2 Material und Methoden

Material und Methoden
2.2.6 Spaltung der DNA mit Restriktionsendonukleasen
Restriktionsendonukleasen können einen DNA-Strang unter Hydrolyse der Phosphodiesterbindungen
spalten (McClarin et al, 1986). Restriktionsanalysen wurden in einem Volumen von
10-20 µl durchgeführt. Ein 20 µl Ansatz setzte sich folgendermaßen zusammen:
DNA-Lösung 5 µl = 0.1-1 µg
10xPuffer 2 µl
(BSA-Lösung 10 mg/ml) 0.2 µl
Restriktionsenzym 1 µl = 5 - 20 Einheiten
deionisiertes Wasser ad 20 µl
Inkubiert wurde mindestens 3-4 h bei 37 °C. Bei präparativer Durchführung wurde der Ansatz
verdoppelt oder verdreifacht und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
2.2.7 Dephosphorylierung von DNA-Enden
Die Dephosphorylierung von 5‘-DNA-Enden ist notwendig, um bei Klonierungen in einem
linearisierten Vektor mit kompatiblen Enden eine Selbstligation des Vektors zu verhindern. Diese
Reaktion wird von der Alkalischen Phosphatase katalysiert. Ein typischer Ansatz setzte sich
folgendermaßen zusammen:
DNA 15 - 20 µl
Puffer (10x) 3 µl
Alkalische Phosphatase 1 µl
deionisiertes Wasser ad 30 µl
Die Reaktionsmischung wurde bei 37 °C für 1 h inkubiert. Anschließend wurde die Alkalische
Phosphatase bei 65 °C für 10 min inaktiviert.
2.2.8 Ligierung von DNA-Fragmenten
Zur Einklonierung von Genfragmenten in einen geöffneten Vektor müssen die Enden der DNA-
Doppelstränge wieder kovalent über Phosphodiesterbindungen miteinander verknüpft werden. Die
DNA-Ligase des Bakteriophagen T4 katalysiert diese endergonische Reaktion mittels ATP-Hydrolyse.
Ein Ligationsansatz setzte sich folgendermaßen zusammen:
5x Ligasepuffer (mit ATP) 4 µl
Vektorfragment 2 µl
Insertfragment 8 - 10 µl
T4-Ligase
1 µl = 1 Einheit
deionisiertes Wasser ad 20 µl
Es wurde jeweils ein vierfacher molarer Überschuss des Insertfragmentes gegenüber dem Vektor
eingesetzt. Inkubiert wurde über Nacht bei 16 °C.
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