Effekt selektiver und nicht selektiver nichtsteroidaler Antiphlogistika ...
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Material und Methoden 10 x Inkubationspuffer mit MgCl 2 5 µl DNase, RNase free (10 U/µl) 1 µl RNase Inhibitor (40 U/µl) 0,5 µl RNase freies Wasser ad 50 µl Anschließend wurden die Proben im Thermocycler (Peqlab Biotechnology GmbH, Erlangen) nach einem festen Programm behandelt. Zunächst erfolgte eine 20-minütige Inkubation bei 37 °C, die zu einer Aktivierung der DNase führte. Danach erfolgte eine 10-minütige Inkubation bei 75 °C, die zu einer Deaktivierung und zu einem Abbau der DNase führte. Anschließend erfolgte eine Lagerung bei 4 °C. Das Ergebnis des DNase Verdaus waren 10 µg DNA-freie RNA in 50 µl. 3.4.2.4 cDNA-Synthese Die DNA-freie RNA wurde im Anschluss in cDNA (complementary DNA) umgeschrieben. Dazu wurden 6 µl DNA-freie RNA eingesetzt. Zu dieser wurden folgende Reagenzien in vorgegebener Reihenfolge pipettiert: 10 x RT Gold Buffer 5 µl MgCl 2 (25 mM) 11 µl dNTP Mix (10 Mm) 10 µl RandomHexamers (50 µM) 2,5 µl RNAse Inhibitor (20 U/µl) 1 µl MultiScribe TM Reverse Transcriptase (50 U/µl) 3,125 µl Dies wurde mit RNase freiem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 50 µl aufgefüllt. Die sich anschließende Probenbearbeitung im Thermocycler begann mit einer 10- minütigen Inkubation bei 25 °C, die der Anlagerung der Primer (RandomHexamers) an die RNA diente. Es folgte eine 60-minütige Inkubation bei 37 °C, in der die Transkription stattfand, bevor die Reverse Transkriptase während der sich anschließenden 5-minütigen Inkubation bei 95 °C abgebaut wurde. 3.4.2.5 Konventionelle PCR für Cyclooxygenase-1 und -2 Bei der RT-PCR wird in vitro ein genau definierter Abschnitt der DNA, bzw. cDNA mit Hilfe der DNA-Polymerase vervielfältigt. Sie wurde durchgeführt, um die Proben der 76
Material und Methoden Tunica muscularis auf die Expression von COX-1 und COX-2 zu untersuchen und damit die Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchung zu überprüfen bzw. zu bestätigen. Es wurde ein Mastermix aus folgenden Reagenzien in der angegebenen Reihenfolge zusammenpipettiert (4-Fach Ansatz). Das Volumen des Reaktionsansatzes betrug 24µl. H 2 O 64 µl 5 x Green Go Taq Buffer 20 µl MgCl 2 4 µl dNTP Mix 2 µl Primer for (Tabelle 2) 2 µl Primer rev (Tabelle 2) 2 µl Go Taq Polymerase 2 µl cDNA 1 µl Die Go Taq Polymerase war das Enzym, die verwendeten Primer für die COX-1- und COX-2-Amplifikation sind tabellarisch (Tabelle 2) aufgeführt. Tabelle 2: Übersicht über die in der RT-PCR verwendeten Primer Gen Temp. Zyklen Sequenz 5‘ 3‘ Produkt Accession Nr. (in °C) COX-1 60 40 for CAG ATG CTG 153 bp NM_001163976.1 AAT GGA GAG ATG rev GCC AGA GCG TAG CAT AGA GC COX-2 58 35 for AGA ACT TAC 118 bp NM_001081775.1 AGG AGA GAA GGA rev CGA AGA TGG CAT CTG GG 77
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Material <strong>und</strong> Methoden<br />
10 x Inkubationspuffer mit MgCl 2 5 µl<br />
DNase, RNase free (10 U/µl) 1 µl<br />
RNase Inhibitor (40 U/µl) 0,5 µl<br />
RNase freies Wasser ad 50 µl<br />
Anschließend wurden die Proben im Thermocycler (Peqlab Biotechnology GmbH,<br />
Erlangen) nach einem festen Programm behandelt. Zunächst erfolgte eine<br />
20-minütige Inkubation bei 37 °C, die zu einer Aktivierung der DNase führte. Danach<br />
erfolgte eine 10-minütige Inkubation bei 75 °C, die zu einer Deaktivierung <strong>und</strong> zu<br />
einem Abbau der DNase führte. Anschließend erfolgte eine Lagerung bei 4 °C. Das<br />
Ergebnis des DNase Verdaus waren 10 µg DNA-freie RNA in 50 µl.<br />
3.4.2.4 cDNA-Synthese<br />
Die DNA-freie RNA wurde im Anschluss in cDNA (complementary DNA)<br />
umgeschrieben. Dazu wurden 6 µl DNA-freie RNA eingesetzt. Zu dieser wurden<br />
folgende Reagenzien in vorgegebener Reihenfolge pipettiert:<br />
10 x RT Gold Buffer 5 µl<br />
MgCl 2 (25 mM) 11 µl<br />
dNTP Mix (10 Mm) 10 µl<br />
RandomHexamers (50 µM) 2,5 µl<br />
RNAse Inhibitor (20 U/µl) 1 µl<br />
MultiScribe TM Reverse Transcriptase (50 U/µl) 3,125 µl<br />
Dies wurde mit RNase freiem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 50 µl aufgefüllt.<br />
Die sich anschließende Probenbearbeitung im Thermocycler begann mit einer 10-<br />
minütigen Inkubation bei 25 °C, die der Anlagerung der Primer (RandomHexamers)<br />
an die RNA diente. Es folgte eine 60-minütige Inkubation bei 37 °C, in der die<br />
Transkription stattfand, bevor die Reverse Transkriptase während der sich<br />
anschließenden 5-minütigen Inkubation bei 95 °C abgebaut wurde.<br />
3.4.2.5 Konventionelle PCR für Cyclooxygenase-1 <strong>und</strong> -2<br />
Bei der RT-PCR wird in vitro ein genau definierter Abschnitt der DNA, bzw. cDNA mit<br />
Hilfe der DNA-Polymerase vervielfältigt. Sie wurde durchgeführt, um die Proben der<br />
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