Effekt selektiver und nicht selektiver nichtsteroidaler Antiphlogistika ...

Material und Methoden
(BioGenex, San Ramon, California, USA) unter mikroskopischer Kontrolle bis zu
einer adäquaten Farbreaktion behandelt. Anschließend wurden sie 10 Minuten unter
fließendes Leitungswasser gestellt, routinemäßig dehydriert (s. 3.3.2) und mit Eukitt
(O. Kindler GmbH, Freiburg, Deutschland) eingedeckt.
Die Negativ-Kontrollen wurden anstatt des Primärantikörpers mit 1%igem bovinem
Serumalbumin (BSA) in PBS inkubiert. Als Isotypenkontrolle wurde IgG aus
Mäuseserum (DAKO, Hamburg, Deutschland) eingesetzt.
3.3.4.2 Cyclooxygenase-1
Für die immunhistochemische Darstellung der COX-1 wurden in Bouin fixierte
Gewebeschnitte verwendet. Nach Entparaffinieren, Überführung in das wässrige
Milieu und Blockierung der endogenen Peroxidase mit Hilfe von 3%igem H 2 O 2 (E.
Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland), wurden die Schnitte drei mal fünf Minuten in
PBS gewaschen und anschließend für 20 Minuten in 96-99 °C heißem Citratpuffer
zur Demaskierung des Antigens verbracht. Nach Abkühlen auf 60-65 °C erfolgte ein
einmaliges Spülen mit PBS und anschließend eine 20-minütige Inkubation mit
3%igem BSA in PBS um nichtspezifische Antikörperbindungen zu verhindern. Die
folgende Inkubation des Primärantikörpers (COX-1, polyklonal, Kaninchen, Thermo
Fisher Scientific GmbH, Dreieich, Deutschland) in einer Dosierung von 1:500 erfolgte
über Nacht im Kühlschrank (4 °C), wie in Tabelle 1 dargestellt. Am nächsten Tag
wurde nach dreimaligem Spülen mit PBS der Sekundärantikörper (Envision Rabbit,
aus der Ziege, DAKO, Hamburg, Deutschland), der in einer ready to use Verdünnung
vorlag, zugegeben und für 45 Minuten belassen. Nach erneutem Spülen in PBS
wurden die Schnitte mit dem chromogenen System DAB (BioGenex, San Ramon,
California, USA) unter mikroskopischer Kontrolle bis zu einer adäquaten Farbreaktion
behandelt. Nach 10-minütigem Spülen unter fließendem Leitungswasser und
routinemäßiger Dehydratation wurden die Schnitte mit Eukitt (O. Kindler GmbH,
Freiburg, Deutschland) eingedeckt.
Die Negativ-Kontrollen wurden mit 1%igem BSA in PBS anstatt des
Primärantikörpers inkubiert. Als Isotypenkontrolle wurde IgG aus Kaninchenserum
(DAKO, Hamburg) eingesetzt.
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