Effekt selektiver und nicht selektiver nichtsteroidaler Antiphlogistika ...

Material und Methoden
circa 45 Sekunden homogenisiert. Nach fünfminütiger Inkubation bei RT wurden
100 µl Chloroform (E. Merck KGaA, Darmstadt) dazu pipettiert und das Tube
15 Sekunden in der Hand geschwenkt. Nach erneuter Inkubation bei RT (3 Minuten)
wurde die Probe 15 Minuten bei 4°C und 12.000 xg (Zentrifuge Fresco 21, Thermo
Scientific, Langenselbold) zentrifugiert (alle unter 3.4 aufgeführten Zentrifugationen
wurden mit dieser Zentrifuge durchgeführt). Das Ergebnis war eine Aufteilung der
Probe in drei Phasen: In die farblose wässrige Phase, diese enthielt die RNA, in die
weiße Interphase, in der die DNA enthalten war und in die organische rosa Phase mit
den darin enthaltenen Proteinen (Abb. 7)
Abb. 7: Die Produkte der Trizolextraktion
3.4.2 Vorbereitung für die konventionelle PCR (mRNA-Analyse)
3.4.2.1 RNA Isolierung
Die obere, farblose Phase, die die RNA enthielt wurde in ein 1,5 ml RNase freies
Tube (Eppendorf AG, Hamburg), pipettiert. Die sich anschließende RNA-Isolierung
gliederte sich in drei Schritte:
1. Präzipitation
Zum Ausfällen der RNA wurden 250 µl Isopropanol (SAV-Liquid Production GmbH,
Flintsbach) zu der wässerigen, farblosen Phase pipettiert, das Tube mehrmals
geschwenkt und zehn Minuten bei RT inkubiert. Anschließend erfolgte eine 10-
minütige Zentrifugation bei 4 °C und 12.000 xg.
74