2 Material und Methoden
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2.5 Anfertigung der Semidünnschnitte<br />
Erfolgreich parasitierte Blattstiele von Pelargonium wurden in 1-2mm dicke Scheiben<br />
geschnitten <strong>und</strong> mit Hilfe eines Einbettungsautomaten (LYNXel, Australian Biomedical<br />
Corporatio, LTD, Mount Waverley, Vic. Australien) mit Glutaraldehyd fixiert, mit<br />
Osmiumtetroxid kontrastiert <strong>und</strong> in ERL (Fluka, Buchs, Schweiz) eingebettet.<br />
Die Polymerisation erfolgte während 120 St<strong>und</strong>en bei 60°C. Zur Anfertigung der<br />
Semidünnschnitte (Dicke = 0,5µm) wurde ein Ultramikrotom (Reichert OmU 2, Wien,<br />
Österreich) benutzt. Für die Photographie wurden die Schnitte mit Azur2-Methylenblau (1%<br />
Azur 2 in Aqua dest./ 1% Methylenblau in 1% Borax; = 1:1) gefärbt.<br />
2.6 Dünnschichtchromatographie (DC)<br />
Für die Trennung von Zuckern wurden Kieselgel Fertigplatten (Silufol, Kavalier Votice,<br />
Tschechien) verwendet. Methanolische Extrakte der zu untersuchenden Pflanzenabschnitte<br />
wurden am Rotationsverdampfer bis zur Trockne eingeengt, in einer definierten Menge<br />
Methanol aufgenommen <strong>und</strong> 10-20µl dieser Lösung punktförmig aufgetragen. Die Trennung<br />
erfolgte durch fünfmaliges Entwickeln in Chloroform : Eisessig : Wasser = 30 : 35 : 5 bei<br />
voller Kammersättigung (DE STEFANIES & PONTE, 1968). Die Detektion der einzelnen Zucker<br />
erfolgte durch Besprühen mit Anilin-Diphenylamin <strong>und</strong> anschließender Erwärmung der<br />
Folien auf 110ºC im Trockenschrank (SCHWIMMER & BEVENNE, 1956). Die Zucker erscheinen<br />
dabei in folgenden Farben: Saccharose – graubraun, Glucose – blau, Fructose – rot. Zur<br />
Identifizierung diente ein Standardgemisch aus Saccharose, Glucose <strong>und</strong> Fructose. Für die<br />
quantitative Radioaktivitätsbestimmung der markierten Zucker wurden die entwickelten<br />
Chromatogramme auf einem Screen exponiert <strong>und</strong> mit dem Phosphorimager ausgewertet.<br />
2.7 Nachweis der Lokalisation radioaktiv markierter Verbindungen mit dem<br />
Phosphorimager<br />
Zum Nachweis der Lokalisation radioaktiver Verbindungen in Geweben wurden 1mm dicke<br />
Handschnitte aus den zu untersuchenden Pflanzenabschnitten angefertigt, bei -20°C<br />
eingefroren <strong>und</strong> für 24 St<strong>und</strong>en zwischen Objekträgern gefriergetrocknet.<br />
Dünnschichtchromatogramme wurden nach dem Entwickeln sorgfältig getrocknet, um alle<br />
Laufmittelreste zu entfernen, die zu einer Beschädigung des Screens führen können.<br />
Je nach Radioaktivitätsgehalt erfolgte die Exposition der gefriergetrockneten Handschnitte<br />
bzw. die Dünnschichtchromatogramme für 12-96 St<strong>und</strong>en auf einem Storage Phosphor<br />
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