2 Material und Methoden
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saure Invertase) bzw. pH 7,0 (alkalische Invertase) inkubiert.<br />
Zusammensetzung des Bestimmungspuffers:<br />
• 50mM Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O pH 4,5 bzw.7,0<br />
• 50mM Zitronensäure<br />
• 100mM Saccharose<br />
Inkubationsansätze:<br />
• Saure zellwandgeb<strong>und</strong>ene Invertase<br />
10mg Zellwandpellet + 140µl Extraktionslösung + 150µl Bestimmungspuffer (pH 4,5)<br />
• Saure lösliche Invertase<br />
150µl Überstand + 150µl Bestimmungspuffer (pH 4,5)<br />
• Neutrale lösliche Invertase<br />
150µl Überstand + 150µl Bestimmungspuffer (pH 7,0)<br />
Inkubation: 20 Minuten unter Schütteln bei 30°C.<br />
Abstoppen: 10 Minuten Erhitzen auf 95°C im Wasserbad.<br />
Die Kontrolle wurden sofort bei 95°C für 15 Minuten inkubiert. Nach dem Abkühlen wurden<br />
die Proben für 10 Minuten bei 10.000 UPM zentrifugiert. Der Überstand wurde für die<br />
Glucosebestimmung mit dem Bestimmungskit 716251 von Boehringer-Mannheim<br />
eingesetzt.<br />
Die Enzymaktivität wurde für die zellwandgeb<strong>und</strong>ene Invertase in µmol Glucose /mg<br />
ZW*min, für die löslichen Invertasen mit µmol Glucose /mg FM*min angegeben.<br />
2.8.2 Saccharosesynthase (Susy)<br />
Die Bestimmung der Saccharosesynthase-Aktivität erfolgte in Richtung Saccharosespaltung<br />
nach WEBER et al. (1996 a). Definierte Abschnitte des Wirt-Parasit-Systems wurden nach<br />
Bestimmung der Frischmasse im dreifachen Volumen Extraktionspuffer gemörsert (100mM<br />
MOPS/KOH (pH 7,5); 10mM MgCl 2 x 6 H 2 O; 1mM EDTA; 1mM EGTA; 2mM DTT). Nach<br />
gründlichem Mischen auf dem Vortex wurden die Proben für 10 Minuten bei 4ºC <strong>und</strong> 10.000<br />
UPM zentrifugiert.<br />
Zur Aktivitätsbestimmung des Enzyms wurden 30µl des Überstandes mit 150µl<br />
Bestimmungspuffer I vermischt <strong>und</strong> für 10 Minuten bei 25ºC unter Schütteln inkubiert.<br />
Zusammensetzung des Bestimmungspuffers I:<br />
• 75mM HEPES/KOH (pH 7,5)<br />
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