Effekt selektiver und nicht selektiver nichtsteroidaler Antiphlogistika ...

Material und Methoden
3.3.4.3 Cyclooxygenase 2
Für die immunhistochemische Darstellung der COX-2 wurden in Bouin fixierte
Gewebeschnitte verwendet. Nach Entparaffinieren, Überführung in das wässrige
Milieu und Blockierung der endogenen Peroxidase mit Hilfe von 3%igem H 2 O 2 (E.
Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) wurden die Schnitte drei mal fünf Minuten in
PBS gewaschen und anschließend für 10 Minuten in 96-99 °C heißem
Ethylendiamintetraacetatpuffer (EDTA-Puffer) zur Demaskierung des Antigens
verbracht. Nach Abkühlen auf 60-65 °C erfolgte ein einmaliges Spülen mit PBS und
anschließend eine 20-minütige Inkubation mit normalem Ziegenserum um
nichtspezifische Antikörperbindungen zu verhindern. Die folgende Inkubation des
Primärantikörpers (COX-2, Klon SP21, monoklonal, Kaninchen, Thermo Fisher
Scientific GmbH, Dreieich, Deutschland) in einer Dosierung von 1:50 erfolgte über
Nacht im Kühlschrank (4 °C), wie in Tabelle1 dargestellt. Am nächsten Tag wurde
nach dreimaligem Spülen mit PBS der Sekundärantikörper (Envision Rabbit, aus der
Ziege, DAKO, Hamburg, Deutschland), der in einer ready to use Verdünnung vorlag,
zugegeben und für 30 Minuten belassen. Nach erneutem Spülen in PBS wurden die
Schnitte mit dem chromogenen System DAB (BioGenex, San Ramon, California,
USA) unter mikroskopischer Kontrolle bis zu einer adäquaten Farbreaktion
behandelt. Nach 10-minütigem Spülen unter fließendem Leitungswasser und
Dehydratation wurden die Schnitte mit Eukitt (O. Kindler GmbH, Freiburg,
Deutschland) eingedeckt.
Die Negativ-Kontrollen wurden mit 1%igem BSA in PBS anstatt des
Primärantikörpers inkubiert. Als Isotypenkontrolle wurde IgG aus Kaninchenserum
(DAKO, Hamburg, Deutschland) eingesetzt.
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