2 Material und Methoden

2.12.2 Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)
Der Einsatz der Reversen Transkriptase ermöglicht die Synthese eines zur Template-RNA
komplementären DNA-Stranges (cDNA). Für die Reaktion wurden 1µl RNA-Lösung und 1µl
20µM Primer OX-5 (siehe Tabelle 2.1) mit Aqua dest. auf genau 11µl aufgefüllt, gemischt
(Vortex), für 10 Minuten bei 70°C inkubiert und anschließend in Eiswasser überführt.
Weiterhin wurden jeder Probe 4µl 5x Superscript TM -Puffer, 2µl 100mM DTT, 1µl 10mM
dNTPs, 1µl RNAse Guard (Promega, RNasin® Ribonuclease Inhibitor) und 1µl Supersrcipt
Reverse Transkriptase zugegeben. Der Reaktionsansatz wurde gemischt und für 1 Stunde
bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Proben mit Aqua dest. auf ein Endvolumen von
50µl aufgefüllt und ein adäquates Volumen Phenol / Chloroform zugegeben. Nach der
Zentrifugation (4°C, 14.000 UPM, 10 Minuten) erfolgten die Abnahme und Reinigung des
Überstandes über Sephadex-Säulchen (Sephadex CL-6B, Pharmacia) und das Ansetzen der
PCR (2.12.3).
Tab.2.1: Übersicht über den für die Reverse Transkriptase-Reaktion verwendeten
Primer
Primer Position am 5’Ende Primersequenz (5’- 3’)
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OX-5 6408 GAAAATACTATCAAACTGGG
2.12.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Um das synthetisierte cDNA-Fragment zu vervielfältigen, wurde im Anschluß an die cDNA-
Synthese eine PCR durchgeführt. Der Standardreaktionsansatz enthielt: 2,5µl Probe
(cDNA); 2,5µl 10 x PCR-Puffer; 0,75µl 50mM MgCl 2 ; 0,5µl 10mM dNTPs; 0,5µl 20µM Primer
OX-9; 0,5µl 20µM Primer OX-10 (siehe Tabelle 2.2); 0,2µl Taq-Polymerase (0,02U / µl,
AmpliTaq® DNA Polymerase, Perkin Elmer), die mit sterilem Aqua dest. auf ein Endvolumen
von 25µl gebracht wurden.
Standardprotokoll für die PCR:
1. 94°C 2’ Denaturierung
2. 92°C 30’’ Denaturierung*
3. 50°C 30’’ Annealing*
4. 72°C 30’’ Elongation*
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