Effekt selektiver und nicht selektiver nichtsteroidaler Antiphlogistika ...

Material und Methoden
2. Proteinpräzipitation
Der Überstand wurde abpipettiert und in ein neues Tube überführt. Nach der Zugabe
von 750 µl Isopropanol (SAV-Liquid Production GmbH, Flintsbach) erfolgte eine
10-minütige Inkubation bei RT, bevor die Probe erneut zehn Minuten bei 4 °C und
12.000 xg zentrifugiert wurde. Nach der Zentrifugation hatte sich erneut ein Pellet
gebildet, dieses enthielt die Proteine.
3. Waschen
Der Überstand wurde verworfen und es wurden 1 ml 0,3 M Guanidinhydrochlorid in
95%igem Alkohol zum Pellet gegeben. Damit das Pellet sich vom Boden löst, wurde
die Probe gevortext, bevor sie für 20 Minuten bei RT inkubierte. Anschließend
erfolgte erneut eine Zentrifugation für fünf Minuten bei 4 °C und 7.500 xg. Der
beschriebene Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Nach dem letzten
Waschschritt wurde der Überstand wieder verworfen, das Pellet in 1 ml 100%igem
Ethanol (SAV-Liquid Production GmbH, Flintsbach) gelöst, das Tube kurz gevortext
und anschließend 20 Minuten bei RT stehen gelassen bevor es für fünf Minuten bei
4 °C, 7.500 xg zentrifugiert wurde. Danach hatte man erneut ein Proteinpellet und
einen Überstand, der verworfen wurde.
4. Pellet trocknen und resuspendieren
Das Proteinpellet trocknete anschließend zehn Minuten unter dem Abzug bevor
100µl 1%iger Sodiumdodecylsulfat (SDS)-Lösung zugegeben wurde und das Pellet
durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren resuspendiert wurde. Um das
Resuspendieren zu unterstützen wurde die Probe anschließend für 90 Minuten bei
50 °C inkubiert und alle zehn Minuten vorsichtig gevortext. Danach wurde das Tube
zentrifugiert (10 Minuten, 4 °C, 10.000 xg). Nach dem Zentrifugieren enthielt der
Überstand die Proteine, so dass dieser abpipettiert und in ein neues Tube überführt
werden konnte.
Die Proteinvermessung wurde mit dem Bio-Rad DC TM Protein Assay Kit (Bio-Rad-
Laboratories GmbH, München) im Mikroplattenleser (Mithras LB 940 Berthold
Technologies, Bad Wildbad) bei einer Absorption von 700 nm durchgeführt. Als
Kalibrierung diente eine Standardreihe aus BSA (2 µg/µl). Über die gemessene
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