2 Material und Methoden

2.9 Fraktionierung pflanzlicher Extrakte mittels Ionenaustauscher
Parasitierte Blätter von Pelargonium zonale wurden nach dem Begasen mit 14 CO 2 und
unterschiedlichen Translokationszeiten (3, 24 und 72 Stunden) in definierte Abschnitte
zerteilt und über Nacht, mindestens jedoch 12 Stunden in 70%igem Methanol unter
Schütteln extrahiert. Die Proben wurden anschließend 10 Minuten bei 5000 UPM
zentrifugiert. Die Pellets wurden zum Stärkeaufschluß, die Überstände für die Fraktionierung
mittels Ionenaustauscher und für die Zuckerchromatographie verwendet (siehe 2.6).
Die Überstände wurden im Rotationsverdampfer bis zur Trockne eingeengt und die
Rückstände in einer definierten Menge Aqua dest. resuspendiert. Die Fraktionierung der
Proben in organische Säuren, Aminosäuren und neutrale Verbindungen erfolgte bei
Raumtemperatur.
Als Kationenaustauscher wurde AG ® 50W-X4 von BIO-RAD benutzt. Die Aminosäuren
wurden mit 10%iger Ammoniaklösung in 50% Ethanol eluiert. Als Anionenaustauscher
wurde Bio Rex 5 (BIO-RAD) in 10mM Tris/HCl (pH 8,0) verwendet. Die organischen Säuren
wurden mit 2N Ameisensäure eluiert.
Das Effluat und die Eluate wurden mittels Vakuumkonzentrator zur Trockne eingeengt, in
einen geringen Volumen Aqua dest. aufgenommen und aliquote Mengen davon nach
Neutralisation für die Radioaktivitätsbestimmung eingesetzt.
2.10 Stärkeaufschluß
Die Pellets wurden sechsmal mit Aqua dest. gewaschen, anschließend im zehnfachen
Volumen Aqua dest. aufgenommen und zur Gelatinisierung eine Stunde im Wasserbad auf
100°C erhitzt. Nach dem Abkühlen der Proben wurde ein adäquates Volumen an
Aufschlußpuffer (50mM Natriumacetat / Essigsäure (pH 4,5) mit 20U/ml Amyloglucosidase)
hinzugefügt und über Nacht unter Schütteln inkubiert. Nach Filtration und Einengen der
Proben im Vakuumkonzentrator bis zur Trockne wurden die Proben in einer definierten
Menge Aqua dest. aufgenommen, neutralisiert und aliquote Teile für die Bestimmung der
Radioaktivität eingesetzt.
2.11 Translokation von Viren
Alle Arbeiten zur Translokation von Viren wurden am Scotish Crop Research Institute in
Dundee, Schottland in der Arbeitsgruppe von Prof. Karl Oparka durchgeführt. Die für die
Arbeiten notwendigen Virenplasmide und die beim Western Blotting und der RT-PCR
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