2 Material und Methoden
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2.12.2 Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)<br />
Der Einsatz der Reversen Transkriptase ermöglicht die Synthese eines zur Template-RNA<br />
komplementären DNA-Stranges (cDNA). Für die Reaktion wurden 1µl RNA-Lösung <strong>und</strong> 1µl<br />
20µM Primer OX-5 (siehe Tabelle 2.1) mit Aqua dest. auf genau 11µl aufgefüllt, gemischt<br />
(Vortex), für 10 Minuten bei 70°C inkubiert <strong>und</strong> anschließend in Eiswasser überführt.<br />
Weiterhin wurden jeder Probe 4µl 5x Superscript TM -Puffer, 2µl 100mM DTT, 1µl 10mM<br />
dNTPs, 1µl RNAse Guard (Promega, RNasin® Ribonuclease Inhibitor) <strong>und</strong> 1µl Supersrcipt<br />
Reverse Transkriptase zugegeben. Der Reaktionsansatz wurde gemischt <strong>und</strong> für 1 St<strong>und</strong>e<br />
bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Proben mit Aqua dest. auf ein Endvolumen von<br />
50µl aufgefüllt <strong>und</strong> ein adäquates Volumen Phenol / Chloroform zugegeben. Nach der<br />
Zentrifugation (4°C, 14.000 UPM, 10 Minuten) erfolgten die Abnahme <strong>und</strong> Reinigung des<br />
Überstandes über Sephadex-Säulchen (Sephadex CL-6B, Pharmacia) <strong>und</strong> das Ansetzen der<br />
PCR (2.12.3).<br />
Tab.2.1: Übersicht über den für die Reverse Transkriptase-Reaktion verwendeten<br />
Primer<br />
Primer Position am 5’Ende Primersequenz (5’- 3’)<br />
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯<br />
OX-5 6408 GAAAATACTATCAAACTGGG<br />
2.12.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)<br />
Um das synthetisierte cDNA-Fragment zu vervielfältigen, wurde im Anschluß an die cDNA-<br />
Synthese eine PCR durchgeführt. Der Standardreaktionsansatz enthielt: 2,5µl Probe<br />
(cDNA); 2,5µl 10 x PCR-Puffer; 0,75µl 50mM MgCl 2 ; 0,5µl 10mM dNTPs; 0,5µl 20µM Primer<br />
OX-9; 0,5µl 20µM Primer OX-10 (siehe Tabelle 2.2); 0,2µl Taq-Polymerase (0,02U / µl,<br />
AmpliTaq® DNA Polymerase, Perkin Elmer), die mit sterilem Aqua dest. auf ein Endvolumen<br />
von 25µl gebracht wurden.<br />
Standardprotokoll für die PCR:<br />
1. 94°C 2’ Denaturierung<br />
2. 92°C 30’’ Denaturierung*<br />
3. 50°C 30’’ Annealing*<br />
4. 72°C 30’’ Elongation*<br />
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