2 Material und Methoden

Inokulieren
Um die source-Blätter der Tabak-Pflanze mit dem entsprechenden Virus zu infizieren,
wurden diese um eventuelle Rückstände von Schädlingsbekämpfungsmitteln zu entfernen
mit Leitungswasser gereinigt und anschließend sorgfältig getrocknet. Die Blattspreiten
wurden dünn mit Aluminiumoxidstaub (Carborandumpuder extra fein) bestäubt.
Anschließend wurden 4µl Transcript oder 20µl einer Viruspartikel enthaltenen Suspension je
Blattspreite aufgetragen und mit dem Finger auf der gesamten Fläche verrieben. Die
Blattspreiten wurden danach mit fließendem Wasser von Carborandumpuder und
Zelltrümmern gereinigt. Die so behandelten Pflanzen wurden bis zum folgendem Morgen
vollständig mit Zeitungspapier abgedeckt.
Für die Inokulierung der „Brücken„-Infektionen wurden 7 Tage nach Parasitierung der ersten
Wirtspflanze die unteren source-Blätter mit dem Virus-Transkript bzw. der die Viruspartikel
enthaltenen Suspension inokuliert. Innerhalb einer Woche hatte sich die Virus-Infektion in
der ersten Tabak-Pflanze systemisch ausgebreitet.
14 Tage nach der Infektion der zweiten Pflanze konnte das Wirt-Parasit-System für
mikroskopische und molekularbiologische Untersuchungen genutzt werden.
2.12 RNA-DNA-Methoden
2.12.1 RNA-Isolation aus dem Wirt-Parasit-System N. benthamiana-C. reflexa
Nach erfolgreicher „Brücken„-Infektion des Wirt-Parasit-Systems Nicotiana benthamiana-
Cuscuta reflexa wurden sink-Blätter beider Wirtspflanzen geerntet. Nach Bestimmung der
Frischmasse wurden die Proben im zweifachen Volumen an Homogenisierungspuffer [50mM
Tris-HCl (pH 9,0), 100mM NaCl, 2% (w/v) SDS, 10mM EDTA ] sorgfältig gemörsert. Danach
wurden die Proben mit einem aliquoten Volumen wassergesättigtem Phenol / Chloroform [1 :
1 (v/v)] vermischt und zentrifugiert (4°C, 14.000 UPM, 10min). Der abgenommene
Überstand wurde erneut mit Phenol / Chloroform behandelt. Die Phenol / Chloroform-
Extraktion wurde so oft wiederholt, bis die phenolische Phase klar und frei von Pigmenten
war. Zur Fällung der RNA wurden 10% (v/v) 3M Natriumacetat und 2,5vol% Isopropanol
zugegeben und für 20 Minuten bei -20°C inkubiert. Nach Zentrifugation (4°C, 14.000 UPM,
20min) wurde das Pellet zweimal mit 0,25ml 70%igem Ethanol gewaschen. Nach dem
Trocknen wurde das Pellet in 50µl sterilem Aqua dest. resuspendiert. Zur Bestimmung der
RNA-Konzentration wurde die Extinktion bei 260nm gemessen. Um den Kontaminationsgrad
durch Proteine zu prüfen, wurde eine zusätzliche Extinktionsbestimmung bei 280nm
vorgenommen.
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