Effekt selektiver und nicht selektiver nichtsteroidaler Antiphlogistika ...

Material und Methoden
Proteinkonzentration konnte die Menge der Ausgangslösung errechnet werden, die
für eine Gesamtmenge von 20 µg Protein nötig war. Diese wurde anschließend mit
1%igem SDS und Lämmlipuffer entsprechend eingestellt.
3.4.3.2 SDS-Gelelektrophorese
Die Elektrophorese dient der Auftrennung von Proteinen entsprechend ihres
Molekulargewichtes. Das SDS-Gel bestand aus einem Sammel- und einem
Trenngel. Das Sammelgel dient dem Sammeln der Proteine vor dem Trenngel, das
Trenngel dient der Auftrennung der Proteine entsprechend ihres Molekulargewichtes.
Beide Gele hatten eine Dicke von 1,5 mm. Sowohl für die COX-1- als auch für
COX-2-Proteine wurde ein Trenngel mit 10 % Acrylamid verwendet. Für die
Elektrophorese wurde die Apparatur von Peqlab Biotechnology GmbH (Erlangen) mit
einem SDS-Laufpuffer eingesetzt. Nach Befüllen der Slots mit den Proben bzw. 5 µl
des Markers Page Ruler TM Prestained Protein Ladder (Fermentas Life Science
Thermo Fisher Scientific GmbH, Dreieich) wurde für zehn Minuten eine Spannung
von 100 Volt zum Durchlaufen des Sammelgels angelegt. Für das Durchlaufen des
Trenngels wurde anschließend die Spannung für 90 Minuten auf 150 Volt erhöht.
3.4.3.3 Western Blot für die Cyclooxygenase-1 und -2
Der Westernblot diente der Übertragung der aufgetrennten Proteine von der
Acrylamidmatrix des SDS-Gels auf eine Nitrocellulosemembran. Dazu wurde das
SDS-Gel aus der Elekrophoreseapparatur entnommen und zusammen mit sechs
Filtern und einer Nitrocellulosemembran in der Größe des Gels in eine Schale mit
Blotpuffer gelegt. Anschließend wurde in der Westernblotapparatur (Peqlab
Biotechnology GmbH, Erlangen) ein „Sandwich“ gebildet. Dieses bestand aus drei
Filtern auf die die Nitrocellulosemembran gelegt wurde, darauf folgte das SDS-Gel
und erneut drei Filtern. Wichtig war, dass sich zwischen den Schichten keine
Luftblasen bildeten, dieses wurde durch sorgfältiges Glattstreichen der einzelnen
Schichten bewirkt. Anschließend wurde die Westernblotapparatur mit einem Deckel
verschlossen und für 60 Minuten eine Stromstärke von 60 mA angelegt.
3.4.3.4 Immunodetektion
Die Immunodetektion diente der Visualisierung der Proteine auf der
Nitrocellulosemembran. Alle verwendeten Primär- und Sekundärantikörper stammen
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