2 Material und Methoden

Material und Methoden
Entfernung von DTT mehrfach einer Dialyse gegen 4 M GdmHCl, pH 2,5 unterzogen. Die
solubilisierten Inclusion Bodies wurden bei –20 °C gelagert.
2.3.5 Renaturierung des nGLP-1R
Die Rückfaltung von nGLP-1R erfolgte durch 1 :100 Vedünnung in einen auf 15 °C vortemperierten
Rückfaltungspuffer (0,5 M Arginin-HCl, 0,1 M Tris, 1 mM EDTA, 2 mM GSH/ 5 mM GSSG, pH 8,5)
bei einer Ausgangsproteinkonzentration bis zu 10 mg/ml und anschließender Inkubation für >5-6 h bei
15 °C.
2.3.6 Pulsrenaturierung von nGLP-1R
Bei größeren Ansätzen wurde eine Pulsrenaturierung von nGLP-1R an einem
Renaturierungsautomaten (FairMenTech, Göttingen). Dabei wurde zu auf 10 °C vorgekühltes 0.5-1 l
Renaturieungspuffer 6 Pulse mit je 5-10 ml solubilisierten IB-Material in einem Zeitintervall von 6 h
unter Rühren (400 rpm) zugegeben. Nach 36 h wurde das lösliche Protein durch eine Zentrifugation
für 20 min bei 10000 rpm und 4 °C von Aggregaten abgetrennt.
2.3.7 Renaturierung der Rezeptor-Ligand-Chimäre
Die Rückfaltung von nGLP-1R-GLP-1-Chimäre erfolgte während einer zweitägigen Dialyse gegen
0,5 M Arginin, 0,1 M Tris, 1 mM EDTA, pH 8,5 bei 15 °C bei einer Ausgangsproteinkonzentration
von 1 mg/ml.
2.3.8 Optimierung der Renaturierung des nGLP-1R
Faltung des nGLP-1R wurde mittels Reversed Phase HPLC an einem Beckmann Gold HPLC-system
(Beckman Coulter, Fulerton, CA, USA) durchgeführt. Je 900 µl Renaturierungsansatz wurden mit
100 µl 32 % (v/v) HCl gestoppt und davon 100 µl bei einem Fluss von 0,5 ml/min auf einen Poros 10
R1-Säule (Roche Diagnostics, Mannheim) aufgetragen. Das gebundene Protein wurden mit einem
nicht-linearen Gradienten (0-5 min: 0-20 % B; 5-25 min: 20-80 % B; 25-30 min: waschen mit
100 % B) eluiert. Elutionspeaks wurden bei 215 nm und 280 nm detektiert. Laufmittel A: 0,1 % (v/v)
TFA in Wasser; Laufmittel B: 0,1 % (v/v) TFA in 80 % Acetonitril. Die Quantifizierung der
Renaturierungsausbeuten erfolgte über die Größe der Peakfläche. Die Peakflächen wurden mit dem
Programm „Peakfit“ V 2.01 integriert. Die Eichung der Säule wurde mit 0,5-10 µg von aufgereinigtem
nGLP-1R durchgeführt.
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