyl-<br />
tetrazoliumchlorid<br />
(farblos)<br />
Selektiv wirkt Na-Azid<br />
Enterokokken<br />
Formazan<br />
(rot)<br />
B<br />
Bebrütung des Filters auf Galle-Äsculin<br />
Äsculin-Azid<br />
Agar (Bestätigungstest(<br />
Bestätigungstest)<br />
Enterokokken bei 44 °C<br />
1) Äsculin 6,7 Dihydroxy-Cumarin<br />
+ Glucose<br />
2) 6,7 Dihydroxy-Cumarin<br />
+ Fe +++ braun-schwarze<br />
Verbindung
Enterokokken auf Galle-Azid<br />
Azid-Eskulin-Agar
Enterokokken Filtration und<br />
Plattengussverfahren im Vergleich<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
458<br />
003<br />
026<br />
431<br />
182<br />
477<br />
180<br />
371<br />
392<br />
387<br />
420<br />
401<br />
437<br />
350<br />
479<br />
460<br />
473<br />
004<br />
237<br />
450<br />
439<br />
377<br />
141<br />
013<br />
236<br />
475<br />
233<br />
281<br />
419<br />
427<br />
218<br />
358<br />
385<br />
005<br />
156<br />
042<br />
332<br />
250<br />
421<br />
219<br />
056<br />
208<br />
354<br />
162<br />
206<br />
328<br />
435<br />
467<br />
459<br />
412<br />
060<br />
440<br />
297<br />
415<br />
340<br />
389<br />
391<br />
263<br />
355<br />
405<br />
384<br />
312<br />
027<br />
155<br />
244<br />
229<br />
102<br />
038<br />
293<br />
344<br />
256<br />
329<br />
021<br />
380<br />
025<br />
309<br />
150<br />
331<br />
006<br />
165<br />
168<br />
321<br />
232<br />
395<br />
311<br />
058<br />
283<br />
485<br />
360<br />
178<br />
373<br />
113<br />
016<br />
161<br />
046<br />
212<br />
243<br />
367<br />
438<br />
127<br />
221<br />
002<br />
110<br />
170<br />
171<br />
198<br />
012<br />
284<br />
205<br />
318<br />
154<br />
055<br />
457<br />
265<br />
119<br />
036<br />
176<br />
126<br />
017<br />
011<br />
039<br />
001<br />
131<br />
175<br />
305<br />
044<br />
128<br />
363<br />
200<br />
028<br />
117<br />
140<br />
247<br />
472<br />
031<br />
014<br />
020<br />
101<br />
277<br />
228<br />
279<br />
285<br />
[n] Enterokokken / Vol-Einheit<br />
NLGA AS Aurich<br />
Z RV 2 / 2002<br />
KBE 1 ml Original EK 50 ml Filtrat entspr. 1 ml Original<br />
Abb. 5
Enterokokken RV 2/2002<br />
Methode<br />
berücksichtigte<br />
Ergebnisse<br />
Mittelwert<br />
KBE / 1ml 140 17,8<br />
ISO 7899-2 138 14,6<br />
Sollbereich 2,9 – 55,3 Enterokokken / 100 ml<br />
Wiederfindungsrate nach ISO 7899-2 2 gegenüber dem Koloniezahl-Agar<br />
beträgt damit:<br />
WFR = 14,6 * 100 % / 17,8<br />
WFR = 82 %
Clostridium perfringens<br />
• in Koloniezahlagar<br />
• nach Filtration auf<br />
mCP-Agar<br />
(TrinkwV-<strong>2001</strong>)<br />
• nach Filtration auf<br />
TSC-Agar<br />
(ISO 6461-2)<br />
(Dank an Fa. Sifin/Heipha<br />
& Oxoid)
250<br />
200<br />
150<br />
100<br />
50<br />
0<br />
Clostridum perfringens<br />
in Koloniezahl-Agar<br />
039<br />
293<br />
458<br />
027<br />
141<br />
256<br />
003<br />
284<br />
421<br />
431<br />
212<br />
212<br />
420<br />
312<br />
154<br />
219<br />
026<br />
208<br />
127<br />
228<br />
344<br />
265<br />
412<br />
126<br />
016<br />
206<br />
013<br />
473<br />
038<br />
200<br />
479<br />
058<br />
263<br />
004<br />
384<br />
387<br />
401<br />
156<br />
011<br />
155<br />
385<br />
036<br />
101<br />
477<br />
060<br />
198<br />
485<br />
331<br />
180<br />
354<br />
178<br />
244<br />
438<br />
110<br />
415<br />
309<br />
281<br />
419<br />
014<br />
389<br />
340<br />
229<br />
305<br />
243<br />
243<br />
391<br />
373<br />
168<br />
247<br />
457<br />
021<br />
140<br />
439<br />
017<br />
056<br />
367<br />
031<br />
283<br />
028<br />
221<br />
392<br />
025<br />
395<br />
150<br />
175<br />
332<br />
377<br />
044<br />
162<br />
427<br />
459<br />
102<br />
371<br />
236<br />
263<br />
363<br />
358<br />
450<br />
042<br />
055<br />
472<br />
128<br />
237<br />
318<br />
171<br />
233<br />
277<br />
006<br />
328<br />
467<br />
165<br />
131<br />
232<br />
355<br />
329<br />
360<br />
176<br />
001<br />
311<br />
380<br />
119<br />
002<br />
161<br />
020<br />
101<br />
005<br />
218<br />
117<br />
126<br />
046<br />
350<br />
279<br />
NLGA AS Aurich<br />
ZS-RV 2/2002<br />
Labor ID<br />
[n] Cl. Perfringens / 1 ml RV Probe (anaerobe Bebrütung)<br />
Abb. 7<br />
[n] Cl. perfringens / 1 ml Original RV-Probe - Plattenguss
Nachweis von Cl. perfringens<br />
mCP (membrane-Clostridium perfringens) Agar<br />
Saccharose<br />
Cl. perfringens<br />
Bromkresolpurpur (purpur pH 6,8)<br />
Säure<br />
gelbe Kolonien<br />
Bromkresolpurpur (gelb pH 5,2)<br />
Phenolphthalein-diphosphat<br />
(farblos)<br />
gelbe Kolonien<br />
Cl. perfringens-Phosphatase<br />
Alkalisiserung durch NH 3<br />
Phenolphthalein<br />
(rot)<br />
rote Kolonien<br />
Hemmung der Begleitflora durch:<br />
D-Cycloserin, Polymyxin-B; 44 °C Bebrütungstemperatur
Cl. perfringens auf mCP Agar Fertigplatten (Oxoid)<br />
3 verschiedene Membran-Filtertypen<br />
200<br />
150<br />
100<br />
50<br />
0<br />
006<br />
025<br />
141<br />
154<br />
016<br />
156<br />
101<br />
004<br />
140<br />
102<br />
128<br />
011<br />
038<br />
042<br />
126<br />
117<br />
017<br />
001<br />
110<br />
005<br />
060<br />
155<br />
058<br />
003<br />
044<br />
014<br />
026<br />
131<br />
119<br />
119<br />
031<br />
036<br />
127<br />
021<br />
150<br />
055<br />
028<br />
162<br />
002<br />
056<br />
161<br />
039<br />
027<br />
046<br />
178<br />
219<br />
228<br />
244<br />
256<br />
281<br />
297<br />
309<br />
221<br />
318<br />
331<br />
175<br />
232<br />
212<br />
250<br />
279<br />
175<br />
208<br />
237<br />
165<br />
265<br />
329<br />
312<br />
311<br />
200<br />
180<br />
218<br />
305<br />
171<br />
243<br />
176<br />
229<br />
168<br />
198<br />
236<br />
277<br />
293<br />
328<br />
284<br />
331<br />
283<br />
233<br />
206<br />
263<br />
340<br />
350<br />
389<br />
392<br />
401<br />
438<br />
450<br />
373<br />
380<br />
384<br />
363<br />
344<br />
421<br />
387<br />
419<br />
415<br />
427<br />
377<br />
479<br />
355<br />
439<br />
458<br />
457<br />
395<br />
354<br />
391<br />
412<br />
371<br />
435<br />
467<br />
477<br />
385<br />
472<br />
360<br />
473<br />
367<br />
485<br />
459<br />
[n] Cl. perfringens / 100 ml Filtrat<br />
Schleicher & Schüll<br />
Cellulose-ME 0,2 µm<br />
PALL-Gelman-Sci<br />
Cellulose-ME 0,45 µm<br />
Schleicher & Schüll<br />
Cellulose-ME 0,45 µm<br />
NLGA AS Aurich<br />
Lab.- Id Nr.<br />
Z RV 2/ 2002 Abb. 19<br />
vor Ammoniumhydroxid-Bedampfung nach Ammoniumhydroxid-Bedampfung
Nachweis von Cl. perfringens<br />
TSC (Tryptose(<br />
Tryptose-Sulfit)<br />
Agar<br />
C. perfringens<br />
Fe 2+ + H 2 S<br />
Sulfit H 2 S schwarze Kolonien<br />
Reduktion<br />
FeS<br />
Hemmung der Begleitflora durch:<br />
D-Cycloserin, , 44 °C Bebrütungstemperatur<br />
Biochemische Differenzierung (n. ISO WD 6461-2)<br />
C. perfringens zeigt schwarze/graue/gelb-braune braune Kolonien auf TSC Agar, , ist im Nitrat-Beweglich<br />
Beweglich-<br />
keitsmedium nicht beweglich, reduziert Nitrat zu Nitrit, bildet im Lactose-Gelatine<br />
Gelatine-Medium Säure aus<br />
Laktose und verflüssigt die Gelatine anaerob bei 36 °C innerhalb 44 Stunden.
Cl. perfringens auf TSC Fertigplatten (Heipha)<br />
Schwärzung durch H2S Bildung<br />
180<br />
160<br />
140<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
055<br />
141<br />
312<br />
332<br />
389<br />
439<br />
025<br />
421<br />
309<br />
236<br />
305<br />
328<br />
350<br />
244<br />
281<br />
013<br />
311<br />
212<br />
377<br />
318<br />
419<br />
243<br />
219<br />
044<br />
011<br />
243<br />
458<br />
020<br />
371<br />
401<br />
420<br />
415<br />
457<br />
026<br />
036<br />
232<br />
028<br />
014<br />
228<br />
058<br />
155<br />
002<br />
237<br />
283<br />
479<br />
479<br />
256<br />
060<br />
168<br />
180<br />
459<br />
373<br />
360<br />
156<br />
367<br />
003<br />
229<br />
102<br />
233<br />
175<br />
412<br />
247<br />
263<br />
354<br />
031<br />
431<br />
392<br />
340<br />
005<br />
355<br />
004<br />
006<br />
297<br />
265<br />
485<br />
427<br />
467<br />
395<br />
60<br />
391<br />
021<br />
046<br />
198<br />
126<br />
165<br />
358<br />
344<br />
016<br />
384<br />
208<br />
279<br />
150<br />
477<br />
176<br />
038<br />
056<br />
039<br />
117<br />
206<br />
385<br />
218<br />
001<br />
171<br />
221<br />
363<br />
128<br />
017<br />
293<br />
101<br />
277<br />
140<br />
162<br />
127<br />
027<br />
110<br />
119<br />
[n] KBE / 100 ml Filtrat (entspr. 2 ml Original)<br />
NLGA AS Aurich<br />
Z-RV 2/2002<br />
Labor - ID. Nr.<br />
KBE / 100 ml Filtrat - alle Kolonien KBE / 100 ml Filtrat - nur braun-schwarze Kolonien<br />
Abb. 10
C. perfringens<br />
Isolierungs- und Wiederfindungsraten - Mittelwert<br />
KBE [n] bzw. Wiederfindungsrate [%]<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
größter Mittelwert und höchste Wiederfindungsrate<br />
Mittelwert und Wiederfindungsrate<br />
0<br />
LGA AS Aurich<br />
RV 2/2002<br />
KBE<br />
TSC Sifin-<br />
Heipha<br />
TSC Sonst.<br />
mCP Sifin-H<br />
GN6<br />
Methode<br />
mCP Sifin-H<br />
SS45<br />
mCP Sifin-H<br />
SS20<br />
mCP OXOID<br />
GN6<br />
mCP OXOID<br />
SS45<br />
mCP OXOID<br />
SS20<br />
Abb. 23<br />
n berück. Ergebnisse Mittelwert Mittelwert - nach Farbreaktion WFR WFR - nach Farbreaktion
Clostridium perfringens auf mCP-Agar<br />
und<br />
Membranfiltern div. Chargen mit gleicher<br />
Bestellnummer (Wiederfindungsraten)<br />
Charge<br />
Haltbarkeit<br />
WFRate<br />
mCP/Oxoid<br />
Koloniezahlagar<br />
A 08/2004 123 % 100 % 03.06.02<br />
A 08/2004 71 % 100 % 11.06.02<br />
A 08/2004 88 % 100 % 27.06.02<br />
B 05/<strong>2001</strong> 6 % 100 % 03.06.02<br />
B 05/<strong>2001</strong> 4 % 100 % 11.06.02<br />
B 05/<strong>2001</strong> 14 % 100 % 27.06.02<br />
C 12/<strong>2001</strong> 2 % 100 % 03.06.02<br />
C 12/<strong>2001</strong> 26 % 100 % 11.06.02<br />
C 12/<strong>2001</strong> 33 % 100 % 27.06.02<br />
D 03/2005 75 % 100 % 27.06.02
Legionellen Ring-Vor-Versuch (RV 2-03)<br />
Kolonien / 50 ml (Filter)<br />
200<br />
190<br />
180<br />
170<br />
160<br />
150<br />
140<br />
130<br />
120<br />
110<br />
100<br />
90<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
GVPC A<br />
CellNitr B<br />
Diese Daten wurden zur Berechnung des Sollbereichs herangezogen !<br />
GVPC M<br />
GVPC A<br />
CME C<br />
GVPC: MWY<br />
H A M S<br />
C M E der Firma M<br />
195 161 161 183 165 183 196 165 195 178 228 178 228 196 197 197 39 39 55 172 20 233 1 20 172 233 55 340 340 3 3 192 192 340 34<br />
X-3S´ X-2S´ X (geometr. Mittel) X+2S´ X+3S´ Legionella / 50ml<br />
Abb. 1 Verteilungsmuster für Legionellen<br />
NLGA RV 2-
Cellulose-Nitrat<br />
Cellulose-Mischester
am Ringversuch sind beteiligt:<br />
Dr. Hans-Helmut Geuenich<br />
Dr. Katrin Luden<br />
Dipl. Ing. Usha Hafermann<br />
Grete Höfes<br />
Heiko Buß
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