2 Material und Methoden

Material und Methoden
bei 20 °C in 0,.25 M L-Arginin, 50 mM Na-Phosphat, 1 mM EDTA, pH 7,4 gegeben. Die Messdaten
wurden mit Hilfe des Programms ORIGIN Software (Microcal Software, Northampton, MA)
ausgewertet.
2.3.30 Analytische Ultrazentrifugation
Das Molekulargewicht globulärer Proteine kann mittels Sedimentationsgleichgewichtszentrifugation
über die Abhängigkeit der Konzentration vom Abstand zur Rotorachse bestimmt werden (Harding,
1997).
d ln A 2RT
M r
(3)
dr (1 −νρ)
⋅ω
( ) =
2
2
mit:
M r
molekulare Masse in g/mol
r
radialer Abstand von der Rotora chse in m
A
Absorption
T
Temperatur in K
R
molare Gaskonstante (8,314J/(K*mol)
ν
partielles spezifisches Volumen des Proteins in ml/g
ω Winkelgeschwindigkeit in s- 2
p
Dichte des Lösungsmittels in g/ml
Sedimentationsgleichgewichtsläufe von nGLP-1R wurden freundlicherweise von Dr. Hauke Lilie
(Institut für Biotechnologie, MLU Halle) in einer Optima XL-A analytischen Ultrazentrifuge
(Beckman Instruments, Inc., Fullerton, U.S.A.) durchgeführt. Die Messungen wurden bei einer
Proteinkonzentration von ca. 100 µg/ml in Doppelsektor-Zellen bei einer Umdrehungsgeschwindigkeit
von 20000 rpm bei 20 °C in einem An60Ti-Rotor durchgeführt. Analyse der
experimentellen Daten erfolgte mit Hilfe des Programms von A. Milton (Rivas et al., 1999). Das
partielle spezifische Volumen des Proteins wurde aus dem durchschnittlichen partiellen Volumen der
Aminosäuren errechnet und betrug 0,73 ml/g.
2.3.31 N-terminale Proteinsequenzierung
Die N-terminale Sequenzierung wurde freundlicherweise von Dr. Peter Rücknagel (Max-Planck-
Gesellschaft, Halle) durchgeführt. Die zu sequenzierende Proteinprobe wurde in dem Transferpuffer
bestehend aus 50 mM Na-Borat, pH 9,0; 20 % (v/v) Methanol auf eine PVDF-Membran geblottet.
Nach dem Transfer wurde die Membran direkt mit 40 % (v/v) Methanol, 10 % (v/v) Eisessig und
0,1 % (w/v) Coomassie R250 angefärbt. Die zu analysierende Proteinbande wurde aus der Membran
ausgeschnitten, von der Membran abgelöst, mit einer Nucleosil 500-5 C3-PPn-Säule an einem
LC-10A RP HPLC-System (Shimadzu, Kyoto, Japan) entsalzt. Die Bestimmung der
Aminosäuresequenz nach Edman (Edman & Begg, 1967) erfolgte an einem 476 A Gasphasen-
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