Effekt selektiver und nicht selektiver nichtsteroidaler Antiphlogistika ...
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Diskussion erfordert (MOORE et al. 1994). Die Calprotectin-Immunhistochemie hingegen ermöglicht eine kontrastreiche Darstellung der positiven Zellen gegenüber der Umgebung und damit eine zuverlässige und einfache Auswertung der Proben. Hinzu kommt, dass es nach einem Ischämie- und Reperfusionsschaden zu einem deutlichen Anstieg von Zellen im Gewebe kommt, was einen Nachweis von einzelnen neutrophilen Granulozyten mit Hilfe der HE-Färbung schwierig macht (MOORE et al. 1994). Außerdem ist die Calprotectin-Immunhistochemie eine etablierte Methode zur Bestimmung der neutrophilen Granulozyten im Gastrointestinaltrakt (GROSCHE et al. 2008). Es gibt zwei Studien die die neutrophilen Granulozyten sowohl in der HE- Färbung als auch in der Calprotectin-Immunhistochemie quantifiziert und die Ergebnisse miteinander verglichen haben. Die eine Arbeit, welche alle Darmschichten des equinen Jejunums untersuchte, ergab das die Verteilung der Calprotectin positiven Zellen der Verteilung der neutrophilen Granulozyten in der HE- Färbung entspricht (LITTLE et al. 2005). Eine weitere Studie, die die Tunica mucosa und Tela submucosa des equinen Colon ascendens untersuchte, zeigte ebenfalls eine signifikante Korrelation in der Anzahl der neutrophilen Granulozyten in der HE- Färbung mit Calprotectin positiven Zellen in der Immunhistochemie (GROSCHE et al. 2008). Nach Etablierung haben mehrere Studien die Calprotectin-Immunhistochemie zur Bestimmung der Anzahl der neutrophilen Granulozyten am equinen Darm erfolgreich angewendet (MATYJASZEK et al. 2009; GRSOCHE et al. 2011; HOPSTER-IVERSEN et al. 2011; VENTE 2011). Aus den genannten Gründen war die Calprotectin-Immunhistochemie in der aktuellen Studie für die Bestimmung der neutrophilen Granulozyten ebenfalls die Methode der Wahl. 5.2.3 Cyclooxygenase-1 und Cyclooxygenase-2 Die Expression der COX-1 und COX-2 in der Tunica muscularis und Tunica serosa wurde in der vorliegenden Arbeit mit Hilfe der Immunhistochemie dargestellt, da die zelluläre Verteilung der COX-1 und COX-2 positiven Zellen in der Tunica muscularis und Tunica serosa beim Pferd bis jetzt nicht beschrieben ist. Auch die Beeinflussung der Expression der beiden Enzyme in der Ring- und Längsmuskelschicht der Tunica muscularis durch selektive NSAIDs und nicht selektive NSAIDs ist beim Pferd 150
Diskussion immunhistochemisch nicht untersucht. Die Darstellung der COX-1 und COX-2 ist von Interesse gewesen, da zum Beispiel eine unterschiedlich starke Expression der Enzyme in der Ring- und Längsmuskelschicht Hinweise auf einen unterschiedlichen Einfluss der selektiven NSAIDs und nicht selektiven NSAIDs liefern könnte. Damit könnten eventuell Rückschlüsse auf eine unterschiedliche Motilitätsbeeinflussung des Darms, durch eine unterschiedliche Hemmung der Prostaglandinbiosynthese, durch NSAIDs gezogen werden. Die COX-1- und COX-2-Immunhistochemie wurde am equinen Colon bereits erfolgreich angewendet (MATYJASZEK et al. 2009; MORTON et al. 2009; GROSCHE et al. 2011) und ist auch am Ileum des Schweins beschrieben (BLIKSLAGER et al. 2002). Die genannten Arbeiten beschreiben alle ausschließlich die Expression der COX-1 und COX-2 in der Tunica mucosa und Tela submucosa. Für die Tunica muscularis und Tunica serosa liegen am Pferd keine Studien vor. In weiteren Studien am Dünn- und Dickdarm des Pferdes wurde die COX-1 und COX-2 in Mucosaproben auf Proteinebene mit Hilfe des Western Blots (TOMLINSON et al. 2004; LITTLE et al. 2007b; COOK et al. 2009a; MATYJASZEK et al. 2009; MARSHALL et al. 2011) und auf mRNA Ebene mit Hilfe der PCR (HILTON et al. 2011) nachgewiesen. Mit Hilfe des Western Blots und der PCR kann zwar ein Nachweis der COX-1 und COX-2 im Gewebe erfolgen, diese Methoden geben aber keinen Hinweis darauf, welche Zellen die COX exprimieren. Da dies für die aktuelle Studie aber von Interesse war, wurde die Immunhistochemie zur Darstellung der COX-1- und COX-2-Verteilung im Gewebe gewählt. Um falsch positive Ergebnisse auszuschließen, wurden für beide Antikörper Negativund Isotypenkontrollen durchgeführt. Sie zeigten für beide Antikörper keine Reaktionen. Zur Bestätigung der COX-1- und COX-2-Expression wurde die COX-1 und COX-2 in der Tunica muscularis auf mRNA Ebene mit Hilfe der RT-PCR erfolgreich nachgewiesen. Zusätzlich gelang für die COX-1 auch auf Proteinebene im Western Blot ein erfolgreicher Nachweis in der Tunica muscularis. Dies gelang für die COX-2 trotz mehrmaliger Versuche nicht. Eine β-Aktin spezifische Bande bei 43 kDa zeigte 151
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Diskussion<br />
erfordert (MOORE et al. 1994). Die Calprotectin-Immunhistochemie hingegen<br />
ermöglicht eine kontrastreiche Darstellung der positiven Zellen gegenüber der<br />
Umgebung <strong>und</strong> damit eine zuverlässige <strong>und</strong> einfache Auswertung der Proben. Hinzu<br />
kommt, dass es nach einem Ischämie- <strong>und</strong> Reperfusionsschaden zu einem<br />
deutlichen Anstieg von Zellen im Gewebe kommt, was einen Nachweis von<br />
einzelnen neutrophilen Granulozyten mit Hilfe der HE-Färbung schwierig macht<br />
(MOORE et al. 1994).<br />
Außerdem ist die Calprotectin-Immunhistochemie eine etablierte Methode zur<br />
Bestimmung der neutrophilen Granulozyten im Gastrointestinaltrakt (GROSCHE et<br />
al. 2008). Es gibt zwei Studien die die neutrophilen Granulozyten sowohl in der HE-<br />
Färbung als auch in der Calprotectin-Immunhistochemie quantifiziert <strong>und</strong> die<br />
Ergebnisse miteinander verglichen haben. Die eine Arbeit, welche alle<br />
Darmschichten des equinen Jejunums untersuchte, ergab das die Verteilung der<br />
Calprotectin positiven Zellen der Verteilung der neutrophilen Granulozyten in der HE-<br />
Färbung entspricht (LITTLE et al. 2005). Eine weitere Studie, die die Tunica mucosa<br />
<strong>und</strong> Tela submucosa des equinen Colon ascendens untersuchte, zeigte ebenfalls<br />
eine signifikante Korrelation in der Anzahl der neutrophilen Granulozyten in der HE-<br />
Färbung mit Calprotectin positiven Zellen in der Immunhistochemie (GROSCHE et al.<br />
2008). Nach Etablierung haben mehrere Studien die Calprotectin-Immunhistochemie<br />
zur Bestimmung der Anzahl der neutrophilen Granulozyten am equinen Darm<br />
erfolgreich angewendet (MATYJASZEK et al. 2009; GRSOCHE et al. 2011;<br />
HOPSTER-IVERSEN et al. 2011; VENTE 2011). Aus den genannten Gründen war<br />
die Calprotectin-Immunhistochemie in der aktuellen Studie für die Bestimmung der<br />
neutrophilen Granulozyten ebenfalls die Methode der Wahl.<br />
5.2.3 Cyclooxygenase-1 <strong>und</strong> Cyclooxygenase-2<br />
Die Expression der COX-1 <strong>und</strong> COX-2 in der Tunica muscularis <strong>und</strong> Tunica serosa<br />
wurde in der vorliegenden Arbeit mit Hilfe der Immunhistochemie dargestellt, da die<br />
zelluläre Verteilung der COX-1 <strong>und</strong> COX-2 positiven Zellen in der Tunica muscularis<br />
<strong>und</strong> Tunica serosa beim Pferd bis jetzt <strong>nicht</strong> beschrieben ist. Auch die Beeinflussung<br />
der Expression der beiden Enzyme in der Ring- <strong>und</strong> Längsmuskelschicht der Tunica<br />
muscularis durch selektive NSAIDs <strong>und</strong> <strong>nicht</strong> selektive NSAIDs ist beim Pferd<br />
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