Effekt selektiver und nicht selektiver nichtsteroidaler Antiphlogistika ...

Stefanie Franz
Effekt selektiver und nicht selektiver nichtsteroidaler
Antiphlogistika auf die Entzündungsreaktion von
durch Ischämie und Reperfusion geschädigtem
equinen Jejunum
Cuvillier Verlag Göttingen
Internationaler wissenschaftlicher Fachverlag

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Tierärztliche Hochschule Hannover
Effekt selektiver und nicht selektiver nichtsteroidaler
Antiphlogistika auf die Entzündungsreaktion von
durch Ischämie und Reperfusion geschädigtem
equinen Jejunum
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Stefanie Franz
Ostercappeln
Hannover 2013

Wissenschaftliche Betreuung:
1. Prof. Dr. Karsten Feige
Klinik für Pferde
2. Prof. Dr. Ralph Brehm
Anatomisches Institut
1. Gutachter: Prof. Dr. Karsten Feige
2. Gutachter: Prof. Dr. Hans-Joachim Schuberth
Tag der mündlichen Prüfung: 19.11.2013

Meiner lieben Familie

Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ............................................................................................................... 19
2 Literatur ................................................................................................................. 21
2.1 Histologischer Aufbau der Darmwand ............................................................. 21
2.2 Intestinale Ischämie und Reperfusion ............................................................. 21
2.2.1 Darmstrangulationen beim Pferd .............................................................. 22
2.2.2 Makroskopische und histologische Veränderungen ................................. 23
2.2.3 Biochemische und zelluläre Veränderungen ............................................ 23
2.2.3.1 Rolle der Neutrophilen Granulozyten ................................................. 24
2.2.3.1.1 Nachweis der neutrophilen Granulozyten ....................................... 26
2.2.3.2 Rolle der Mastzellen und Makrophagen ............................................. 27
2.2.3.3 Eosinophile Granulozyten .................................................................. 27
2.2.3.3.1 Eosinophile Granulozyten im gesunden Gastrointestinaltrakt ..... 27
2.2.3.3.2 Eosinophile Granulozyten bei intestinaler Schädigung ................ 28
2.2.3.3.3 Nachweis der eosinophilen Granulozyten ................................... 30
2.3 Postoperativer Ileus ........................................................................................ 30
2.3.1 Allgemeines und prädisponierende Faktoren ........................................... 30
2.3.2 Pathogenese ............................................................................................ 31
2.3.2.1 Inflammatorische Genese .................................................................. 32
2.3.2.1.1 Neutrophile Granulozyten ............................................................ 32
2.3.2.1.2 Makrophagen und proinflammatorische Zytokine ........................ 34
2.3.2.2 Kinetisch aktive Mediatoren ............................................................... 34
2.3.2.2.1 Stickstoffmonoxid ........................................................................ 34
2.3.2.2.2 Prostaglandine ............................................................................ 35
2.3.2.3 Hypocalcämie- und Hypomagnesiämie .............................................. 36
2.4. Die Cyclooxygenasen .................................................................................... 37
2.4.1 Allgemeines zu Cyclooxygenasen ............................................................ 37
2.4.2 Die Cyclooxygenase-1 .............................................................................. 39
2.4.2.1 Konstitutive Expression ...................................................................... 39
2.4.2.2 Induzierbarkeit ................................................................................... 41

2.4.3 Die Cyclooxygenase-2 .............................................................................. 42
2.4.3.1 Konstitutive Expression ...................................................................... 42
2.4.3.2 Induzierbarkeit ................................................................................... 43
2.4.3.3 Eigenschaften .................................................................................... 44
2.4.4 Die Produkte der Cyclooxygenasen - Prostanoide ................................... 45
2.4.4.1 Prostanoide im Gastrointestinaltrakt .................................................. 45
2.4.4.1.1 Einfluss auf die Darmbarriere ...................................................... 45
2.4.4.1.2 Einfluss auf die Darmmotilität ...................................................... 46
2.4.5 Wirkung von Cyclooxygenasehemmern ................................................... 46
2.5 Nichtsteroidale Antiphlogistika ........................................................................ 47
2.5.1 Allgemeines zu den Nichtsteroidalen Antiphlogistika ................................ 47
2.5.2 Nebenwirkungen der Cyclooxygenasehemmung im Gastrointestinaltrakt 48
2.5.2.1 Blutflussreduktion und Mucosaschäden ............................................. 48
2.5.2.2 Hemmung der Regeneration der Darmbarriere .................................. 49
2.5.2.3 Beeinflussung der Motilität des Gastrointestinaltraktes ...................... 49
2.5.3 Einsatz selektiver NSAIDs ........................................................................ 51
2.5.4 NSAIDs, Entzündungsmediatoren und neutrophile Granulozyten ............ 52
2.6 Einzelstoffe ..................................................................................................... 53
2.6.1 Flunixin-Meglumin .................................................................................... 53
2.6.1.1 Pharmakokinetik ................................................................................ 53
2.6.1.2 Beeinflussung der Mucosapermeabilität ............................................ 54
2.6.1.3 Wirkung auf die Darmkontraktilität ..................................................... 55
2.6.1.4 Einsatz bei Endotoxämie ................................................................... 56
2.6.1.5 Nebenwirkungen ................................................................................ 56
2.6.2 Firocoxib ................................................................................................... 57
2.6.2.1 Pharmakokinetik ................................................................................ 57
2.6.2.2 Anwendung im postoperativen Schmerzmanagement ....................... 57
2.6.2.3 Nebenwirkungen ................................................................................ 58
3 Material und Methoden .......................................................................................... 59
3.1 Probanden ...................................................................................................... 59
3.1.1 Vorbereitung der Pferde und Narkose ...................................................... 59

3.2 In vivo Modell .................................................................................................. 61
3.2.1 O2C-Gerät ................................................................................................ 62
3.2.2 Pulsoxymetrie ........................................................................................... 63
3.2.3 Ischämie und Reperfusion ........................................................................ 64
3.3 Histologie ........................................................................................................ 67
3.3.1 Probenverarbeitung .................................................................................. 67
3.3.2 Vorbehandlung der Schnitte für histologische Färbungen und
Immunhistochemie ............................................................................................ 68
3.3.3 Histologische Färbungen .......................................................................... 69
3.3.3.1 Hämatoxylin-Eosin Färbung ............................................................... 69
3.3.3.2 Lunafärbung ....................................................................................... 69
3.3.4 Immunhistochemie ................................................................................... 70
3.3.4.1 Calprotectin ........................................................................................ 70
3.3.4.2 Cyclooxygenase-1 ............................................................................. 71
3.3.4.3 Cyclooxygenase 2 .............................................................................. 72
3.4 Molekularbiologie ............................................................................................ 73
3.4.1 Trizolextraktion ......................................................................................... 73
3.4.2 Vorbereitung für die konventionelle PCR (mRNA-Analyse) ...................... 74
3.4.2.1 RNA Isolierung ................................................................................... 74
3.4.2.2 RNA Vermessung .............................................................................. 75
3.4.2.3 DNase Verdau ................................................................................... 75
3.4.2.4 cDNA-Synthese ................................................................................. 76
3.4.2.5 Konventionelle PCR für Cyclooxygenase-1 und -2 ............................ 76
3.4.3 Vorbereitung für den Western Blot ........................................................... 78
3.4.3.1 Proteinisolation .................................................................................. 78
3.4.3.2 SDS-Gelelektrophorese ..................................................................... 80
3.4.3.3 Western Blot für die Cyclooxygenase-1 und -2 .................................. 80
3.4.3.4 Immunodetektion ............................................................................... 80
3.5 Lichtmikroskopische Untersuchung ................................................................ 82
3.5.1 Auswertung Lunafärbung und Calprotectin-Immunhistochemie ............... 82
3.5.1.1 Tunica muscularis .............................................................................. 82

3.5.1.2 Tunica serosa .................................................................................... 84
3.5.2 Auswertung Cyclooxygenase-1 und -2 Immunhistochemie ...................... 85
3.5.2.1 Tunica muscularis und Tunica serosa ................................................ 85
4 Ergebnisse ............................................................................................................. 88
4.1 Lunafärbung .................................................................................................... 88
4.1.1 Deskription ............................................................................................... 88
4.1.2 Quantifizierung der eosinophilen Granulozyten ........................................ 90
4.1.2.1 Tunica muscularis .............................................................................. 90
4.1.2.2 Tunica serosa .................................................................................... 93
4.2 Immunhistochemie .......................................................................................... 94
4.2.1 Calprotectin .............................................................................................. 94
4.2.1.1 Deskription ......................................................................................... 94
4.2.1.1.1 Kontrolle 1 (K1) – ungeschädigtes Jejunum 1 ............................. 94
4.2.1.1.2 Ischämisch geschädigtes Jejunum (I1) ....................................... 95
4.2.1.1.3 Durch Ischämie und Reperfusion geschädigtes Jejunum (R1) .... 96
4.2.1.1.4 Kontrolle 2 (K2) – ungeschädigtes Jejunum 2 ............................. 98
4.2.1.1.5 Ischämisch geschädigtes und mit einem NSAID behandeltes
Jejunum (I2) ............................................................................................. 100
4.2.1.1.6 Durch Ischämie und Reperfusion geschädigtes und mit einem
NSAID behandeltes Jejunum (R2) ........................................................... 100
4.2.1.1.7 Kontrolle 3 (K3) – ungeschädigtes Jejunum 3 ........................... 101
4.2.1.2 Negativ- und Isotypenkontrolle ......................................................... 104
4.2.1.3 Quantifizierung der neutrophilen Granulozyten ................................ 105
4.2.1.3.1 Tunica muscularis ..................................................................... 105
4.2.1.3.2 Tunica serosa ............................................................................ 111
4.2.2 Cyclooxygenase-1 .................................................................................. 113
4.2.2.1 Deskription ....................................................................................... 113
4.2.2.1.1 Kontrolle 1 (K1) – ungeschädigtes Jejunum .............................. 113
4.2.2.1.2 Ischämisch geschädigtes Jejunum (I1) ..................................... 119
4.2.2.1.3 Durch Ischämie und Reperfusion geschädigtes Jejunum (R1) .. 121
4.2.2.2 Negativ- und Isotypenkontrolle ......................................................... 124
4.2.3 Cyclooxygenase-2 .................................................................................. 126

4.2.3.1 Deskription ....................................................................................... 126
4.2.3.1.1 ungeschädigtes Jejunum zu den Probezeitpunkten K1, K2 und K3
................................................................................................................. 126
4.2.3.1.2 Ischämisch geschädigtes Jejunum zu den Probezeitpunkten I1
und I2 ....................................................................................................... 131
4.2.3.1.3 Durch Ischämie und Reperfusion geschädigtes Jejunum zu den
Probezeitpunkten R1 und R2 ................................................................... 133
4.2.3.2 Negativ- und Isotypenkontrolle ......................................................... 135
4.2.3.3 Positivkontrolle ................................................................................. 135
4.3 RT-PCR ........................................................................................................ 138
4.4 Western Blot ................................................................................................. 138
5 Diskussion ........................................................................................................... 140
5.1 Methodik – in vivo Versuch ........................................................................... 140
5.1.1 Probanden .............................................................................................. 140
5.1.2 Versuchsaufbau...................................................................................... 142
5.1.3 Anlegen der Ischämie ............................................................................. 143
5.1.4 O2C-Gerät und Pulsoxymeter ................................................................ 144
5.1.5 Ischämie und Reperfusionslänge ........................................................... 146
5.1.6 Abstände der Proben zueinander ........................................................... 147
5.1.7 Zeitpunkt der Applikation des nichtsteroidalen Antiphlogistikums .......... 148
5.1.8 Auswahl der nichtsteroidalen Antiphlogistika .......................................... 148
5.2 Methodik - Histologische und molekularbiologische Auswertung .................. 149
5.2.1 Lunafärbung ........................................................................................... 149
5.2.2 Calprotectin-Immunhistochemie ............................................................. 149
5.2.3 Cyclooxygenase-1 und Cyclooxygenase-2 ............................................. 150
5.3 Ergebnisse .................................................................................................... 152
5.3.1 Eosinophile Granulozyten ....................................................................... 152
5.3.2 Neutrophile Granulozyten ....................................................................... 153
5.3.2.1 Allgemein ......................................................................................... 153
5.3.2.2 Vergleichende Betrachtung in der Ring- und Längsmuskelschicht .. 156
5.3.2.3 Neutrophilencluster in der Tunica muscularis und Tunica serosa .... 156
5.3.2.4 Einfluss der nichtsteroidalen Antiphlogistika .................................... 157

5.3.2.5 Klinische Relevanz ........................................................................... 159
5.3.2.5.1 Postoperativer Ileus ................................................................... 159
5.3.2.6 Versuchsaufbau ............................................................................... 160
5.3.3 Cyclooxygenase-1 .................................................................................. 160
5.3.3.1 Konstitutive Expression .................................................................... 160
5.3.3.2 Expression bei ischämischer Schädigung ........................................ 161
5.3.3.3 Expression bei Schädigung durch Reperfusion ............................... 162
5.3.3.4 Einfluss der nichtsteroidalen Antiphlogistika auf die Expression ...... 162
5.3.3.5 Expression in der Tunica muscularis ............................................... 163
5.3.3.5.1 Expression innerhalb der Muskelzellen ..................................... 163
5.3.3.6 Expression in Zellen (ausgenommen Muskelzellen) der Tunica
muscularis und Tunica serosa ..................................................................... 164
5.3.3.7 Expression in den Endothelzellen .................................................... 164
5.3.4 Cyclooxygenase-2 .................................................................................. 165
5.3.4.1 Konstitutive Expression .................................................................... 165
5.3.4.2 Expression bei ischämischer Schädigung ........................................ 166
5.3.4.3 Expression bei Schädigung durch Reperfusion ............................... 166
5.3.4.4 Einfluss der nichtsteroidalen Antiphlogistika auf die Expression ...... 167
5.3.4.5 Expression in der Tunica muscularis ............................................... 168
5.3.4.5.1 Expression innerhalb der Muskelzellen ..................................... 169
5.3.4.6 Expression in Zellen (ausgenommen Muskelzellen) der Tunica
muscularis und Tunica serosa ..................................................................... 169
5.3.4.7 Expression in den Endothelzellen .................................................... 171
5.4 Zusammenfassende Diskussion und Ausblick .............................................. 172
6 Zusammenfassung .............................................................................................. 175
7 Summary ............................................................................................................. 177
8 Literaturverzeichnis ............................................................................................. 179
9 Anhang ................................................................................................................ 204
9.1 Versuch ......................................................................................................... 204
9.1.1 Medikamente .......................................................................................... 204
9.1.2 Geräte .................................................................................................... 205
9.1.3 Verbrauchsmaterialien ............................................................................ 205

9.2 Probenbearbeitung........................................................................................ 205
9.2.1 Fixierlösung ............................................................................................ 205
9.2.2 Lösungen Hämatoxylin-Eosin-Färbung .................................................. 206
9.2.3 Lösungen Luna-Färbung ........................................................................ 206
9.2.4 Puffer und Lösungen Immunhistochemie ............................................... 207
9.2.5 Puffer und Lösungen PCR und Western Blot ......................................... 208
9.2.6 Stoffe und Reagenzien ........................................................................... 211
9.2.7 Antikörper ............................................................................................... 213
9.2.8 Geräte .................................................................................................... 214
9.2.9 Verbrauchsmaterialien ............................................................................ 215
9.3 Tabellarische Auswertungen Calprotectin ..................................................... 216
9.3.1 Probe K1 ................................................................................................ 216
9.3.2 Probe I1 .................................................................................................. 217
9.3.3 Probe R1 ................................................................................................ 218
9.3.4 Probe K2 ................................................................................................ 219
9.3.5 Probe I2 .................................................................................................. 220
9.3.6 Probe R2 ................................................................................................ 221
9.3.7 Probe K3 ................................................................................................ 222
9.4 Tabellarische Auswertung Luna .................................................................... 223
9.4.1 Probe K1 ................................................................................................ 223
9.4.2 Probe I1 .................................................................................................. 224
9.4.3 Probe R1 ................................................................................................ 225
9.4.4 Probe K2 ................................................................................................ 226
9.4.5 Probe I2 .................................................................................................. 227
9.4.6 Probe R2 ................................................................................................ 228
9.4.7 Probe K3 ................................................................................................ 229
Danksagung ........................................................................................................... 230

Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Histologischer Aufbau der Darmwand .......................................................... 21
Abb. 2: Die Arachidonsäurekaskade in Anlehnung an VANE et al. 1998 ................. 38
Abb. 3: O2C-Sonde und Pulsoxymeter ..................................................................... 61
Abb. 4: Versuchsablauf und Zeitpunkte der Probenentnahme ................................. 64
Abb. 5: Ischämie- und Reperfusionsmodell .............................................................. 65
Abb. 6: Jejunumproben zu den drei Entnahmezeitpunkten ...................................... 66
Abb. 7: Die Produkte der Trizolextraktion ................................................................. 74
Abb. 8: Tunica muscularis und Tunica serosa – schematische Darstellung der
Auswertung ............................................................................................................... 83
Abb. 9: Lunafärbung - Repräsentative Darstellung der eosinophilen Granulozyten in
der Tunica muscularis und Tunica serosa ................................................................ 89
Abb. 10: Eosinophile Granulozyten pro mm 2 in der zirkulären Muskelschicht........... 91
Abb. 11: Eosinophile Granulozyten pro mm 2 in der intermuskulären Schicht ........... 92
Abb. 12: Eosinophile Granulozyten pro mm 2 in der longitudinalen Muskelschicht .... 93
Abb. 13: Eosinophile Granulozyten pro mm 2 in der Tunica serosa ........................... 94
Abb. 14: Immunhistochemische Darstellung von Zellclustern und Zellsaum der
neutrophilen Granulozyten am equinen Jejunum ..................................................... 96
Abb. 15: Immunhistochemische Darstellung der neutrophilen Granulozyten am
equinen Jejunum in der Ring- und Längsmuskelschicht in den Reperfusionsproben 98
Abb. 16: Immunhistochemische Darstellung der neutrophilen Granulozyten am
equinen Jejunum in den ungeschädigten Jejunumproben 2 (K2) ............................. 99
Abb. 17: Immunhistochemische Darstellung der neutrophilen Granulozyten am
equinen Jejunum in den ungeschädigten Jejunumproben 3 (K3) ........................... 102
Abb. 18: Repräsentative Negativ- und Isotypenkontrolle MAC 387 (Calprotectin) .. 104
Abb. 19: Neutrophile Granulozyten pro mm 2 in der zirkulären Muskelschicht ......... 106

Abb. 20: Vergleich des Einflusses von Flunixin-Meglumin und Firocoxib auf die
Anzahl neutrophiler Granulozyten pro mm 2 in der zirkulären Muskelschicht........... 107
Abb. 21: Neutrophile Granulozyten pro mm 2 in der intermuskulären Schicht ......... 108
Abb. 22: Vergleich des Einflusses von Flunixin-Meglumin und Firocoxib auf die
Anzahl neutrophiler Granulozyten pro mm 2 in der intermuskulären Schicht ........... 109
Abb. 23: Neutrophile Granulozyten pro mm 2 in der longitudinalen Muskelschicht .. 110
Abb. 24: Vergleich des Einflusses von Flunixin-Meglumin und Firocoxib auf die
Anzahl neutrophiler Granulozyten pro mm 2 in der longitudinalen Muskelschicht .... 111
Abb. 25: Neutrophile Granulozyten pro mm 2 in der Tunica serosa ......................... 112
Abb. 26: Vergleich des Einflusses von Flunixin-Meglumin und Firocoxib auf die
Anzahl neutrophiler Granulozyten pro mm 2 in der Tunica serosa ........................... 113
Abb. 27: Immunhistochemische Darstellung der COX-1 am ungeschädigten equinen
Jejunum (K1) .......................................................................................................... 115
Abb. 28: Immunhistochemische Darstellung der COX-1 positiven perinukleären
Reaktion in den Muskelzellen der Ringmuskelschicht ............................................ 116
Abb. 29: Immunhistochemische Darstellung von COX-1 positiven Zellen vom Zelltyp
A in der Ringmuskelschicht .................................................................................... 117
Abb. 30: Immunhistochemische Darstellung von COX-1 positiven Zellen vom Zelltyp
A und B in der Längsmuskelschicht (A, B) und in der Tunica serosa (C, D) ........... 118
Abb. 31: Immunhistochemische Darstellung der COX-1-Expression in den
Endothelzellen ........................................................................................................ 119
Abb. 32: Immunhistochemische Darstellung der COX-1 am ischämisch geschädigten
equinen Jejunum (I2) .............................................................................................. 121
Abb. 33: Immunhistochemische Darstellung der COX-1 nach Ischämie und
Reperfusion des equinen Jejunums (R1) ............................................................... 123
Abb. 34: Repräsentative Negativ- und Isotypenkontrolle COX-1 ............................ 124
Abb. 35: Immunhistochemische Darstellung der COX-2 am ungeschädigten equinen
Jejunum im Zeitverlauf (K1, K2, K3) ....................................................................... 128
Abb. 36: Immunhistochemische Darstellung der COX-2 im Bereich der
Endothelzellen ........................................................................................................ 129

Abb. 37: Immunhistochemische Darstellung von COX-2 positiven Zellen in der
Ringmuskelschicht (A, B) und der Tunica serosa (C, D) ........................................ 130
Abb. 38: Immunhistochemische Darstellung der COX-2 positiven perinukleären
Reaktion in den Muskelzellen der Längsmuskelschicht .......................................... 131
Abb. 39: Immunhistochemische Darstellung der COX-2 am ischämisch geschädigten
Jejunum und Behandlung mit einem NSAID (R2) ................................................... 133
Abb. 40: Immunhistochemische Darstellung der COX-2 nach Ischämie und
Reperfusion des equinen Jejunums und Behandlung mit einem NSAID (R2) ........ 135
Abb. 41: Repräsentative Negativ- und Isotypenkontrolle COX-2 sowie Positivkontrolle
COX-2 .................................................................................................................... 136
Abb. 42: Qualitativer Nachweis von COX-1 und COX-2 mRNA in der Tunica
muscularis des equinen Jejunums mittels RT-PCR ................................................ 138
Abb. 43: Qualitativer Nachweis von COX-1 und COX-2 in der Tunica muscularis des
equinen Jejunums mittels Western Blot .................................................................. 139

Tabellen
Tabelle 1: Übersicht der verwendeten Primärantikörper in der IHC .......................... 73
Tabelle 2: Übersicht über die in der RT-PCR verwendeten Primer .......................... 77
Tabelle 3: Übersicht über die verwendeten Primärantikörper im Western Blot ......... 82

Abkürzungsverzeichnis
bp
BSA
COX
cDNA
DNA
EDTA
ER
et al.
G
Hb
HE
HUVEC
KGW
LPS
mRNA
NSAID
PCR
PBS
Basenpaare
bovines Serumalbumin
Cyclooxygenase
komplementäre Desoxyribonukleinsäure
Desoxyribonukleinsäure
Ethylendiamintetraacetat
Endoplasmatisches Retikulum
und andere
Gauge
Hämoglobin
Hämatoxylin-Eosin
human umbilical vein endothelial cells
Körpergewicht
Lipopolysaccharide
messenger Ribonukleinsäure / Boten Ribonukleinsäure
nichtsteroidales Antiphlogistikum
polymerase chain reaction / Polymerasekettenreaktion
phosphat buffered saline / Phosphat gepufferter Kochsalzlösung
PGE 2 Prostaglandin E 2
PGF 2α
Prostaglandin F 2α
PGI 2 Prostaglandin I 2
POI
RNA
RT
RT-PCR
postoperativer Ileus
Ribonukleinsäure
Raumtemperatur
Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion

SDS
TEER
Sodiumdodecylsulfat
transepithelialer Widerstand
TXA 2 Thromboxan A 2
VE-Wasser vollentsalztes Wasser

Einleitung
1 Einleitung
Kolik ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität beim Pferd (KANEENE
et al. 1997; TINKER et al. 1997). Im Anschluss an eine Kolikoperation zählt der
postoperative Ileus (POI) zu den häufigsten Komplikationen (MAIR u. SMITH 2005b).
Studien am Dünndarm des Menschen und der Ratte haben gezeigt, dass eine
Manipulation des Darms zu einer Leukozyteninfiltration in die glatte Muskulatur führt,
die mit einem Abfall der in vitro Kontraktilität einhergeht (KALFF et al. 1998a, 1999,
2003; SCHWARZ et al. 2004). Die Leukozyteninfiltration konnte durch die Gabe von
Dexamethason gehemmt werden (SCHWARZ et al. 2004). Nach Verabreichung
eines nicht selektiven nichtsteroidalen Antiphlogistikums (NSAID) wurde ein
signifikanter Anstieg und bei der Gabe verschiedener selektiver NSAIDs eine
signifikante Reduktion, bzw. kein Effekt auf die Kontraktilität der zirkulären
Muskelschicht der Tunica muscularis festgestellt (SCHWARZ et al. 2001).
Beim Pferd gibt es bisher nur wenige Studien, die sich mit der Entzündungsreaktion
in der Tunica muscularis des durch Ischämie und Reperfusion geschädigten equinen
Jejunums beschäftigt haben (LITTLE et al. 2005; VENTE 2011). Es liegen bisher
keine Studien vor, die die Wirkung von NSAIDs auf die Entzündungsreaktion der
Tunica muscularis externa untersucht haben. In Ischämie-Reperfusionsstudien an
der Tunica mucosa des equinen Jejunum zeigte sich bei den mit Flunixin-Meglumin
behandelten Probanden eine Hemmung der Regeneration der Darmbarriere
(CAMPBELL u. BLIKSLAGER 2000; TOMLINSON et al. 2004; TOMLINSON u.
BLIKSLAGER 2005; COOK et al. 2009a). Daher schlagen mehrere Studien für die
Koliktherapie des Pferdes einen Wechsel von Flunixin-Meglumin zu einem selektiven
NSAID vor.
Am equinen Jejunum ist bisher keine Motilitätsstudie bekannt, die einen
Zusammenhang zwischen Motilität und NSAIDs untersucht hat. Eine negative
Beeinflussung der Dünndarmmotorik durch selektive NSAIDs könnte für den
klinischen Verlauf des Kolikers aber eine größere Bedeutung haben als ihr positiver
Effekt auf die Regeneration geschädigter Schleimhaut. Deswegen ist das Ziel dieser
19

Einleitung
Arbeit die Charakterisierung der Entzündungsreaktion in der Tunica muscularis und
Tunica serosa des ischämisch geschädigten equinen Jejunums unter dem Einfluss
des selektiven NSAIDs Firocoxib und des nicht selektiven NSAIDs Flunixin-
Meglumin. Dazu wurden in einem ersten Versuchsabschnitt von zwölf Pferden
Jejunumproben von ungeschädigtem, ischämisch geschädigtem und durch Ischämie
und Reperfusion geschädigtem Jejunum entnommen. Im zweiten Versuchsabschnitt
wurde dasselbe Schädigungsmodell an einem ein Meter entfernten Jejunumabschnitt
durchgeführt. Der Unterschied bestand darin, dass die randomisierten Pferde
während der Ischämie intravenös das nicht selektive NSAID Flunixin-Meglumin bzw.
das selektive NSAID Firocoxib erhielten. Die Probenentnahme erfolgte zu denselben
Zeitpunkten wie im ersten Versuchsabschnitt. Die anschließende Beurteilung von
Tunica muscularis und Tunica serosa der histologisch und immunhistologisch
aufbereiteten Proben umfasste die Lunafärbung zur Darstellung der eosinophilen
Granulozyten, die Calprotectin-Immunhistochemie zur Darstellung der neutrophilen
Granulozyten sowie eine Immunhistochemie zur Darstellung der Cyclooxygenase-1
und Cyclooxygenase-2.
In Kombination mit einer angeschlossenen Kontraktilitätsstudie soll zudem überprüft
werden, ob ein Zusammenhang zwischen der Neutrophilenrekrutierung, der
Behandlung mit einem NSAID und der Dünndarmkontraktilität besteht.
20

Literatur
2 Literatur
2.1 Histologischer Aufbau der Darmwand
Die Darmwand gliedert sich von innen nach außen in die Tunica mucosa
(Schleimhautschicht), die Tela submucosa (Unterschleimhautgewebe) sowie die
Tunica muscularis (Muskelschicht) mit dem Stratum circulare (Ringmuskelschicht)
und dem Stratum longitudinale (Längsmuskelschicht). Daran schließt sich die Tunica
serosa (Serosaschicht) mit der bindegewebigen Lamina propria serosae und dem
oberflächlichen einschichtigen Plattenepithel, dem Mesothelium serosae, an (Abb. 1)
(KÖNIG et al. 1999; LIEBICH 2010).
Tunica mucosa
Tela submucosa
Stratum circulare
Intermuskuläre Schicht
Tunica
muscularis
Stratum longitudinale
Lamina propria serosae
Mesothelium serosae
In Anlehnung an: Caren‐Imme von Stemm
Anatomisches Institut, Tierärztliche Hochschule Hannover
Tunica serosa
Abb. 1: Histologischer Aufbau der Darmwand
2.2 Intestinale Ischämie und Reperfusion
Es werden zunächst die Ursachen sowie die makroskopischen und histologischen
Veränderungen, die bei Ischämie und Reperfusion am equinen Darm entstehen,
21

Literatur
erläutert. Danach wird auf die biochemischen Abläufe und die beteiligten Zellen
eingegangen.
2.2.1 Darmstrangulationen beim Pferd
Eine häufige Ursache der akuten Kolik beim Pferd sind strangulierende Dünn- und
Dickdarmverlegungen (MAIR u. SMITH 2005a). Bei einer Strangulation kommt es
sowohl zum Verschluss des Darmlumens, als auch der zu- und abführenden
Blutgefäße (BLIKSLAGER 2008). Am Dünndarm wird die Strangulation am
häufigsten von einem Lipom, einem Volvulus oder einer Inkarzeration des Darms in
verschiedene abdominale Strukturen hervorgerufen, wohingegen am Dickdarm der
Colonvolvulus die Hauptursache einer Strangulation ist (MAIR u. SMITH 2005a). Es
können zwei Arten der Strangulationen unterschieden werden. Zum einen kann es
bei einer Strangulation zu einem unvollständigen Verschluss der zu- und
abführenden Blutgefäße kommen, was zu einer relativen (warmen) Ischämie führt
(MEURER u. WOLF 2007). In der Regel erfolgt zunächst ein Verschluss des
venösen Gefäßsystems, da die Venenwand dünner als die Arterienwand ist
(BLIKSLAGER 2008). Da der arterielle Zufluss länger als der venöse Abfluss
erhalten bleibt, kommt es zu einer hämorrhagischen Infarzierung des Darms. Diese
Art der Strangulation wird auch als hämorrhagische Strangulation bezeichnet
(SNYDER 1989; BLIKSLAGER 2008). Bei einem gleichzeitigen vollständigen
Verschluss der zu- und abführenden Gefäße kommt es zu einer vollständigen
(kalten) Ischämie des Gewebes. Diese Art der Strangulation wird als ischämische
Strangulation bezeichnet (SNYDER 1989; BLIKSLAGER 2008).
Es gibt Hinweise, dass es bei der partiellen (warmen) Ischämie zu einer stärkeren
Schädigung in der Phase der Reperfusion kommt, als bei einer totalen (kalten)
Ischämie (PARK et al. 1990). So konnten am Darm der Ratte bei einer totalen
Ischämie mit steigender Ischämiezeit zwar Schäden an den Mikrovilli beobachtet
werden, es kam aber zu keiner Zunahme des Schadens während der Reperfusion
(PARK et al. 1990). Bei der partiellen Ischämie hingegen konnte eine signifikante
Verschlechterung des Mucosaschadens in der Phase der Reperfusion beobachtet
werden (PARK et al. 1990).
22

Literatur
2.2.2 Makroskopische und histologische Veränderungen
Makroskopisch kommt es bei der partiellen Ischämie am equinen Dünn- und
Dickdarm zu einer dunkelroten bis schwarzen Verfärbung der Serosa sowie zu einer
Ödematisierung und Verdickung der Darmwand (SNYDER et al. 1988; PRICHARD et
al. 1991; VATISTAS et al. 1998; MATYJASZEK et al. 2009; MORTON et al. 2009).
Im Jejunum konnte außerdem eine Distension des betroffenen Segmentes
beobachtet werden (VATISTAS et al. 1998). Bei einer vollständigen Ischämie
verfärbt sich die Serosa blaugrau (SNYDER et al. 1988).
In der histologischen Untersuchung fallen ein deutlicher Epithelzellverlust, eine
Atrophie der Villi mit subepithelialen Flüssigkeitsansammlungen sowie Ödeme in der
Tunica mucosa und Tela submucosa auf (VATISTAS et al. 1998; CAMPBELL u.
BLIKSLAGER 2000; TOMLINSON et al. 2004; LITTLE et al. 2007b; COOK et al.
2009a; GROSCHE et al. 2011; HILTON et al. 2011).
Während der anschließenden Reperfusion kommt es am equinen Jejunum zu einem
weiteren Epithelzellverlust und einer stärkeren Reduktion der Endothelzellintegrität in
der Tela submucosa sowie zu einer zunehmenden Ödembildung und Extravasation
von Erythrozyten im Vergleich zu den Ischämieproben (VATISTAS et al. 1998). Am
equinen Colon wurden durch Reperfusion eine Vergrößerung der parazellulären
Räume und große subepitheliale Spalten (GROSCHE et al. 2011) sowie eine
Abnahme der Epithelhöhe festgestellt (MORTON et al. 2009). Bereits nach einer
Stunde Reperfusion konnte eine Reepithelisierung und ein Verschluss der
subepithelialen Lücken durch eine kontinuierliche Schicht von Epithelzellen
beobachtet werden (GROSCHE et al. 2011). Auch nach einer 18-stündigen
Reperfusion am equinen Jejunum kam es zu einer Reepithelisierung (TOMLINSON
et al. 2004).
2.2.3 Biochemische und zelluläre Veränderungen
Während der Ischämie wird das Enzym Xanthindehydrogenase zur Xanthinoxidase
umgewandelt (PARKS et al. 1988; PRICHARD et al. 1991). Gleichzeitig fällt eine
Akkumulation des Substrates Hypoxanthin an, da die Xanthinoxidase Sauerstoff zur
Umwandlung von Hypoxanthin benötigt, welcher während der Ischämie aber nicht
23

Literatur
zur Verfügung steht (ARNDT et al. 1991; COLLARD u. GELMAN 2001). Während
der Reperfusion kommt es durch den wieder zur Verfügung stehenden Sauerstoff zu
einem schnellen Abbau des Hypoxanthins durch die Xanthinoxidase, wobei als
Nebenprodukte die reaktiven Sauerstoffmetaboliten, Superoxid (O - 2) sowie
Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ) und beim Vorhandensein von Eisen auch
Hydroxylradikale (OH) entstehen (ARNDT et al. 1991; COLLARD u. GELMAN 2001).
Am Dünndarm der Katze konnte mit Beginn der Reperfusion dieser abrupte Anstieg
der Radikalbildung nachvollzogen werden. Ein Teil dieser Radikale wurden von der
Xanthinoxidase, ein weiterer Teil von den neutrophilen Granulozyten gebildet, beim
dritten Teil war der Ursprung unklar (NILSSON et al. 1994). Dass sowohl die von der
Xanthinoxidase induzierte Kaskade als auch die neutrophilen Granulozyten zum
Ischämie-Reperfusionsschaden beitragen, zeigt die Studie von NILSSON et al.
(1994). Sowohl bei Gabe des Xanthinoxidasehemmers Allopurinol als auch bei Gabe
eines monoklonalen Antikörpers gegen neutrophile Granulozyten konnte eine
Verbesserung der morphologischen und biochemischen Parameter festgestellt
werden (NILSSON et al. 1994). Die Ergebnisse der Studie von GRISHAM et al.
(1986) deuten außerdem daraufhin, dass Ischämie und Reperfusion zu einer von der
Xanthinoxidase induzierten superoxidabhängigen Akkumulation von neutrophilen
Granulozyten in der Tunica mucosa führen und es zu einer Bildung von reaktiven
Sauerstoffmetaboliten durch die neutrophilen Granulozyten kommt, die wiederum zu
einer Steigerung des intestinalen Schadens führen.
2.2.3.1 Rolle der Neutrophilen Granulozyten
Eine wichtige Rolle in der Entstehung eines Reperfusionsschadens scheinen die
neutrophilen Granulozyten einzunehmen. Es gibt mehrere Studien, die die Folgen
von Ischämie und Reperfusion am Dünn- und Dickdarm in Bezug auf neutrophile
Granulozyten untersucht haben.
Verschiedene Studien zeigen, dass die Dauer der Ischämie eine wesentliche Rolle
bei der Infiltration des equinen Jejunums mit neutrophilen Granulozyten spielt. So
konnten LITTLE et al. (2005) nach einstündiger Ischämie und VENTE (2011) nach
90-minütiger Ischämie keinen Anstieg der neutrophilen Granulozyten im Vergleich zu
den Kontrollproben feststellen. Nach einer zweistündigen Ischämie hingegen konnte
24

Literatur
ein geringer Anstieg von neutrophilen Granulozyten in der Tunica mucosa des
equinen Jejunums festgestellt werden (VATISTAS et al. 1998; TOMLINSON et al.
2004), dort vor allem in den Darmzotten (VATISTAS et al. 1998). Andere
Untersuchungen der Tunica mucosa des Jejunums bzw. der gesamten Jejunumwand
beobachteten nach einer zweistündigen Ischämie eine signifikante Zunahme der
neutrophilen Granulozyten, verglichen mit den ungeschädigten Kontrollproben
(LITTLE et al. 2005, 2007b). GROSCHE et al. (2012) untersuchten außerdem die
Aktivierung der Leukozyten während der Ischämie mit Hilfe der
Nitrotyrosinbestimmung in den Zellen. In der Tunica mucosa und Tela submucosa
des ischämisch geschädigten equinen Colons konnte eine Aktivierung der
Leukozyten, gemessen an der steigenden Nitrotyrosinproduktion der Zellen,
festgestellt werden. Dieser Anstieg nahm mit zunehmender Ischämiezeit ab.
Außerdem konnte eine unterschiedlich starke Verteilung der neutrophilen
Granulozyten in den einzelnen Schichten der Jejunumwand beobachtet werden
(LITTLE et al. 2005). Sowohl in den ungeschädigten Kontrollproben als auch nach
ein und zwei Stunden Ischämie waren die meisten neutrophilen Granulozyten in der
Tunica serosa und der longitudinalen Schicht der Tunica muscularis im Vergleich mit
den anderen Schichten vorhanden (LITTLE et al. 2005). Im Vergleich der beiden
Muskelschichten enthielt die Längsmuskelschicht signifikant mehr neutrophile
Granulozyten als die Ringmuskelschicht (LITTLE et al. 2005). Dabei befanden sich
die neutrophilen Granulozyten in beiden Muskelschichten vor allem im interstitiellen
Bindegewebe. Zwischen den aneinander liegenden glatten Muskelzellen befanden
sich nur sehr wenige neutrophile Granulozyten (LITTLE et al. 2005). In der Tunica
serosa befanden sich die meisten Zellen am mesothelialen Rand (LITTLE et al.
2005).
Während der Reperfusion kommt es zu einem signifikanten Anstieg der neutrophilen
Granulozyten im Vergleich zu den Ischämieproben (GRISHAM et al. 1986;
GROSCHE et al. 2008; VENTE 2011). Dabei kann bereits zu Reperfusionsbeginn
eine signifikante Migration der neutrophilen Granulozyten in die Tunica mucosa und
Tela submucosa des equinen Jejunums und Colons beobachtet werden (MOORE et
al. 1994; VENTE 2011). Die neutrophilen Granulozyten migrieren in die Tela
25

Literatur
submucosa, zum Mucosaepithel und in das intestinale Lumen (GROSCHE et al.
2011). Wobei sich bereits nach 30-minütiger Reperfusion die meisten neutrophilen
Granulozyten im intestinalen Lumen im Vergleich mit den zur Tela submucosa
orientierten Mucosaschichten befanden (GROSCHE et al. 2008). Auch nach 18
Stunden Reperfusion war die Anzahl der migrierten neutrophilen Granulozyten in der
Tunica mucosa im Vergleich zu den Ischämieproben signifikant erhöht (TOMLINSON
et al. 2004; MATYJASZEK et al. 2009). VENTE (2011) beschreibt in der Tunica
muscularis und Tunica serosa außerdem traubenförmige Ansammlungen von
neutrophilen Granulozyten, die sich von der zellulären Infiltration der Umgebung
deutlich abhoben. Die Bedeutung der als Zellcluster bezeichneten
Zellansammlungen ist unbekannt. Möglicherweise sind sie auf hämodynamische
Ursachen zurückzuführen, da sie vor allem während der Reperfusion auftraten und
sich häufig in der Nähe von Gefäßanschnitten befanden (VENTE 2011). Zusätzlich
konnte gezeigt werden, dass die Aktivität der Leukozyten in der Tunica mucosa und
Tela submucosa des equinen Colons durch Reperfusion zunimmt. So kam es zu
einer Steigerung der Nitrotyrosinproduktion in den Reperfusionsproben im Vergleich
mit den Kontrollproben, wobei nach 30-minütiger Reperfusion lediglich eine geringe
Zunahme festgestellt werden konnte und es nach 18-stündiger Reperfusion zu einem
signifikanten Anstieg der Nitrotyrosinproduktion kam (GROSCHE et al. 2012).
2.2.3.1.1 Nachweis der neutrophilen Granulozyten
Zur Bestimmung der neutrophilen Granulozyten im Gastrointestinaltrakt ist der
immunhistochemische Nachweis von Calprotectin eine etablierte Methode
(GROSCHE et al. 2008). Calprotectin ist auch unter den Namen Calgranulin, L-1
Protein oder MRP-8/14 bekannt (JOHNE et al. 1997) und macht ungefähr 30 - 50 %
des Gesamtproteins im Zytosol der neutrophilen Granulozyten aus (SØRENSEN u.
BORREGAARD 1999; YUI et al. 2003). Die neutrophilen Granulozyten sind die
Hauptproduzenten des Calprotectins (YUI et al. 2003). Zusätzlich wird es in
Makrophagen exprimiert, wobei der Gehalt in den Makrophagen wesentlich geringer
ist und eine Expression nur während der akuten Entzündung stattfindet. Auch in
Monozyten findet im Rahmen einer akuten Entzündung eine Calprotectinexpression
statt, in Lymphozyten kommt es in der Regel nicht vor (YUI et al. 2003).
26

Literatur
Studien am equinen Jejunum und Colon belegen, dass es eine signifikante
Korrelation in der Anzahl der mit der Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE-Färbung)
angefärbten neutrophilen Granulozyten und den Calprotectin positiven Zellen gibt
(LITTLE et al. 2005; GROSCHE et al. 2008). Die immunhistochemische Darstellung
von Calprotectin erlaubt eine gute Differenzierung von positiven Zellen gegenüber
der Umgebung und damit eine objektive und präzise Beurteilung von Verteilung und
Akkumulation der Zellen. Sie bietet damit Vorteile gegenüber der konventionellen
Darstellung der neutrophilen Granulozyten mit der HE-Färbung. In der HE-Färbung
ist die Zelldifferenzierung schwierig und sehr subjektiv, vor allem nach einem
Ischämie- und Reperfusionsschaden, der zu einem deutlichen Anstieg von Zellen im
Gewebe führt (MOORE et al. 1994).
2.2.3.2 Rolle der Mastzellen und Makrophagen
Am Dickdarm des Pferdes konnte bei Schädigung durch Ischämie und Reperfusion
eine Aktivierung der Mastzellen und Makrophagen festgestellt werden, wobei sich die
Anzahl der Zellen nicht verändert. So wurde bei den Mastzellen eine abnehmende
Anzahl an zytoplasmatischer Granula beobachtet, die als Degranulation und
Freisetzung von proinflammatorischen Molekülen ins Interstitium interpretiert werden
kann. Die Makrophagen enthielten große phagozytische, zytoplasmatische Vakuolen
mit Zelldebris und apoptotischen Zellen. Diese Daten liefern Hinweise auf eine
phagozytische Aktivität der Makrophagen während der Ischämie und Reperfusion
(GROSCHE et al. 2011).
2.2.3.3 Eosinophile Granulozyten
2.2.3.3.1 Eosinophile Granulozyten im gesunden Gastrointestinaltrakt
Die eosinophilen Granulozyten sind überwiegend gewebsständige Zellen, nur wenige
zirkulieren im Blut (STRAUMANN u. SIMON 2004). Eine Studie, die Proben von
humanen, nicht erkrankten Organen untersuchte, hat gezeigt, dass sich die
eosinophilen Granulozyten, mit Ausnahme des hämatopoetischen und lymphatischen
Gewebes, ausschließlich in der Tunica mucosa des Gastrointestinaltraktes befinden
(KATO et al. 1998). Die Verteilung der eosinophilen Granulozyten innerhalb des
Gastrointestinaltraktes ist dabei nicht homogen. So wurde im gesunden Darm von
Kindern die höchste Dichte an eosinophilen Granulozyten im Caecum und im
27

Literatur
Wurmfortsatz beobachtet, wohingegen im Magen und distalen Abschnitt des
Dickdarms nur wenige Zellen festgestellt wurden (LOWICHIK u. WEINBERG 1996).
Die Ergebnisse der Studie stimmen mit Befunden überein, die am nicht erkrankten
Gastrointestinaltrakt des Pferdes erhoben wurden. Auch dort ist die Verteilung der
eosinophilen Granulozyten inhomogen, mit der geringsten Dichte im Magen und der
höchsten Dichte im Caecum (RÖTTING et al. 2008a). Vom Magen nimmt die Anzahl
der eosinophilen Granulozyten bis zum Caecum schrittweise zu und danach wieder
ab (RÖTTING et al. 2008a). Im Dickdarm (Caecum und Colon ascendens) befanden
sich mehr eosinophile Granulozyten als im Duodenum und Jejunum (RÖTTING et al.
2008a).
Die Verteilung innerhalb der Darmwand ist ebenfalls inhomogen. So haben zwei
Studien am equinen Jejunum und Colon gezeigt, dass sich die eosinophilen
Granulozyten fast ausschließlich in der Tunica mucosa und Tela submucosa
befinden und dort ausschließlich in dem Bereich, welcher der Lamina muscularis
mucosae anliegt (SULLINS et al. 1985; HOPSTER-IVERSEN et al. 2011; VENTE
2011). Bei differenzierter Betrachtung der Tunica mucosa fällt außerdem auf, dass
sich mehr als 80 % der eosinophilen Granulozyten in der basalen Schicht und keine
Zellen in der luminalen Zone der Tunica mucosa befinden (RÖTTING et al. 2003;
RÖTTING et al. 2008a). In der Tunica muscularis und Tunica serosa wurden sie nur
vereinzelt beobachtet (HOPSTER-IVERSEN et al. 2011; VENTE 2011).
2.2.3.3.2 Eosinophile Granulozyten bei intestinaler Schädigung
Bei Schädigung des Darms durch Ischämie und Reperfusion sowie bei mechanischer
oder chemischer Reizung kommt es vor allem zu einer Migration und Aktivierung der
eosinophilen Granulozyten, aber nicht immer zu einer deutlichen Änderung der
Zellanzahl. So konnte am equinen Colon nach ein- und zweistündiger Ischämie in
der Tunica mucosa kein Anstieg der eosinophilen Granulozyten festgestellt werden
(GROSCHE et al. 2011; GROSCHE et al. 2012). Bei einer Ischämielänge von
mindestens 3,25 Stunden hingegen konnte ein Anstieg der eosinophilen
Granulozyten in der Tunica mucosa des equinen Colons festgestellt werden, so dass
die Dauer der Ischämie eventuell einen Einfluss auf eine Zunahme der eosinophilen
Granulozyten hat (MOORE et al. 1994). Bei differenzierter Betrachtung der einzelnen
28

Literatur
Darmschichten des equinen Jejunums stellte VENTE (2011) in der Tunica mucosa,
Tela submucosa und Tunica muscularis nach Ischämie und Reperfusion keine
Unterschiede in der Anzahl der eosinophilen Granulozyten fest. Demgegenüber kam
es in der Tunica serosa zu einem signifikanten Anstieg der eosinophilen
Granulozyten im Vergleich mit den Kontrollproben (VENTE 2011). Bei Laparotomie
und mechanischer Manipulation des equinen Jejunums konnte hingegen ein Anstieg
der eosinophilen Granulozyten in der Colonmucosa beobachtet werden (HOPSTER-
IVERSEN et al. 2011). Die Aktivität der eosinophilen Granulozyten, gemessen an der
Nitrotyrosinproduktion, nahm während ein- und zweistüngiger Ischämie signifikant
zu. Während der sich anschließenden 30-minütigen Reperfusion konnte eine
Aufrechterhaltung dieser Aktivität festgestellt werden, wobei die Produktion nach 18-
stündiger Reperfusion signifikant abnahm (GROSCHE et al. 2012).
Zusätzlich konnten zwei Studien bei verschiedenartiger Schädigung des equinen
Colons eine Migration der eosinophilen Granulozyten in der Tunica mucosa
feststellen. In der einen Studie wurde die Tunica mucosa des dorsalen Colons in
hypochloriger Säure inkubiert. Dies führte zu einer progressiven Migration der
eosinophilen Granulozyten in die oberflächliche Schicht der Tunica mucosa und nach
30 Minuten zusätzlich zu einem signifikanten Anstieg an der Mucosaoberfläche bzw.
im intestinalen Lumen mit Akkumulation der eosinophilen Granulozyten (RÖTTING et
al. 2003). In der anderen Studie konnte bei mechanischer Manipulation der
Colonserosa eine Umverteilung der eosinophilen Granulozyten zum intestinalen
Lumen hin festgestellt werden (HOPSTER-IVERSEN et al. 2011).
Bei Pferden mit intestinaler Schädigung durch Larven der kleinen Strongyliden
konnte im Caecum und Colon eine positive Korrelation zwischen der Anzahl der
eosinophilen Granulozyten und der Hauptbelastung mit Würmern und Larven
festgestellt werden (COLLOBERT-LAUGIER et al. 2002). In einer anderen Studie
hingegen gab es hinsichtlich der eosinophilen Granulozyten keine Unterschiede in
den Dickdarmproben von normal aufgestallten Pferden, Pferden aus einer
parasitenfreien Umgebung und experimentell mit Strongylus vulgaris infizierten
Probanden. In der experimentell infizierten Gruppe konnten auch keine Unterschiede
29

Literatur
zwischen den mit einem Anthelmintikum behandelten und den unbehandelten
Probanden festgestellt werden (RÖTTING et al. 2008b).
2.2.3.3.3 Nachweis der eosinophilen Granulozyten
Die eosinophilen Granulozyten können mit Hilfe der für sie spezifischen Lunafärbung
nachgewiesen werden. Bei der Lunafärbung färbt sich die eosinophile Granula rot,
die Erythrozyten orange und die Kernelemente blau (LUNA 1992), so dass sich die
eosinophilen Granulozyten sehr gut von der Umgebung differenzieren lassen. Dieses
erlaubt eine präzise sowie objektive Darstellung von Verteilung und Akkumulation der
eosinophilen Granulozyten, die sich in vorherigen Studien (RÖTTING et al. 2008a, b;
HOPSTER-IVERSEN et al. 2011; VENTE 2011) bewährt hat.
2.3 Postoperativer Ileus
2.3.1 Allgemeines und prädisponierende Faktoren
Unter einem Ileus versteht man die Minderung des aboralen Transportes von
gastrointestinalem Inhalt aufgrund einer mechanischen Behinderung oder
funktionellen Störung (RAKESTRAW 2002). Beim POI handelt es sich um eine
funktionelle Störung der gastrointestinalen Passage (RAKESTRAW 2002). Von
einem POI spricht man beim Pferd ab einem Refluxvolumen von > 20 Litern in den
ersten 24 Stunden nach der Kolikoperation oder bei einem Refluxvolumen von > 8
Liter bei der Kontrolle der Nasenschlundsonde nach der Kolikoperation (ROUSSEL
et al. 2001; COHEN et al. 2004; TORFS et al. 2009).
Der POI ist beim Pferd nach medianer Laparotomie und Darmmanipulation
beschrieben (GERRING u. HUNT 1986; GARCIA-LOPEZ et al. 2001; DELESALLE et
al. 2005) und ist eine der häufigsten Komplikationen nach einer Kolikoperation
(BLIKSLAGER et al. 1994; PROUDMAN et al. 2002; MAIR u. SMITH 2005b). Dabei
entwickeln Pferde mit einer Obstruktion bzw. Strangulation des Dünndarms
signifikant häufiger einen POI als Pferde mit Colonobstruktion bzw. -strangulation
(ROUSSEL et al. 2001; MAIR u. SMITH 2005b). FREEMAN et al. (2000)
beobachteten ausschließlich bei strangulierenden Dünndarmverschlüssen einen POI.
Ein dreifach erhöhtes POI Risiko nach Strangulation durch gestielte Lipoma
pendulans gegenüber anderen Dünndarmverschlüssen ist von FRENCH et al. (2002)
30

Literatur
beschrieben. In mehreren Studien hat sich gezeigt, dass es weitere
prädisponierende Faktoren gibt, die das Risiko der Entwicklung eines POI erhöhen.
Dazu zählt ein erhöhter Hämatokrit bei Vorstellung des kolikenden Pferdes
(BLIKSLAGER et al. 1994; ROUSSEL et al. 2001; FRENCH et al. 2002; COHEN et
al. 2004), eine Anästhesiedauer von über 2,5 Stunden bzw. eine Chirurgiedauer von
über 2 (ROUSSEL et al. 2001) bzw. 3 Stunden (COHEN et al. 2004) und eine Läsion
des Dünndarms (BLIKSLAGER et al. 1994; ROUSSEL et al. 2001; COHEN et al.
2004). Der POI tritt meist in den ersten Tagen nach der Kolikoperation auf
(PROUDMAN et al. 2002), im Durchschnitt 13 Stunden (0,5 +/- 120 Stunden) nach
der Operation, mit einer Dauer von einem Tag (1+/- 7 Tage) (BLIKSLAGER et al.
1994). Klinisch fallen die Pferde beim POI durch Tachykardie, abdominale
Schmerzen, Reflux, Hämokonzentration, Ausbleiben der Darmgeräusche und
fehlendem Kotabsatz auf (ROUSSEL et al. 2001; LITTLE et al. 2005).
Die kurzfristige Überlebensrate ist bei Pferden, die einen POI entwickeln, signifikant
niedriger als bei Pferden, die keinen entwickeln (MAIR u. SMITH 2005b). Die
Angaben zur Mortalität von Pferden, die einen POI entwickeln, sind in verschiedenen
Studien unterschiedlich. Sie liegt bei 9 % (FREEMAN et al. 2000), 13 %
(BLIKSLAGER et al. 1994), 30 % (PROUDMAN et al. 2002), 37,5 % (MORTON u.
BLIKSLAGER et al. 2002) und 42,9 % (HUNT et al. 1986) von allen Pferden die eine
POI entwickelten.
2.3.2 Pathogenese
Beim Pferd werden verschiedene Ursachen im Zusammenhang mit dem POI
diskutiert. Dazu gehören Entzündungen des Gastrointestinaltraktes, Peritonitis,
Endotoxämie, Elektrolytimbalancen und Hypoalbuminämie (KING u. GERRING 1991;
BLIKSLAGER et al. 1994; ROUSSEL et al. 2001; Nieto et al. 2002).
BOECKXSTAENS und DE JONGE (2009) beschreiben eine zeitliche Einteilung des
POI in eine frühe und eine späte Phase. Die frühe Phase des POI beschränkt sich
auf die ersten drei Stunden nach dem chirurgischen Eingriff und scheint durch
neurogene Reflexe vermittelt zu werden, die während oder direkt nach dem
chirurgischen Eingriff aktiviert werden. Es ist die Beteiligung verschiedener
neurogener Mechanismen beschrieben. Der Sympathikus scheint eine Rolle zu
31

Literatur
spielen, da der Abbau von adrenergen Nerven die Unterbrechung der normalen
gastrointestinalen Motiltiät verhindert (PLOURDE et al. 1993; ZITTLE et al. 1994).
Weitere Studien deuten außerdem auf eine vagale Beteiligung hin (ZITTEL et al.
1993; BOECKXSTAENS et al. 1999). Dass die Abominalchirurgie bei der Ratte zu
einer Aktivierung von spezifischen Neuronen im Hypothalamus, in der Medulla und
dem Pons führt, liefert außerdem Hinweise auf eine Beteiligung zentraler
Mechanismen bei der Entstehung des POI (BONAZ et al. 1994). Zusätzlich scheint
die Aktivierung des Corticotrophin-Releasing Faktors eine Rolle zu spielen. Die
Autoren hypothesieren, dass der Corticotrophin-Releasing Faktor Neurone im
Nucleus supraopticus des Hypothalamus aktiviert, die wiederum Signale zu
sympathischen, präganglionären Neuronen im Rückenmark senden, deren
Aktivierung zu einer Hemmung der gastrointestinalen Aktivität führt (TACHE et al.
1993; BARQUIST et al. 1996).
Die späte inflammatorische Phase des POI beginnt drei bis vier Stunden nach der
Operation und scheint für die Aufrechterhaltung des POI verantwortlich zu sein
(BOECKXSTAENS u. DE JONGE 2009).
2.3.2.1 Inflammatorische Genese
Verschiedene Studien zeigen, dass eine Beeinträchtigung der Darmmotilität durch
eine entzündliche Infiltration der Tunica muscularis externa in Folge chirurgischer
Manipulation des Darms hervorgerufen werden kann (KALFF et al. 1998a, 1999;
TÜRLER et al. 2002; SCHWARZ et al. 2004; WEHNER et al. 2007).
2.3.2.1.1 Neutrophile Granulozyten
Schon bei Öffnung der Bauchhöhle mit und ohne Vorlagerung des Darms kommt es
zu einem Anstieg der neutrophilen Granulozyten in die Tunica muscularis externa
des Dünndarms der Ratte (KALFF et al. 1998a). Eine sehr dichte und homogene
Verteilung der neutrophilen Granulozyten in der Tunica muscularis externa wird nach
Ausstreichen und bei Kompression des Jejunums bei der Ratte beobachtet. In den
manipulierten Jejunumabschnitten zeigten in vitro Kontraktilitätsuntersuchungen
zudem eine Reduktion der Kontraktionen der zirkulären Muskelschicht der Tunica
muscularis (KALFF et al. 1998a). Zwei Studien, bei denen eine Manipulation am
32

Literatur
Jejunum bzw. am Colon der Ratte durchgeführt wurde, zeigten im gesamten
Gastrointestinaltrakt eine deutliche Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten
(TÜRLER et al. 2002; SCHWARZ et al. 2004). In vivo wurde neben einer Reduktion
der Motilität im manipulierten Darmanteil auch eine verzögerte Magenentleerung und
verzögerte Ingestapassage im gesamten Gastrointestinaltrakt beobachtet. In vitro
wurde bei beiden Studien eine Reduktion der zirkulären Muskelkontraktilität
festgestellt (TÜRLER et al. 2002; SCHWARZ et al. 2004). Bei Gabe von Antikörpern
gegen Adhäsionsmoleküle (ICAM-1, P-Selectin) der Endothel- und Immunzellen
wurden keine neutrophilen Granulozyten sowie Monozyten rekrutiert und es konnte
keine Dysfunktion der zirkulären Muskelschicht der Tunica muscularis festgestellt
werden (KALFF et al. 1999). Auch die Behandlung von Ratten mit Dexamethason vor
der Manipulation des Jejunums führte zu einer deutlichen Abnahme der Rekrutierung
von neutrophilen Granulozyten sowie zu einer Reduktion der Kontraktilitätshemmung
(SCHWARZ et al. 2004). Auch in humanen und equinen Studien konnte eine
zelluläre Infiltration durch Manipulation des Darms beobachtet werden. So konnte bei
Menschen, bei denen eine Dünndarmresektion vorgenommen wurde, in den
Resektionsenden von makroskopisch unverändertem Darm ein signifikanter Anstieg
der neutrophilen Granulozyten und Monozyten in der zirkulären Muskelschicht der
Tunica muscularis beobachtet werden, wohingegen die Längsmuskelschicht
annähernd zellfrei war (KALFF et al. 2003). Bei Patienten, die nach 24 bzw. 48
Stunden erneut einer medianen Laparotomie unterzogen werden mussten, wurde
eine deutliche Reduktion der spontanen Kontraktilität beobachtet (KALFF et al.
2003). Im ischämisch geschädigten equinen Jejunum ist eine signifikante neutrophile
Entzündungsreaktion in der Tunica muscularis externa, der Tunica serosa sowie im
Plexus myentericus beschrieben (LITTLE et al. 2005). Da die neutrophile
Inflammation mit dem Zeitpunkt des Auftretens der klinischen Symptome des POI
übereinstimmt, liefert die Studie Hinweise, dass die inflammatorische Pathogenese
auch beim Pferd eine entscheidende Rolle in der Entwicklung des POI spielt (LITTLE
et al. 2005). Am Colon des Pferdes kommt es nach mechanischer Irritation der
Tunica serosa ebenfalls zu einer Infiltration der zirkulären Muskelschicht der Tunica
muscularis mit neutrophilen Granulozyten (HOPSTER-IVERSEN et al. 2011). Die
33

Literatur
Studien deuten darauf hin, dass die Infiltration der intestinalen Tunica muscularis
externa mit neutrophilen Granulozyten eine entscheidende Rolle in der Entstehung
des POI spielt.
2.3.2.1.2 Makrophagen und proinflammatorische Zytokine
Neben den neutrophilen Granulozyten sind Makrophagen und Monozyten die
vorherrschenden Zellen in der Entzündungsreaktion des manipulierten Darms beim
Menschen und der Ratte (KALFF et al. 1999, 2003). Am equinen Jejunum konnte
außerdem eine Aktivierung der gewebsständigen Makrophagen im Rahmen von
Ischämie und Reperfusion nachgewiesen werden (GROSCHE et al. 2011). In einem
Modell an Ratten und Mäusen, in dem die gewebsständigen Makrophagen durch
Chlodronatliposome abgebaut bzw. mit knock-out Tieren, die keine Makrophagen in
der Tunica muscularis des Darms besaßen, gearbeitet wurde, konnte nach
Dünndarmmanipulation sowohl eine deutliche Reduktion in der Expression von
Entzündungsmediatoren als auch eine geringere Rekrutierung von Leukozyten in die
Tunica muscularis externa festgestellt werden (WEHNER et al. 2007). Dies ging mit
einer nahezu normalen Jejunumkontraktilität in vitro und einer nahezu normalen
gastrointestinalen Passage in vivo einher. Die Studie gibt Hinweise darauf, dass
Makrophagen in der durch Darmmanipulation hervorgerufenen intestinalen
Entzündung initial eine entscheidende Rolle spielen und deren Inaktivierung die
Entstehung des POI verhindern könnte.
2.3.2.2 Kinetisch aktive Mediatoren
2.3.2.2.1 Stickstoffmonoxid
Verschiedene Studien deuten darauf hin, dass Stickstoffmonoxid eine entscheidende
Rolle sowohl bei der Rekrutierung der neutrophilen Granulozyten als auch bei der
Reduktion der Muskelkontraktilität spielt (KALFF et al. 2000; SCHWARZ et al. 2001).
Die Stickstoffmonoxidsynthase (iNOS) wurde bei der Ratte in Makrophagen der
Tunica muscularis externa des Dünndarms nachgewiesen (KALFF et al. 2000). Nach
intestinaler Manipulation kommt es zu einem deutlichen Anstieg der iNOSmessenger
Ribonukleinsäure (mRNA) und zu einem Anstieg von Stickstoffmonoxid
in der Tunica muscularis externa des Darms sowie zu einem Abfall der
gastrointestinalen Aktivität (KALFF et al. 2000). Auch für das Pferd ist eine Reduktion
34

Literatur
der Jejunumkontraktilität durch Stickstoffmonoxid beschrieben (RAKESTRAW et al.
1996). Bei Ratten und Mäusen, die einen selektiven iNOS-Hemmer erhielten,
verbesserte sich die Darmaktivität deutlich. Bei iNOS knock-out Mäusen konnte
sogar eine physiologische Muskelkontraktilität sowie eine Reduktion der Infiltration
von neutrophilen Granulozyten um 81 % festgestellt werden (KALFF et al. 2000). Am
mechanisch manipulierten Colon der Ratte konnte ebenfalls eine deutliche
Verbesserung der Funktion der zirkulären Muskelschicht der Tunica muscularis nach
Gabe des iNOS-Synthasehemmers festgestellt werden (TÜRLER et al. 2002). Die
Ergebnisse deuten daraufhin, dass Stickstoffmonoxid sowohl einen direkten Einfluss
auf die Darmkontraktilität nimmt als auch eine entscheidende Rolle in der
Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten spielt (KALFF et al. 2000).
Eine Studie am Colon ascendens des Pferdes liefert außerdem Hinweise, dass es
einen Zusammenhang zwischen der Freisetzung von Stickstoffmonoxid und der
Produktion von Prostaglandinen in der glatten Muskulatur des Colons gibt (VAN
HOOGMOED et al. 2002a). So kommt es nach elektrischer Stimulation der Ring- und
Längsmuskelschicht der Tunica muscularis sowie der Taenie des ventralen equinen
Colons zu einer Freisetzung von Stickstoffmonoxid und einem signifikanten Anstieg
der Prostaglandinproduktion. Bei Zugabe eines iNOS-Hemmers konnte dies im
selben Versuchsaufbau nicht beobachtet werden (VAN HOOGMOED et al. 2002a).
2.3.2.2.2 Prostaglandine
Bei Ratten kam es in Verbindung mit einem signifikanten Anstieg des
Prostaglandinspiegels in der Blutzirkulation und der Bauchhöhle nach
Dünndarmmanipulation zu einer Abnahme der gastrointestinalen Passage in vivo,
sowie einer Kontraktilitätsabnahme der zirkulären Muskelschicht in vitro (SCHWARZ
et al. 2001). Die in vivo Gabe von Prostaglandin F 2α (PGF 2α ) führt zu einer Erhöhung
der kontraktilen Aktivität des Ileums und Colons beim Kaninchen (BURAKOFF et al.
1990). Bei zwei in vitro Studien am equinen Colon führen verschiedene
Prostaglandine zu unterschiedlichen Effekten. An der ventralen Taenie des Colons
kommt es nach Zugabe von Prostaglandin E 2 (PGE 2 ) und PGF 2α zu einem
signifikanten Anstieg und bei Verabreichung von Prostaglandin I 2 (PGI 2 ) zu einer
Hemmung der Kontraktilität (VAN HOOGMOED et al. 1999). Am Colon wird bei
35

Literatur
Gabe von PGE 2 und PGF 2α an der longitudinalen Muskelschicht der Tunica
muscularis eine Steigerung der Kontraktilität und an der zirkulären Muskelschicht der
Tunica muscularis kein Effekt oder eine Kontraktilitätshemmung beobachtet. PGI 2
hingegen führt zu keinem Effekt an der longitudinalen Muskelschicht der Tunica
muscularis und hemmt die Kontraktilität der zirkulären Muskelschicht der Tunica
muscularis (VAN HOOGMOED et al. 2000). Die beiden Studien deuten schon die
Komplexität der Wirkung der Prostaglandine an. Zusätzlich führte in einer Studie am
equinen Ileum die Gabe von Prostaglandinantagonisten zu keiner Beeinflussung der
Ileumkontraktilität (MENOZZI et al. 2009). Die Autoren deuten dies so, dass die
durch COX-Hemmer verursachte Hemmung der Darmkontraktilität nicht auf
Prostaglandine zurückzuführen ist.
Bei Ponys, denen intravenös Endotoxine verabreicht wurden, konnte eine
Unterbrechung der physiologischen Motilität von Magen, Dünn- sowie Dickdarm
festgestellt werden. Dieselben Effekte konnten bei intravenöser Verabreichung von
PGE 2 und weniger stark bei PGI 2 und PGF 2α beobachtet werden. Diese Ergebnisse
deuten daraufhin, dass die bei Gabe von Endotoxinen beobachtete Reduktion der
Darmmotilität eventuell auf die Wirkung der Prostaglandine zurückzuführen ist (KING
u. GERRING 1991).
Die kombinierte Hemmung sowohl der Stickstoffmonoxid- als auch
Prostaglandinsynthese führte zu einem signifikant stärkeren Anstieg der
Muskelkontraktilität (um das 6,8-Fache) im Vergleich zur alleinigen Gabe eines
selektiven COX-2- bzw. iNOS-Inhibitors, was auf einen synergistischen Effekt der
beiden Substanzen hinweist (KALFF et al. 2003). Die genannten Studien deuten
daraufhin, dass sowohl COX-2- als auch iNOS-Inhibitoren die Auswirkungen von
intestinaler Manipulation und Entzündungsreaktion einschränken und der Entstehung
eines postoperativen Ileus entgegen wirken könnten (KALFF et al. 2000, 2003;
SCHWARZ et al. 2001, 2004; TÜRLER et al. 2002; VAN HOOGMOED et al. 2002a).
2.3.2.3 Hypocalcämie- und Hypomagnesiämie
Auch Elektrolytimbalancen scheinen die Entstehung eines POI zu begünstigen. Bei
einem Großteil der Pferde, die aufgrund eines akuten Abdomens vorgestellt und
36

Literatur
anschließend einer Kolikoperation unterzogen werden, sind die Blutplasmaspiegel an
ionisiertem Calcium (iCa 2+ ) und ionisiertem Magnesium (iMg 2+ ) erniedrigt (DART et
al. 1992; GARCIA-LOPEZ et al. 2001; DELESALLE et al. 2005), wobei beide
Elektrolyte bei strangulierenden Darmerkrankungen signifikant geringer waren als bei
nicht strangulierenden (GARCIA-LOPEZ et al. 2001). Bei den Pferden, die vor der
Operation einen sehr niedrigen Calciumspiegel aufwiesen, war die
Wahrscheinlichkeit der Entwicklung eines POI signifikant höher (12-Fach) als im
Vergleich zu Pferden, bei denen die Calciumkonzentration bei Vorstellung innerhalb
des Referenzbereiches lag (DELESALLE et al. 2005). Pferde mit einem POI zeigten
an Tag 3, 5 und 7 signifikant erniedrigte iMg 2+ und an Tag 3 signifikant erniedrigte
iCa 2+ Konzentrationen (GARCIA-LOPEZ et al. 2001). Für DELESALLE et al. (2005)
ist eine Hypocalcämie beim kolikenden Pferd sowohl für die Prognose in Hinblick auf
die Entwicklung eines POI als auch für das Überleben des Pferdes von Bedeutung.
2.4. Die Cyclooxygenasen
2.4.1 Allgemeines zu Cyclooxygenasen
Die Cyclooxygenase (COX) oder auch Prostaglandin H 2 -Synthase katalysiert die
ersten beiden Schritte der Prostanoidbiosynthese. Diese beinhalten die Oxidation
des Substrates Arachidonsäure zu Prostaglandin G 2 und die anschließende
Reduktion zu Prostaglandin H 2 . Aus Prostaglandin H 2 werden durch verschiedene
Enzyme die primären Prostanoide PGE 2 , PGF 2α , PGD 2 , PGI 2 , TXA 2 synthetisiert
(VANE et al. 1998). Dieses ist in Abb. 2 dargestellt.
37

Literatur
Arachidonsäure
PG = Prostaglandin
TX = Thromboxan
COX-1 und -2
PGG 2
COX-1 und -2
PGI 2 TXB 2
PGI Synthase
PGH 2 TXA
TXA Synthase
2
PGE Isomerase
6-keto-PGF 1α
PGD 2
PGE 2
PGD Synthase
PGF Synthase
PGF 2α
Abb. 2: Die Arachidonsäurekaskade in Anlehnung an VANE et al. 1998
Die COX können unter anderem durch die Arzneimittelgruppe der NSAIDs gehemmt
werden (CRYER u. FELDMAN 1998; WALLACE et al. 2000; BRIDEAU et al. 2001;
BERETTA et al. 2005). Der Effekt der NSAIDs wurde bereits vor 3500 Jahren mit
dem Salicin, welches unter anderem Bestandteil der Rinde der Silberweide ist, gegen
Rheuma und Fieber genutzt (VANE 2000). Die erste Bereitstellung eines
kommerziellen NSAIDs gelang der Firma Bayer 1897 mit der Herstellung von
Acetylsalicylsäure (VANE u. BOTTING 2003). Die Wirkung von Aspirin und anderen
NSAIDs über die Hemmung der COX und die damit verbundene Reduktion der
Prostaglandinsynthese wurde 1971 entdeckt (VANE 1971). Das Enzym COX wurde
1976 zum ersten Mal entdeckt (HEMLER u. LANDS 1976). 1991 wurde eine weitere
Isoform der COX identifiziert (KUJUBU et al. 1991; XIE et al. 1991). Diese wurde als
COX-2 bezeichnet und die als erstes entdeckte Isoform als COX-1. Mittlerweile sind
von beiden Enzymen verschiedene Unterformen („splice variants“) bekannt (QIN et
al. 2005). Dazu zählt auch die dritte Isoform COX-3, die sowohl als eine Unterform
38

Literatur
der COX-1 (CHANDRASEKHARAN et al. 2002) als auch der COX-2 (WILLOUGHBY
et al. 2000) angesprochen wird.
Bei beiden COX handelt es sich um membrangebundene Enzyme. Sie wurden in
murinen 3T3 Zellen sowohl im endoplasmatischen Retikulum (ER) als auch in der
Kernhülle nachgewiesen (REIGER et al. 1993; OTTO u. SMITH 1994; MORITA et al.
1995). In einer Studie wurde die COX-1-Expression vor allem im ER und weniger in
der Kernhülle beobachtet (MORITA et al. 1995). Beide Enzyme bestehen aus zwei
identischen Untereinheiten (Homodimere), die eine auffallende strukturelle
Ähnlichkeit besitzen (VANE et al. 1998; GARAVITO u. DEWITT 1999; FITZGERALD
u. LOLL 2001). Allerdings gibt es kleine strukturelle Abweichungen, die zu deutlichen
biochemischen Unterschieden zwischen den COX führen (WONG et al. 1997; VANE
et al. 1998; LITTLE et al. 2007a). Es sind zwei entscheidende Mutationen
beschrieben. So besitzt die COX-1 an Aminosäureposition 434 und 523 ein
Isoleucinrest und an Aminosäureposition 513 ein Histidinrest, wohingegen die COX-2
an diesen Stellen einen Valin- bzw. Argininrest besitzt. Die Mutationen der COX-2
führen zu einer deutlich höheren Sensitivität zu selektiven COX-2 Inhibitoren (WONG
et al. 1997). Die COX besitzen einen hydrophoben Kanal, durch den die
Arachidonsäure auf die aktive Seite des Enzyms gelangt (FITZGERALD u. LOLL
2001). Dieser Kanal kann durch NSAIDs für die Arachidonsäure blockiert werden, so
dass diese nicht mehr von der COX zu primären Prostanoiden umgesetzt werden
kann.
2.4.2 Die Cyclooxygenase-1
2.4.2.1 Konstitutive Expression
Die COX-1 ist ein konstitutiv exprimiertes Enzym, das in den meisten Geweben und
Zelltypen exprimiert wird (VANE et al. 1998; CRONSTEIN 2002; LITTLE et al.
2007a). Im gesamten Gastrointestinaltrakt von gesunden Ratten sind COX-1
exprimierende Zellen in der Tela submucosa, der Tunica muscularis und der Lamina
muscularis mucosae sowie dem Gefäßendothel in der Tela submucosa beschrieben
(HAWORTH et al. 2005). Zusätzlich zeigt die Studie, dass die Expression der COX-1
in den verschiedenen Abschnitten des Gastrointestinaltraktes unterschiedlich stark
39

Literatur
ausgeprägt ist. So weist der gesamte Dünndarm und das Caecum die höchste
Expression auf, gefolgt vom Magen. Am wenigsten COX-1 wird im Dickdarm
exprimiert (HAWORTH et al. 2005). Auch in anderen Spezies ist eine konstitutive
COX-1 Expression im Gastrointestinaltrakt nachgewiesen. In der Magenmucosa vom
Kaninchen und Menschen wurde die COX-1 vor allem in der Lamina muscularis
mucosae sowie in Endothel- und glatten Muskelzellen der Arterien und Venen
nachgewiesen (ZIMMERMANN et al. 1998). In der Magenmucosa der Ratte zeigten
Epithelzellen eine positive COX-1-Expression, die beim Auftreten von
Magengeschwüren nicht mehr nachweisbar war (SCHMASSMANN et al. 1998). Im
Colon der Maus wurde in den glatten Muskelzellen der Tunica muscularis COX-1
nachgewiesen (PORCHER et al. 2004). In aus der Kultur stammenden, glatten
Muskelzellen des menschlichen Darms wurde ebenfalls COX-1 nachgewiesen
(LONGO et al. 1998a). Bei der Ratte hingegen waren Muskel- und Endothelzellen
COX-1 negativ, nur in den Zellen der Tela submucosa wurde eine COX-1-Expression
beobachtet (REUTER et al. 1996). Die Ergebnisse der Arbeiten deuten auf
speziesspezifische Unterschiede in der Expression der COX-1 hin. Studien an der
Tunica mucosa des equinen Colons beschreiben eine konstitutive COX-1-Expression
in den Zellen der Tela submucosa (MATYJASZEK et al. 2009; MORTON et al. 2009;
GROSCHE et al. 2011). Zudem wurde eine COX-1-Expression in den Endothelzellen
der Gefäße in verschiedenen Organe festgestellt: in der Niere der Ratte
(MATSUYAMA et al. 2004), im Gehirn des Schweins (DOMOKI et al. 1999), sowie im
Gehirn von Mensch und Schwein (PARFENOVA et al. 2001).
Außerdem ist in verschiedenen Studien die genaue Lokalisation der COX-1 in der
Zelle beschrieben. In humanen und porcinen cerebralen Endothelzellen sowie in
Humanen Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) sind zwei Hauptlokalisationen
für die COX-1-Expression beobachtet worden. Zum einen eine perinukleäre
Expression inklusive Kernhülle und zum anderen eine Expression im Zytoplasma
(PARFENOVA et al. 2001). Auch in murinen 3T3 Zellen ist eine COX-1-Expression
im perinukleären Zytoplasma beschrieben (MORITA et al. 1995). Eine detaillierte
Untersuchung des Kerns konnte eine COX-1-Lokalisation in der Kernhülle sowie in
der Nähe von Kernporen zeigen (PARFENOVA et al. 2001).
40

Literatur
2.4.2.2 Induzierbarkeit
Über die Regelung der COX-1-Expression ist wenig bekannt (CRONSTEIN 2002;
LITTLE et al. 2007a). Eine Induktion des Enzyms auf einen schädlichen Stimulus ist
für die COX-1 nicht typisch (LITTLE et al. 2007a). In mehreren Studien ist auch kein
Anstieg der COX-1-Expression als Folge eines negativen Stimulus beobachtet
worden. Beispielsweise wurde nach induzierter Kolitis bei der Ratte kein Unterschied
in der COX-1-mRNA-Expression im Vergleich zur Kontrollprobe festgestellt
(REUTER et al. 1996). Beim Adenokarzinom des Menschen konnte ebenfalls keine
Erhöhung der COX-1-Expression im Vergleich zum Kontrollgewebe festgestellt
werden (RISTIMÄKI et al. 1997). Nach Ischämie und Reperfusion wurde in den
Endothelzellen im Gehirn des Schweins (DOMOKI et al. 1999) und in den
Endothelzellen in der Niere der Ratte (MATSUYAMA et al. 2004) keine vermehrte
COX-1-Expression beobachtet. Es gibt allerdings Studien, die eine gesteigerte
COX-1-Expression in „Stresssituationen“ beobachtet haben und Hinweise auf eine
schädigende COX-1-Aktivität geben. Bei akuter Organabstoßung nach
Nierentransplantation beim Menschen konnte in den betroffenen Nieren eine
signifikante Erhöhung der COX-1 in Blutgefäßen und infiltrierenden interstitiellen
Zellen im Vergleich zu gut angenommenen Organen festgestellt werden
(HOFFMANN et al. 2006). Des Weiteren führte die Bestrahlung von Mäusen in den
Epithelzellen des Dünndarms zu einem deutlichen Anstieg der COX-1-Expression
(COHN et al. 1997). In einer klinischen Studie zu Magenulzerationen beim Menschen
wurde ein Anstieg der COX-1-Expression mit Zunahme der Mucosaschädigung
festgestellt (BHANDARI et al. 2005). Im Gegensatz dazu steht die Studie von
SCHMASSMANN et al. (1998), die ein vollständiges Verschwinden der COX-1 in der
benachbarten Magenmucosa des Magenulcus beobachtete. Diese Studie wurde
beim Versuchstier Ratte durchgeführt. Daher deuten die Ergebnisse der beiden
Arbeiten mögliche Unterschiede in der COX-1-Expression zwischen verschiedenen
Spezies an. Aber auch innerhalb einer Spezies gibt es unterschiedliche Ergebnisse:
Beim Pferd wurde in drei Ischämie-Reperfusionsstudien am equinen Jejunum bzw.
Colon, die ausschließlich die Tunica mucosa und Tela submucosa untersuchten, ein
Anstieg der COX-1-Expression festgestellt (LITTLE et al. 2007b; COOK et al. 2009a;
MATYJASZEK et al. 2009). Drei andere Arbeiten beobachteten keinen Unterschied
41

Literatur
in der COX-1-Expression im Vergleich zur Kontrollprobe (MORTON et al. 2009;
GROSCHE et al. 2011; MARSHALL et al. 2011).
2.4.3 Die Cyclooxygenase-2
2.4.3.1 Konstitutive Expression
Bei der COX-2 handelt es sich um ein in hohem Maße induzierbares Enzym
(SCHMASSMANN et al. 1998; KAINULAINEN et al. 2002; MATSUYAMA et al.
2004). Eine konstitutive Expression wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Auf der
einen Seite gibt es Studien, die keine konstitutive COX-2-Expression beobachten. So
konnte in zwei Studien am Colon von gesunden Ratten und Schweinen keine COX-2
nachgewiesen werden (REUTER et al. 1996; CHO u. CHAE 2004). Auf der anderen
Seite beschreibt ein weitaus größerer Anteil an Studien eine konstitutive Expression
der COX-2 im Gastrointestinaltrakt von Maus, Ratte, Kaninchen, Pferd und Mensch.
So stellt HAWORTH et al. (2005) im gesamten Gastrointestinaltrakt von gesunden
Ratten eine konstitutive COX-2-Expression fest, die in den verschiedenen
Abschnitten des Gastrointestinaltraktes unterschiedlich stark ausgeprägt ist, fest. Am
stärksten wird die COX-2 in der Ileocaecalklappe exprimiert, gefolgt von Jejunum und
Dickdarm. Die geringste Expression der COX-2 befindet sich im Duodenum, Pylorus
und Magenfundus (HAWORTH et al. 2005). Die Ergebnisse der Studie weisen auf
eine unterschiedliche Ausprägung der Expression der COX-2 innerhalb des
Gastrointestinaltraktes hin. SCHMASSMANN et al. (1998) beschreiben ebenfalls
eine nur geringfügige COX-2-Expression in der gesunden Magenwand der Ratte. In
der Magenwand vom Kaninchen und Menschen hingegen gibt es deutliche positive
COX-2-Reaktionen (ZIMMERMANN et al. 1998). Die Ergebnisse der Arbeiten deuten
Unterschiede zwischen den verschiedenen Tierarten an. In der Tunica mucosa und
Tela submucosa des equinen Jejunums wird die COX-2 grundlegend exprimiert
(TOMLINSON et al. 2004; COOK et al. 2009a; MARSHALL et al. 2011), ebenso in
der Tunica mucosa und Tela submucosa des equinen Colons (MATYJASZEK et al.
2009; MORTON et al. 2009; GROSCHE et al. 2011). Bei der Maus wird die COX-2 in
der Tunica muscularis des proximalen Colons exprimiert (PORCHER et al. 2004).
Die gleichen Ergebnisse werden in glatten Muskelzellen des menschlichen Darms
nachgewiesen (LONGO et al. 1998a). Auch in anderen Organsystemen ist eine
42

Literatur
konstitutive Expression der COX-2 beschrieben. Beim neugeborenen Schwein
zeigten sich die Mikrogefäße des Gehirns, der Hirnrinde, der Niere und der Leber
COX-2 positiv (PARFENOVA et al. 1997). In der Niere der Ratte wird die COX-2 in
den Endothelzellen konstitutiv exprimiert (MATSUYAMA et al. 2004).
Zudem ist in mehreren Studien die genaue Lokalisation der COX-2 in der Zelle
beschrieben. Sowohl eine nukleäre als auch eine zytoplasmatische
COX-2-Expression ist in humanen und porcinen cerebralen Endothelzellen sowie in
HUVECs festgestellt worden (PARFENOVA et al. 2001). In der Kernhülle und
ebenfalls im Zytoplasma wurde in aktivierten 3T3-Zellen eine positive
COX-2-Expression beobachtet (MORITA et al. 1995). Weitere, detailliertere
Untersuchungen des Kerns ergaben eine COX-2 Lokalisation in Kernhülle und
Kernmembran sowie in der Nähe von Kernporen (PARFENOVA et al. 2001).
2.4.3.2 Induzierbarkeit
Bei der COX-2 handelt es sich um ein induzierbares Enzym, das infolge
verschiedener Stimuli ansteigt. Die Induzierbarkeit des Enzyms kann man gut an
einer Studie nachvollziehen, die in den ersten fünf Reperfusionsstunden nach
Ischämie einen Anstieg der COX-2-Expression in den Endothelzellen der Niere der
Ratte beschreibt und mit zunehmendem zeitlichen Abstand vom induzierenden
Stimulus eine Abnahme beobachtet (MATSUYAMA et al. 2004). Im
Gastrointestinaltrakt ist bei verschiedenen Krankheitsbildern eine Zunahme der
COX-2-Expression beschrieben. Bei Magenulzerationen kommt es zu einer
deutlichen Zunahme der COX-2-Expression in Monozyten, Makrophagen,
Fibroblasten und Endothelzellen im Bereich von betroffenen Magenabschnitten
(SCHMASSMANN et al. 1998). Bei Patienten mit Zöliakie ist in Bereichen von
geschädigtem oder vollständig abgelöstem Epithel eine starke COX-2-Expression in
Zellen der Tela submucosa vorhanden. Diese COX-2 positiven Zellcluster
verschwinden bei einer glutenfreien Diät vollständig oder sind deutlich reduziert
(KAINULAINEN et al. 2002). Bei der Ratte kommt es infolge einer Kolitis zu einem
drei- bis sechsfachen Anstieg der COX-2-Expression in der Lamina propria und
Tunica muscularis (REUTER et al. 1996). Auch beim Schwein kommt es bei
43

Literatur
ulzerativer Kolitis zu einem deutlichen Anstieg der COX-2-Expression (CHO u. CHAE
2004). Beim equinen Jejunum wird in der Tunica mucosa und Tela submucosa nach
ischämischer Schädigung ein Anstieg der COX-2-Expression beobachtet (COOK et
al. 2009a; HILTON et al. 2011; MARSHALL et al. 2011). Dasselbe gilt für das equine
Colon (MATYJASZEK et al. 2009; MORTON et al. 2009; GROSCHE et al. 2011).
Auch in verschiedenen hyperplastischen und neoplastischen Veränderungen ist eine
Induktion der COX-2 beschrieben. So wird die COX-2 in Adenokarzinomen der
Lunge und des Colons vermehrt exprimiert (SOSLOW et al. 2000). Beim
prämalignen, malignen und metastasierendem Hautkrebs des Menschen kommt es
ebenfalls zu einer Überexpression der COX-2 (KOKI et al. 2002). Außerdem scheint
die COX-2 eine Schlüsselrolle in der Tumorangiogenese einzunehmen
(MASFERRER et al. 2000).
2.4.3.3 Eigenschaften
Wurde die COX-2 lange als „schlechte“ COX bezeichnet, mehren sich die Hinweise,
dass sie sowohl im gesunden als auch im erkrankten Gastrointestinaltrakt eine
wichtige Rolle spielt. Im gesunden Gastrointestinaltrakt kommt es nur bei einer
gleichzeitigen Hemmung der COX-1 und COX-2 zu hämorrhagischen Erosionen im
Magen (WALLACE et al. 2000; GRETZER et al. 2001) und Dünndarm (TANAKA et
al. 2002a, b), die bei alleiniger Hemmung der COX-1 oder COX-2 nicht beobachtet
werden. Bei der Ratte wird bei induzierter Kolitis ein deutlicher Anstieg der COX-2
beobachtet. Behandelt man diese Tiere mit einem selektiven COX-2-Inhibitor, kommt
es zu einer Verschlimmerung der Kolitis, die bei einer Gabe des selektiven COX-2-
Inhibitors über einen Zeitraum von einer Woche zum Durchbruch des Darms führt
(REUTER et al. 1996). Auch bei der Behandlung von Ratten mit Magenulzerationen
mit einem selektiven COX-2 Hemmer kommt es zu einer verzögerten Heilung der
Magenulzerationen (SCHMASSMANN et al. 1998). Die Studien deuten auf eine
wichtige Rolle der COX-2 abgeleiteten Prostaglandine hin.
Eine weitere wichtige Rolle der COX-2 wird bei Hemmung der COX-1 deutlich. So
führt die Hemmung der COX-1 durch ein nicht selektives NSAID oder einen
selektiven COX-1-Inhibitor zu einer Erhöhung der COX-2-mRNA-Expression in der
44

Literatur
Magen- und Dünndarmmucosa der Ratte (TANAKA et al. 2001, 2002b). Es wird
angenommen, dass der scheinbar reflektorische Anstieg der COX-2 auf das durch
die COX-1-Hemmung verursachte Prostaglandindefizit zurückzuführen ist und die
COX-2 dieses ausgleicht (TANAKA et al. 2001).
2.4.4 Die Produkte der Cyclooxygenasen - Prostanoide
Die Synthese der Prostanoide ist bereits in 2.4.1 beschrieben. Ihre Wirkung üben die
Prostanoide im Allgemeinen para- oder autokrin aus, in der Zirkulation besitzen sie
nur eine kurze Halbwertszeit (DUBOIS et al. 1998; MARTIN u. WALLACE 2006). Die
Serumkonzentration der Prostanoide scheint speziesspezifisch zu sein. So wurden
bei Pferd, Hund und Katze unterschiedliche Konzentrationen an TXB 2 und PGE 2 im
Serum ermittelt (BRIDEAU et al. 2001).
2.4.4.1 Prostanoide im Gastrointestinaltrakt
Eine Studie an Ratten, Hunden, Affen und Menschen hat gezeigt, dass die im
gesunden Gastrointestinaltrakt produzierten und für physiologische Prozesse
benötigten Prostaglandine von der COX-1 produziert werden (KARGMAN et al.
1996). Weitere Studien an der Ratte unterstützen diese Beobachtung. So wurde eine
deutliche Reduktion der PGE 2 -Konzentration in der Tunica mucosa des Dünndarms
nach Gabe des selektiven COX-1-Hemmers SC-560, nicht aber nach Gabe des
selektiven NSAIDs Rofecoxib festgestellt (TANAKA et al. 2002a, b; TAKEUCHI et al.
2003).
2.4.4.1.1 Einfluss auf die Darmbarriere
Im Dünndarm scheinen die Prostaglandine PGE 2 und PGI 2 eine entscheidende
Funktion bei der Wiederherstellung der Darmbarriere nach ischämischer Schädigung
zu haben. So hat eine Studie am ischämisch geschädigten Schweineileum einen
synergistischen Effekt der Prostaglandine PGE 2 und PGI 2 bei der Wiederherstellung
der Darmbarriere durch die Zunahme des transepithelialen Widerstandes (TEER)
festgestellt (BLIKSLAGER et al. 1997). Bei alleiniger Gabe von PGE 2 oder PGI 2
konnte nur eine geringe Erhöhung des TEER beobachtet werden (BLIKSLAGER et
al. 1997). Die Erholung der Darmbarriere scheint dabei auf den Verschluss der durch
Ischämie erweiterten interzellulären Räume zurückzuführen zu sein. Denn im
Elektronenmikroskop zeigt sich, dass bei Gabe des nicht selektiven NSAIDs
45

Literatur
Indomethacin bei mehr als 75 % der Tight-junctions eine Erweiterung vorliegt, die bei
Gabe der Prostaglandine PGE 2 und PGI 2 nur selten zu beobachten ist
(BLIKSLAGER et al. 1999). Zu ähnlichen Ergebnissen kommen Ischämiestudien am
equinen Jejunum. Dort kommt es nach Gabe des nicht selektiven NSAID Flunixin-
Meglumin zu einer Hemmung der PGE 2 und PGI 2 Produktion und zu keiner Erholung
der Darmwandbarriere, gemessen am TEER. Bei Gabe des selektiven NSAIDs
Etodolac werden ein signifikanter Ansieg von PGE 2 und PGI 2 sowie eine signifikante
Zunahme des TEER festgestellt (CAMPBELL u. BLIKSLAGER 2000). Ebenfalls am
equinen Jejunum wird eine gesteigerte Darmpermeabilität bei der Gabe des nicht
selektiven NSAIDs Flunixin-Meglumin beobachtet, die bei der Zugabe von PGE 1 nicht
mehr besteht (TOMLINSON u. BLIKSLAGER 2005). Am equinen Colon hingegen
konnte nach Verabreichung von Flunixin-Meglumin kein signifikanter Unterschied im
TEER im Vergleich zur Kontrollprobe festgestellt werden (MATYJASZEK et al. 2009).
Dies deutet auf mögliche Unterschiede in den verschiedenen Darmabschnitten hin.
PGE 2 scheint außerdem im entzündeten Gewebe ein wichtiges Prostaglandin zu
sein, da es ein potenter Hemmer der Freisetzung des Tumornekrosefaktors TNF-α
und IL-1 aus Makrophagen (KUNKEL u. CHENSUE 1985; KUNKEL et al. 1986a, b)
sowie Leukotrien B 4 und IL-8 aus neutrophilen Granulozyten ist (HAM et al. 1983;
WERTHEIM et al. 1993).
2.4.4.1.2 Einfluss auf die Darmmotilität
Die Prostaglandine beeinflussen neben der Darmbarriere auch die Motilität des
Darms. Dieser Einfluss ist in Kapitel 2.3.2.2.2 erläutert.
2.4.5 Wirkung von Cyclooxygenasehemmern
Für Hemmung der COX durch NSAIDs sind verschiedene Mechanismen
beschrieben:
1. Die Acetylsalicylsäure führt über eine Acetylierung von Serin 530 der COX-1
und Serin 516 der COX-2 zu einer irreversiblen Blockierung des hydrophoben
Kanals (FITZGERALD u. LOLL 2001).
46

Literatur
2. Bei NSAIDs mit einer Carboxylatgruppe verbindet sich diese mit dem
Argininrest an Aminosäureposition 120 im hydrophoben Kanal, wodurch
dieser blockiert wird (MANCINI et al. 1995; BHATTACHARYYA et al. 1996).
3. Die bereits erwähnten geringen Unterschiede in der Aminosäureanordnung
der COX und ein damit verbundener Unterschied in der Konformation machen
sich selektive NSAIDs zunutze (LITTLE et al. 2007a). Zum einen befinden sich
bei der COX-2 an Aminosäureposition 434 und 523 schmale Valinreste
anstelle der kräftigen Isoleucinreste der COX-1. Dadurch entsteht bei der
COX-2 eine Seitentasche, deren Öffnung bei der COX-1 durch die großen
Isoleucinreste verschlossen ist. In die Seitentaschen der COX-2 können
Liganden von COX-2 selektiven NSAIDs greifen (KURUMBAIL et al. 1996;
WONG et al. 1997; BERTOLINI et al. 2001). Zum anderen besitzt die COX-2
an Aminosäureposition 513 einen Argininrest. Dieser Argininrest reagiert mit
Sulfonamidgruppen, die sich auf vielen COX-2 selektiven NSAIDs befinden
(KURUMBAIL et al. 1996). Durch beide Mechanismen wird der hydrophobe
Kanal der COX-2 blockiert, nicht aber jener der COX-1. Dadurch hemmen
selektive NSAIDs vor allem die COX-2 und weniger die COX-1, was mit
weniger unerwünschten Nebenwirkungen verbunden ist (WARNER et al.
1999; RADI u. KAHN 2006).
2.5 Nichtsteroidale Antiphlogistika
2.5.1 Allgemeines zu den Nichtsteroidalen Antiphlogistika
NSAIDs werden aufgrund ihrer analgetischen, antiinflammatorischen und
antipyretischen Effekte sowohl in der Human- als auch in der Tiermedizin eingesetzt
(RADI u. KHAN 2006). Bei Pferden werden sie unter anderem zur Behandlung von
Arthritis und Kolik (TOMLINSON u. BLIKSLAGER 2003) sowie bei Endotoxämie
(SHUSTER et al. 1997) angewendet.
Man unterscheidet zwischen nicht selektiven nichtsteroidalen Antiphlogistika und
selektiven nichtsteroidalen Antiphlogistika, auch COXIBe genannt (CRONSTEIN
2002; RADI u. KHAN 2006). Die nicht selektiven NSAIDs binden reversibel sowohl
an der COX-1 als auch an der COX-2 und hemmen damit die Aktivität der Enzyme.
47

Literatur
Die selektiven NSAIDs binden nur schlecht an der COX-1, was zu einer schnell
reversiblen Bindung führt. An der COX-2 hingegen entsteht eine feste, länger
bestehende, aber reversible Bindung (CRONSTEIN 2002). Der Mechanismus, der für
diese Unterschiede verantwortlich ist, wird in Kapitel 2.4.5 erläutert. Die Ausprägung
der COX-Selektivtät der verschiedenen COX-Inhibitoren ist zwischen verschiedenen
Spezies unterschiedlich (BRIDEAU et al. 2001). Nach Absorption liegen die NSAIDs
zum größten Teil proteingebunden vor, wobei nur die nichtgebundene Form
pharmakologisch aktiv ist (BRATER 1988).
2.5.2 Nebenwirkungen der Cyclooxygenasehemmung im Gastrointestinaltrakt
Der therapeutische Effekt der NSAIDs beruht auf der Hemmung der COX-2, die
Hemmung der COX-1 hingegen führt zu unerwünschten Nebenwirkungen (WARNER
et al. 1999; RADI u. KAHN 2006). Da die vorliegende Arbeit am equinen Jejunum
durchgeführt wird, werden nachfolgend die Auswirkungen der COX-Hemmung im
Gastrointestinaltrakt schwerpunktmäßig erläutert.
2.5.2.1 Blutflussreduktion und Mucosaschäden
Bei selektiver Hemmung der COX-1 kommt es zu einer Reduktion des Blutflusses in
der Magenmucosa der Ratte (WALLACE et al. 2000). Auch bei Menschen, die über
längere Zeit NSAIDs einnahmen, wurde eine deutliche Reduktion des Blutflusses im
Magen und Dünndarm festgestellt (TAHA et al. 1993). WHITTLE und ESPLUGUES
(1988) konnten zeigen, dass die Blutflussreduktion in der Magenwand, erzeugt mit
dem endogenen, vasokonstriktiven Peptid Endothelin, zu hämorrhagischen und
nekrotischen Verletzungen in der Magenmucosa führt. Diese Veränderungen sind
auch bei der Verabreichung von NSAIDs bei verschiedenen Tierarten beschrieben.
So werden bei der Ratte Magenerosionen (WALLACE et al. 2000) sowie
Dünndarmläsionen (TANAKA et al. 2002b; TAKEUCHI et al. 2003) nach
Verabreichung des nicht selektiven NSAIDs Indomethacin beobachtet. Beim Hund
sind Magenläsionen verschiedenen Ausmaßes bei Behandlung mit Etodolac,
Meloxicam, Ketoprofen und Flunixin festgestellt worden (LUNA 2007). STANTON
und BRIGHT (1989) beobachteten bei Hunden, die NSAIDs erhielten, vermehrt
pyloroantrale Ulzerationen. Bei einem ausgewachsenen Rottweiler, der gleichzeitig
Meloxicam und Aspirin bekam, sind Duodenumulzerationen mit Perforation und
48

Literatur
Peritonitis beschrieben (REED 2002). MONREAL et al. (2004) stellten bei Pferden,
die über zwei Wochen Phenylbutazon erhielten, Magenulzerationen in der Pars
glandularis fest.
2.5.2.2 Hemmung der Regeneration der Darmbarriere
Am ischämisch geschädigten equinen Jejunum führt das nicht selektive NSAID
Flunixin-Meglumin sowohl in vivo als auch in vitro zu einer Regenerationshemmung
der Darmbarriere, gemessen am TEER (CAMPBELL u. BLIKSLAGER 2000;
TOMLINSON et al. 2004; TOMLINSON u. BLIKSLAGER 2005; LITTLE et al. 2007b;
COOK et al. 2009a; MARSHALL et al. 2011). Am ischämisch geschädigten Dickdarm
hingegen beeinträchtigt Flunixin-Meglumin die Erholung der Darmbarriere nicht
(MATYJASZEK et al. 2009). Auch in einer in vitro Studie, in der das rechte dorsale
Colon mit hypochloriger Säure geschädigt wurde, führen die beiden nicht selektiven
NSAIDs Indomethacin und Phenylbutazon zu keiner Beeinträchtigung der
Mucosaerholung (RÖTTING et al. 2004). Die Studien deuten auf Unterschiede
zwischen equinem Dünn- und Dickdarm in Bezug auf die Behandlung mit nicht
selektiven NSAIDs hin. Bei den selektiven NSAIDs kamen die Ischämiestudien am
equinen Jejunum zu unterschiedlichen Ergebnissen. Bei Pferden, die mit dem
selektiven NSAID Etodolac bzw. Deracoxib behandelt wurden, kam es ebenfalls zu
einer Hemmung der Erholung der Darmbarriere (TOMLINSON et al. 2004;
TOMLINSON u. BLIKSLAGER 2005). Demgegenüber stellten andere Studien bei
Gabe eines selektiven NSAIDs (Meloxicam, Firocoxib, Robenacoxib, Etodolac) keine
Erniedrigung des TEER und damit auch keine Hemmung der Regeneration der durch
Ischämie geschädigten Darmbarriere fest (CAMPBELL u. BLIKSLAGER 2000;
LITTLE et al. 2007b; COOK et al. 2009a; MARSHALL et al. 2011).
2.5.2.3 Beeinflussung der Motilität des Gastrointestinaltraktes
Auch ein Einfluss der NSAIDs auf die Motilität bzw. Kontraktilität des
Gastrointestinaltraktes ist in verschiedenen Tierarten und beim Menschen
beschrieben. Am Magen bzw. Dünndarm der Ratte kommt es nach oraler Applikation
von verschiedenen nicht selektiven NSAIDs (Indomethacin, Diclofenac, Naproxen)
sowie des selektiven COX-1-Hemmers SC-560 zu einer deutlichen Zunahme der
Magenmotilität und zu einer Hypermotilität des Dünndarms (TANAKA et al. 2001;
49

Literatur
2002a, c; TAKEUCHI et al. 2003). Die Hypermotilität des Dünndarms betrifft dabei
sowohl die Amplitude als auch die Frequenz der Kontraktion. Sie beginnt 30 bis 50
Minuten nach Applikation und verbleibt für einen Zeitraum von über drei Stunden
(TANAKA et al. 2002a; TAKEUCHI et al. 2003). Bei oraler Gabe des selektiven
NSAIDs Rofecoxib konnte keine Zunahme der Motilität in Magen und Dünndarm
festgestellt werden (TANAKA et al. 2001; 2002a, c; TAKEUCHI et al. 2003).
Untersuchungen der Dünndarmkontraktilität im Organbad kommen zu ähnlichen
Ergebnissen wie die Motilitätsstudien. So kommt es bei Zugabe des nicht selektiven
NSAIDs Indomethacin zu einer Zunahme der Jejunumkontraktilität (Ratte)
(SCHWARZ et al. 2001). Infolge der Gabe von selektiven COX-2-Inhibitoren (DFU
oder NS398) trat keine Veränderung bzw. eine Hemmung der Jejunumkontraktilität
auf (SCHWARZ et al. 2001). Eine Behandlung der Tiere mit Dexamethason vor der
Manipulation des Jejunums führte zu einer signifikanten Reduktion der Extravasation
von neutrophilen Granulozyten in die Tunica muscularis sowie zu einer deutlichen
Reduktion der Kontraktilitätshemmung durch intestinale Manipulation (KALFF et al.
1999; SCHWARZ et al. 2004).
Am Dickdarm der Ratte kam es nach Gabe des selektiven NSAIDs DFU ebenfalls zu
keiner Verbesserung der Darmkontraktilität (TÜRLER et al. 2002). Dass es beim
Menschen nach Gabe des selektiven COX-2-Inhibitors DFU hingegen zu einem
signifikanten Anstieg der Darmkontraktilität kommt (KALFF et al. 2003), deutet auf
mögliche Unterschiede zwischen verschiedenen Spezies hin.
Beim Pferd haben verschiedene Studien den Einfluss von unterschiedlichen NSAIDs
sowohl auf die Jejunum- als auch auf die Colonkontraktilität untersucht. In einer
älteren Studie, welche die ileocaecale myeloelektrische Aktivität untersuchte, kam es
durch Flunixin-Meglumin nur zu einer minimalen Beeinflussung dieser (LESTER et
al. 1998). In einer in vitro Studie am equinen Ileum hatten die nicht selektiven
NSAIDs Flunixin-Meglumin sowie Indomethacin bis zu einer Konzentration von
0,1 µM ebenfalls keinen großen Effekt auf die Motilität des Ileums. In höheren
Konzentrationen (1-100 µM) führte Flunixin-Meglumin zu einer deutlichen Reduktion
der tonischen Kontraktion, wohingegen bei Indomethacin keine Veränderung
50

Literatur
beobachtet wurde. Die Amplitude der spontanen Kontraktion wurde durch Flunixin-
Meglumin nicht beeinflusst, bei Indomethacin kam es in der höchsten Dosierung zu
einem Anstieg. Bei den selektiven COX-2-Hemmern (Celecoxib, NS-398, DUP-697)
kam es zu einer konzentrationsabhängigen Hemmung sowohl der tonischen
Kontraktionen als auch der spontanen Motilität. Der selektive COX-1-Hemmer
SC-560 hatte im Gegensatz zur Ratte weder einen Effekt auf die Motilität, noch auf
die Kontraktion des Ileums (MENOZZI et al. 2009). Bei in vitro Studien am equinen
Colon reduzieren die nicht selektiven NSAIDs Flunixin-Meglumin und Phenylbutazon
sowie die selektiven NSAIDs Carprofen und Ketoprofen die Kontraktilität der Ringund
Längsmuskelschicht der Tunica muscularis des dorsalen und ventralen Colons
sowie der Beckenflexur (VAN HOOGMOED et al. 2000). Im ventralen Colon war die
Reduktion der Kontraktilität durch Flunixin-Meglumin in der zirkulären Muskelschicht
der Tunica muscularis größer als in der Längsmuskelschicht (VAN HOOGMOED et
al. 2000). Im dorsalen Colon reagierte die Längsmuskelschicht wie im ventralen
Colon, in der zirkulären Muskelschicht hingegen kam es erst bei höheren
Konzentrationen zu einer Abnahme der Kontraktilität. Die zirkuläre Muskelschicht
schien weniger sensitiv für Flunixin-Meglumin zu sein (VAN HOOGMOED et al.
2000). Weitere Untersuchungen ergaben, dass die nicht selektiven NSAIDs
Indomethacin und Nabumetone zu einer konzentrationsabhängigen Abnahme der in
vitro Kontraktilität des equinem ventralen und dorsalen Colons führen (VAN
HOOGMOED et al. 2002b). Dabei scheint das dorsale Colon empfindlicher auf die
nicht selektiven NSAIDs zu reagieren als das ventrale Colon, denn im dorsalen
Colon konnte eine Abnahme der Kontraktilität schon bei geringen Konzentrationen
der nicht selektiven NSAIDs beobachtet werden (VAN HOOGMOED et al. 2002b).
Der selektive COX-2-Inhibitor Etodolac hingegen beeinflusst die
Dickdarmkontraktilität nicht deutlich. Erst in der höchsten eingesetzten Konzentration
von 3x10 -5 M kam es zu einer Reduktion der Kontraktilität des ventralen Colons (VAN
HOOGMOED et al. 2002b).
2.5.3 Einsatz selektiver NSAIDs
Die selektiven COX-2-Hemmer werden aufgrund der geringeren Hemmung der
COX-1 und der damit verbundenen Reduktion der Nebenwirkungen eingesetzt. So
51

Literatur
verursacht bei der Ratte der selektive COX-2-Inhibitor Rofecoxib sowohl im Magen
(TANAKA et al. 2001) als auch im Darm (TANAKA et al. 2002a; TAKEUCHI et al.
2003) keinerlei Schäden und keine Hypermotilität. WALLACE et al. (2000) konnten
bei dem selektiven COX-2-Hemmer Celecoxib ebenfalls keine Läsionen im Magen
der Ratte beobachten. Beim Pferd wird nach Gabe des selektiven NSAIDs
Meloxicam keine Erhöhung der Magenpermeabilität beobachtet (D’ARCY-MOSKWA
et al. 2012). Auch nach ischämischer Schädigung des equinen Jejunums wird bei
selektiven NSAIDs keine Hemmung der Regeneration der Darmbarriere festgestellt
(CAMPBELL u. BLIKSLAGER 2000; LITTLE et al. 2007b; COOK et al. 2009a;
MARSHALL et al. 2011).
Zu beachten ist, dass auch selektive COX-2-Inhibitoren eine Hemmung der COX-1
verursachen, die zu einer deutlichen Reduzierung der PGE 2 -Synthese im Magen
führt (CRYER u. FELDMAN 1998). Desweiteren weisen WARNER et al. (1999)
darauf hin, dass die selektiven COX-2-Inhibitoren wie Meloxicam, Etodolac und
Celecoxib das Potential haben, die COX-1 vollständig zu hemmen. Bei
Überdosierung des selektiven COX-2-Inhibitors Deracoxib oder wenn in engem
zeitlichem Abstand ein anderes nicht selektives NSAID bzw. Corticosteroid
verabreicht wurde, führte dies bei Hunden zu Perforationen im Gastrointestinaltrakt
(LASCELLES et al. 2005).
2.5.4 NSAIDs, Entzündungsmediatoren und neutrophile Granulozyten
Während der Ischämie und Reperfusion werden verschiedene
Entzündungsmediatoren produziert. Dazu gehören der vor allem von Makrophagen
und Mastzellen produzierte Tumornekrosefaktor alpha und das Interleukin-1β
(CHENSUE et al. 1988; FRANGOGIANNIS et al. 1998), sowie der
plättchenaktivierende Faktor und Chemokine, die alle zu einem Anstieg der
neutrophilen Granulozyten im Gewebe führen (MCMICHAEL u. MOORE 2004). Das
von Makrophagen und Endothelzellen produzierte Interleukin-8 führt zu einer
Chemotaxis der neutrophilen Granulozyten (SCHMETZER 2013). Außerdem setzen
Makrophagen bei einer Entzündung Leukotriene sowie Prostaglandine frei, die zu
einer Aktivierung von Chemokinen und Zytokinen führen (MURPHY et al. 2009), die
weiderum wie bereits erwähnt zu einer Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten
52

Literatur
führen. Ein Eingriff der NSAIDs an der Stelle der Prostaglandinfreisetzung durch
Makrophagen ist denkbar, so dass die NSAIDs einen Weg der
Neutrophilenrekrutierung unterdrücken und damit die Entzündungsreaktion
abschwächen.
2.6 Einzelstoffe
Im Folgenden werden die in der Studie eingesetzten NSAIDs, Flunixin-Meglumin als
Vertreter der nicht selektiven NSAIDs und Firocoxib als Vertreter der selektiven
NSAIDs, beschrieben.
2.6.1 Flunixin-Meglumin
2.6.1.1 Pharmakokinetik
Flunixin-Meglumin ist ein potenter Cyclooxygenasehemmer (PLUMB 2002), der zu
den nicht-selektiven NSAIDs zählt. Am Vollblut von Pferden haben Untersuchungen
gezeigt, dass es vorzugsweise die COX-1 hemmt (BRIDEAU et al. 2001) und im
Vergleich mit anderen NSAIDs, wie Phenylbutazon, Meloxicam und Carprofen, die
COX-1-Aktivität im Vollblut des Pferdes am stärksten unterdrückt (BERETTA et al.
2005). Es wird als effektives Analgetikum sowohl bei visceralem als auch bei
muskuloskeletalem Schmerz eingesetzt. So wurde bei Pferden, die im Rahmen einer
Kolikoperation Flunixin-Meglumin (1,1 mg/kg Körpergewicht (KGW) i.v.) erhielten,
eine positive Beeinflussung des Allgemeinbefindens festgestellt (GERDEMANN et al.
1997). In einem Modell, das bei Pferden eine reversible Lahmheit im Bereich der
Zehe verursacht, konnte bei Gabe von Flunixin-Meglumin (1,1 mg/kg KGW i.v.) eine
signifikante Reduktion sowohl im Lahmheitsgrad als auch in der Herzfrequenz über
zwölf Stunden beobachtet werden (FOREMANN u. RUEMMLER 2011; FOREMANN
et al. 2012). Im Vergleich mit den NSAIDs Carprofen und Phenylbutazon zeigt
Flunixin-Meglumin im postoperativen Schmerzmanagement die längste Wirkdauer
(JOHNSON et al. 1993).
Die Dosierungsempfehlung für Flunixin-Meglumin liegt bei 1,1 mg/kg KGW ein- bis
zweimal täglich intravenös oder oral (IONITA u. BREHM 2010). Die Bioverfügbarkeit
bei oraler Applikation liegt bei 85,8 % (SOMA et al. 1988), wobei es bei der oralen
Gabe und gleichzeitiger Futteraufnahme zu einer Resorptionsverlängerung kommt
53

Literatur
(IONITA u. BREHM 2010). Eine Studie konnte zeigen, dass die Effektivität von
Flunixin-Meglumin dosisabhängig ist. So führt Flunixin-Meglumin in halber Dosierung
(0,55 mg/kg KGW) zu einer geringeren Reduktion von Herzfrequenz und
Lahmheitsgrad bei Pferden mit skeletalen Schmerzen und dies auch für eine
geringere Zeitdauer als die empfohlene Dosierung von 1,1 mg/kg KGW (FOREMAN
et al. 2012). Bei doppelter Dosierung (2,2 mg/kg KGW) hingegen konnte keine
weitere Verbesserung der klinischen Symptomatik beobachtet werden (FOREMAN et
al. 2012).
2.6.1.2 Beeinflussung der Mucosapermeabilität
Der TEER ist ein sehr sensitiver Parameter zur Beurteilung der intestinalen
Mucosapermeabilität (CAMPBELL u. BLIKSLAGER 2000). Er wurde in mehreren
Ischämie-Reperfusionsstudien zur Beurteilung der Regeneration der Darmbarriere
untersucht. Desweiteren wurde der TEER herangezogen, um den Einfluss
verschiedener NSAIDs auf die Mucosaerholung beurteilen zu können. Dabei haben
sowohl in vitro als auch in vivo Studien gezeigt, dass eine Behandlung mit Flunixin-
Meglumin in einer Dosierung von 1,1 mg/kg KGW am ischämisch geschädigten
equinen Jejunum zu einer Hemmung der Regeneration der Darmbarriere, gemessen
am transepithelialen Widerstand, führt (CAMPBELL u. BLIKSLAGER 2000;
TOMLINSON et al. 2004; TOMLINSON u. BLIKSLAGER 2005; LITTLE et al. 2007b;
COOK et al. 2009a). Die Dauer der Permeabilitätserhöhung ist in den Studien
unterschiedlich. So ist in der Arbeit von LITTLE et al. (2007b) 18 Stunden nach
ischämischer Schädigung keine Permeabilitätserhöhung mehr festzustellen,
wohingegen COOK et al. (2009a) keine vollständige Erholung der Darmbarriere des
equinen Jejunums beobachteten. Es wird postuliert, dass es aufgrund der
verlängerten Erholungszeit zu einer erheblichen Endotoxinresorption kommen
könnte, auch wenn nur kleine Mucosaschäden zurückbleiben (TOMLINSON u.
BLIKSLAGER 2005; COOK et al. 2009a). Zu beachten ist, dass es am equinen
Colon nach ischämischer Schädigung zu keiner Hemmung der Regeneration der
Darmbarriere nach Flunixin-Meglumin Behandlung kommt (MATYJASZEK et al.
2009). Außerdem wurde in mehreren Studien die Permeabilität der Darmwand für
das parazellulär fließende Mannitol überprüft, dessen erhöhte Durchlässigkeit ein
54

Literatur
Zeichen für defekte Tight-junctions ist, deren Wiederherstellung durch
Prostaglandine erfolgt (TOMLINSON u. BLIKSLAGER 2005). Am equinen Jejunum
wurde bei einer Behandlung mit Flunixin-Meglumin in einer Dosierung von 1,1 mg/kg
KGW eine Erhöhung der Durchlässigkeit für Mannitol festgestellt (TOMLINSON et al.
2004; TOMLINSON u. BLIKSLAGER 2005). Am ischämisch geschädigten equinen
Colon hingegen kann kein erhöhter Mannitolfluss nach Behandlung mit Flunixin-
Meglumin beobachtet werden (MATYJASZEK et al. 2009). Die Durchlässigkeit für
Lipopolysaccharide (LPS) ist in der ischämisch geschädigten equinen Jejunumwand
erhöht (TOMLINSON u. BLIKSLAGER 2004). Bei Zugabe von Flunixin-Meglumin in
vitro konnte aber keine weitere Steigerung des LPS-Flusses festgestellt werden
(TOMLINSON u. BLIKSLAGER 2004), wohingegen es bei in vivo Gabe von Flunixin-
Meglumin zu einer höheren Mucosapermeabilität kommt (COOK et al. 2009a). Für
das ischämisch geschädigte und mit Flunixin-Meglumin behandelte Colon liegen
noch keine bekannten Studien vor, die den LPS-Fluss untersucht haben. Am
gallegeschädigtem equinen Jejunum hat Flunixin-Meglumin keinen hemmenden
Effekt auf die Mucosaerholung (CAMPBELL et al. 2002).
Neben dem Einfluss auf die Darmbarriere wurde am ischämisch geschädigten
equinen Jejunum nach 18-stündiger Reperfusion eine signifikante Zunahme des
Einstroms der neutrophilen Granulozyten in die Tunica mucosa bei den mit Flunixin-
Meglumin behandelten Probanden im Vergleich zur Kontrollgruppe festgestellt
(LITTLE et al. 2007b; COOK et al. 2009b). Am ischämisch geschädigten Colon
konnte kein signifikanter Unterschied im Anstieg der neutrophilen Granulozyten in
der Tunica mucosa zwischen den mit Flunixin-Meglumin behandelten Tieren und der
Kontrollgruppe festgestellt werden (MATYJASZEK et al. 2009).
2.6.1.3 Wirkung auf die Darmkontraktilität
Es gibt bis jetzt nur wenige Studien, die sich mit den Auswirkungen von NSAIDs auf
die Darmkontraktilität beim Pferd beschäftigt haben (LESTER et al. 1998; VAN
HOOGMOED et al. 2000, 2002b; MENOZZI et al. 2009). Die Wirkung von Flunixin-
Meglumin auf gesunden Dünn- und Dickdarm ist unter 2.5.2.3 bereits beschrieben.
Kontraktilitätsstudien am ischämisch geschädigten Darm in Verbindung mit der
Applikation von NSAIDs gibt es in der Literatur nicht.
55

Literatur
2.6.1.4 Einsatz bei Endotoxämie
Flunixin-Meglumin ist ein Hauptbestandteil der Endotoxämietherapie beim Pferd
(SHUSTER et al. 1997). Es führt zu einer effektiven Reduktion der
endotoxininduzierten Synthese von Prostaglandinen im Plasma. So konnte bei Gabe
von Flunixin-Meglumin vor Induktion einer Endotoxämie eine signifikante Reduktion
der Plasma TXB 2 und 6-keto-PGF 1 Konzentration festgestellt werden (BOTTOMS et
al. 1982; SEMRAD et al. 1987; BASKETT et al. 1997). Durch die Gabe von Flunixin-
Meglumin (1,1 mg/kg KGW) kommt es zu einer signifikanten Prävention der durch
Endotoxine verursachten hämodynamischen Veränderung. Besonders der Abfall des
mittleren arteriellen Blutdrucks und eine periphere Vasodilatation können durch die
Gabe von Flunixin-Meglumin verhindert werden, was zu einer verbesserten
Versorgung der Vitalorgane führt (BOTTOMS et al. 1981, 1982). Auch das klinische
Allgemeinbefinden verbessert sich bei Gabe von Flunixin-Meglumin (1,1mg/kg KGW)
deutlich. So zeigen die Pferde nach einem initialen Anstieg eine signifikante
Reduktion von Tachykardie und Tachypnoe, Rektaltemperatur, Hämatokrit sowie ein
verbessertes Allgemeinbefinden (KING u. GERRING 1989; BASKETT et al. 1997).
Zu beachten ist, dass es bei einer lowdose Gabe von Flunixin-Meglumin (0,25 mg/kg
KGW) zu einer ähnlichen Symptomatik wie in der Kontrollgruppe kommt. Die Pferde
zeigen Tachykardie und Tachypnoe, Hyperthermie, verfärbte Schleimhäute und eine
verlängerte kapillare Rückfüllungszeit (SEMRAD et al. 1987). In Bezug auf den
Gastrointestinaltrakt konnte eine Studie zeigen, dass Flunixin-Meglumin (1,1 mg/kg
KGW) zu einer signifikanten Antagonisierung der durch Endotoxine verursachten
Unterbrechung von Magen-, Dünn- und Dickdarmmotilität führt (KING u. GERRING
1989).
2.6.1.5 Nebenwirkungen
Bei einer Gabe von Flunixin-Meglumin über zwölf Tage in einer Dosierung von
1,1 mg/kg KGW dreimal täglich kommt es zu diversen Nebenwirkungen
(MACALLISTER et al. 1993). So konnten bei vier von fünf Pferden
Magenulzerationen, bei zwei Probanden Ulzerationen der Zunge sowie bei jeweils
einem Proband eine milde bis deutliche Anorexie, milde Kolik mit wässriger Diarrhoe,
56

Literatur
Nierenrindennekrose und eine nekrotisierende Pneumonie festgestellt werden
(MACALLISTER et al. 1993).
2.6.2 Firocoxib
2.6.2.1 Pharmakokinetik
Firocoxib ist ein sehr selektiver COX-2-Inhibitor (MCCANN et al. 2004). In einer in
vitro Studie beim Hund hemmt Firocoxib die COX-2 bei einem IC 50 384-Fach stärker
und bei einem IC 80 427-Fach stärker als die COX-1 (MCCANN et al. 2004). Die orale
Formulierung von Firocoxib wird beim Pferd gut absorbiert und bei der ersten
Passage der Leber nur wenig metabolisiert. Die Proteinbindung im Plasma liegt bei
97 % (KVATERNICK et al. 2007). Beim Pferd beträgt die Halbwertszeit 30 Stunden,
womit eine täglich einmalige Applikation ausreicht (KVATERNICK et al. 2007). Beim
Hund hingegen beträgt die Halbwertszeit ca. sechs Stunden (MCCANN et al. 2004).
Beim Pferd ist bei der Gabe von Firocoxib über sieben Tage nach drei
behandlungsfreien Tagen der größte Anteil wieder ausgeschieden. Dies geschieht zu
83 % über die Exkrete Urin (68 %) und Kot (15 %) (KVATERNICK et al. 2007).
Die empfohlene Dosierung von Firocoxib beim Pferd ist bei der oralen Formulierung
0,1 mg/kg KGW ein mal täglich und bei dem intravenös zu verabreichenden Präparat
0,09 mg/kg KGW ein mal täglich (IONITA u. BREHM 2010).
2.6.2.2 Anwendung im postoperativen Schmerzmanagement
Bei Hündinnen mit Ovariohysterektomie führt Firocoxib zu einer signifikant besseren
postoperativen Analgesie als Butorphanol. So hatten die mit Firocoxib behandelten
Tiere einen signifikant niedrigeren Schmerzscore als die mit Butorphanol
behandelten Hunde und nur 15 % der Tiere, die Firocoxib erhielten, benötigten eine
zusätzliche Analgesie. Dies war bei den mit Butorphanol behandelten Hunden in
92 % der Fälle notwendig (CAMARGO et al. 2011). In einer weiteren Studie stellte
man bei Hunden, die im Rahmen einer Weichteiloperation Firocoxib bekamen, einen
signifikanten Unterschied bezüglich des Schmerzscores im Vergleich zu Hunden der
Placebogruppe fest. Allerdings benötigten 16 % der mit Firocoxib behandelten
Probanden eine zusätzliche Analgesie, in der Placebogruppen war dies bei 50 % der
Probanden notwendig (KONDO et al. 2012).
57

Literatur
Firocoxib bietet außerdem eine effektive viszerale Analgesie bei Pferden, an denen
eine Ischämie mit anschließender Reperfusion des Jejunums durchgeführt wurde
(COOK et al. 2009a). Zusätzlich konnte bei den mit Firocoxib behandelten
Probanden ein signifikanter Anstieg des TEER am ischämisch geschädigten Jejunum
mit einer vollständigen Wiederherstellung der Darmbarriere 18 Stunden nach Ende
der Ischämie festgestellt werden (COOK et al. 2009a). Zudem wurde keine
signifikante Erhöhung der Permeabilität für LPS beobachtet (COOK et al. 2009a).
2.6.2.3 Nebenwirkungen
Hunde, die drei Tage Firocoxib erhielten, zeigten sowohl in der endoskopischen
Beurteilung der Tunica mucosa als auch in der histologischen Beurteilung der Tunica
mucosa keine signifikanten Veränderungen im Bereich von Pylorus- und
Duodenummucosa (WOOTEN et al. 2009). Auch bei geriatrischen Hunden, die
aufgrund einer Osteoarthritis über 90 Tage Firocoxib erhielten, wurden keine
signifikanten Veränderungen in der Endoskopie des Magens und des proximalen
Duodenums festgestellt (LECOINDRE u. PEPIN-RICHARD 2010). Dies stimmt
überein mit den Ergebnissen einer weiteren Langzeitstudie mit Firocoxib, die
ebenfalls kein erhöhtes Risiko für Nebenwirkungen am Gastrointestinaltrakt
beobachtete (STEAGALL et al. 2007). In einer anderen Studie wurden bei Hunden
mit Hilfe einer Biopsie Läsionen in der Magen- und Pylorusmucosa verursacht.
Anschließend wurde den Tieren für sieben Tage Firocoxib bzw. ein Placebo
verabreicht. In der Nachkontrolle wiesen die mit Firocoxib behandelten Tiere größere
Läsionen auf als die Placebogruppe, wobei die Prostaglandinsynthese bei beiden
Gruppen unbeeinflusst blieb (GOODMAN et al. 2009). Dies führt zu der
Schlussfolgerung, dass Firocoxib die Wundheilung in der Magenmucosa durch einen
von der Prostaglandinsynthese unabhängigen Mechanismus hemmt (GOODMAN et
al. 2009). LECOINDRE und PEPIN-RICHARD (2010) stellten in der Langzeittherapie
über 90 Tage keine negativen Einflüsse auf die Nierenfunktion fest. Auch die
hämatologischen Parameter, die Blutgerinnung und die Plättchenfunktion
unterschieden sich bei Langzeittherapie von Hunden mit Firocoxib nicht signifikant
von der Placebogruppe (STEAGALL et al. 2007).
58

Material und Methoden
3 Material und Methoden
3.1 Probanden
Die Probandengruppe bestand aus elf darmgesunden Pferden und zwei Ponys die
der Klinik für Pferde und dem Anatomischen Institut der Tierärztlichen Hochschule
Hannover für die Studie zu Forschungs- und Lehrzwecken zur Verfügung standen.
Ein Pferd verstarb in der Narkose vor Beginn des Versuches, so dass die Studie an
insgesamt zehn Pferden und zwei Ponys durchgeführt wurde. Sie wurden in der
Klinik für Pferde zwei Wochen aufgestallt und hatten während dieser Zeit
uneingeschränkten Zugang zu Heu und Wasser. Zuvor erfolgte eine prophylaktische
Behandlung mit einem Anthelmintikum. Die ersten beiden Pferde erhielten das
Anthelmintikum Moxidectin (Equest®, Fort Dodge Veterinär GmbH, Würselen,
Deutschland). Da bei dem zweiten Pferd nach Behandlung in der Kotuntersuchung
Parasiteneier festgestellt wurden, wurde dieses zusätzlich mit einem
Kombinationspräparat aus Ivermectin und Praziquantel (Equimax®, Virbac Schweiz
Ag, Glattbrugg, Schweiz) nach Herstellerangaben behandelt. Alle weiteren Pferde
bzw. Ponys erhielten in der Folge direkt das Kombinationspräparat aus Ivermectin
und Praziquantel. Zur Kontrolle des Behandlungserfolges wurde der Kot mit Hilfe des
Flotationsverfahrens auf intestinale Parasiteneier untersucht. Acht Stunden vor der
Operation wurde die Futteraufnahme unterbunden, wobei den Tieren weiterhin
Wasser zur Verfügung stand. Von den zwölf Pferden bzw. Ponys waren neun Stuten,
zwei Hengste und ein Wallach. Das Alter der Tiere betrug 3 bis 25 Jahre (17,54
Jahre +/- 9,23 Jahre) und das Gewicht der Pferde 465 bis 591 kg (541,4 kg +/-
43,58 kg) sowie der Ponys 350 kg bzw. 393 kg.
3.1.1 Vorbereitung der Pferde und Narkose
Bei jedem Pferd wurde am Tag vor der Operation eine klinische
Allgemeinuntersuchung vorgenommen. Des Weiteren wurde maschinell (Sysmex
KX-21, Sysmex Deutschland GmbH, Norderstedt) aus venösem Blut der Hämatokrit
(HKT [%]) sowie die Leukozytenanzahl (WBC [G/L]) und per analogem
Handrefraktometer (Euromex Microscopen B.V., Arnheim, Niederlande) der Gesamt-
Protein-Gehalt (GE [g/l]) bestimmt. Zum Zeitpunkt der klinischen Untersuchung
59

Material und Methoden
wurden bei keinem der Probanden Hinweise auf eine Erkrankung des
Gastrointestinaltraktes festgestellt. Die Werte des kleinen Blutbildes lagen im
Referenzbereich.
Für die Narkose wurde jedem Probanden in die linke Vena jugularis ein
Venenkatheter der Stärke 12 G (Vygonüle, Laboratories pharmaceutiques, Vygon,
Frankreich) gelegt. Als Narkoseprämedikation erhielten die Pferde intravenös 0,8 –
1,1 mg/kg KGW Xylazin (Xylaplan ® , CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH, Burgdorf,
Deutschland). Die Narkoseinduktion erfolgte mit Ketamin (2,2 mg/kg KGW i.v.,
Narketan ® , Vétoquinol GmbH, Ravensburg, Deutschland) in Kombination mit
Midazolam (0,05 mg/kg KGW i.v., Midazolam ® , B. Braun Melsungen AG, Melsungen,
Deutschland) in einem Ablegestand, so dass ein kontrolliertes Ablegen des Pferdes
möglich war. Nach Niedergang des Pferdes wurde ein Maulgatter nach Günther
eingesetzt um eine endotracheale Intubation zu ermöglichen. Unmittelbar nach der
Narkoseinduktion wurden die Pferde an ein Inhalations- und Beatmungsgerät
(modifizierter Bird Mark 7 Servo-Respirator, Eickemeyer Medizintechnik für Tierärzte
KG, Tuttlingen) und an einen Narkosemonitor (Kardiokap 5, Datex-Ohmeda GmbH,
Duisburg, Deutschland) angeschlossen. Die Narkoseerhaltung erfolgte mit Hilfe einer
balancierten Anästhesie, die sich aus Isofluran (Isofluran ® , CP-Pharma
Handelsgesellschaft GmbH, Burgdorf, Deutschland) mit 100 % Sauerstoff im
Narkosegasgemisch und einer kontinuierlichen Xylazininfusion (Xylaplan ® , CP-
Pharma Handelsgesellschaft GmbH, Burgdorf, Deutschland) zusammensetzte. Um
einen mittleren arteriellen Blutdruck von über 60 mmHg aufrechthalten zu können
erhielten die Pferde Dobutamin (Dobutamin-ratiopharm 250 mg ® , Ratiopharm GmbH,
Ulm, Deutschland), das mittels einer Perfusorspritzenpumpe genau dosiert werden
konnte, des weiteren Ringer-Laktat-Lösung (Ringer-Laktat ® , B. Braun Melsungen
AG, Melsungen, Deutschland) sowie nach Bedarf Hydroxyethylstärke (Hemohes ® , B.
Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland).
Mit dem Kardiocap 5 Monitor (Datex-Ohmeda GmbH, Duisburg, Deutschland)
erfolgte eine kontinuierliche Überwachung folgender Parameter: mittlerer arterieller
Blutdruck, Herzfrequenz, Atemfrequenz, Atemdruck, inspiratorische Sauerstoff- und
exspiratorische Kohlenstoffdioxid- sowie Isoflurankonzentration. Zusätzlich wurden
60

Material und Methoden
alle 20 Minuten die arteriellen Blutgase mit dem stationären Blutgasanalysegerät
(ABL 800 Flex, Radiometer GmbH, Willich) bestimmt. Die Narkose wurde von einem
Anästhesisten, der Diplomate des European College of Veterinary Anaesthesia ist,
durchgeführt.
Die Lagerung der Pferde erfolgte in Rückenlage auf einer luftgefüllten Gummimatte.
Eine Stabilisation der Lage wurde durch verstellbare Seitenaufzüge im Bereich der
Schultergliedmaßen sichergestellt. Die Gliedmaßen wurden dabei in gebeugter
Position frei gelagert. Das Operationsfeld wurde geschoren und mit 4%igem
Chlorhexidin-Glukonat (Hibiscrub®, Regent Medical, Manchester, United Kingdom)
gewaschen. Nachdem das Pferd steril abgedeckt war, wurde eine mediane
Laparotomie vorgenommen. Die Operation wurde von einer Chirurgin, die Diplomate
des American und European College of Veterinary Surgery ist, durchgeführt.
3.2 In vivo Modell
Das in vivo Modell wurde am mittleren Jejunum durchgeführt und bestand aus einer
Ischämie mit anschließender Reperfusion. Bei allen Probanden wurde eine
vergleichbare Blutflussreduktion beim Anlegen der Ischämie mit Hilfe eines O2C
(oxygen to see) Gerätes (O2C, LEA Medizintechnik GmbH, Gießen, Deutschland)
und mit einem herkömmlichen Pulsoxymeter gewährleistet (Abb. 3).
O2C-Sonde
Pulsoxymeter
Abb. 3: O2C-Sonde und Pulsoxymeter
61

Material und Methoden
3.2.1 O2C-Gerät
Das O2C-Gerät ermöglicht die nichtinvasive Bestimmung der Sauerstoffversorgung
von durchblutetem Gewebe. Es besteht aus einem Monitor an den eine Messsonde
angeschlossen ist, die auf das zu untersuchende Gewebe aufgelegt wird. Die von
der Sonde aufgenommenen Signale werden in elektrische Signale umgewandelt, die
wiederum digitalisiert und auf dem Monitor dargestellt werden (KRUG 2007).
Das O2C-Gerät kombiniert zwei physikalische Prinzipien: das Laser-Doppler-
Verfahren und die Weißlicht-Spektroskopie. Die O2C-Sonde sendet sowohl
Laserlicht nahes Infrarot (Wellenlänge 780-2.400 nm) als auch Weißlicht
(Wellenlänge 500-800 nm) aus. Bei beiden Verfahren wird das Licht im Gewebe an
den Mitochondrien gestreut und halbkreisförmig zur O2C-Sonde zurückgeleitet.
Während dieser Zeit kommt es zu Wechselwirkungen des Lichtes mit den
Erythrozyten, woraus das O2C-Gerät vier verschiedene Messparameter bestimmen
kann:
1. die Blutflussgeschwindigkeit (velocity) in der Mikrozirkulation
2. den relativen Blutfluss (flow) in der Mikrozirkulation
3. die Hämoglobinmenge (rHb) in der Mikrozirkulation
4. die Sauerstoffsättigung des Hämoglobins (SO 2 ) am venösen Kapillarende
Wenn das Laserlicht auf Erythrozyten trifft, führt dies zu einer
Frequenzverschiebung, die auch als Doppler-Effekt bezeichnet wird und die
Geschwindigkeit der Erythrozyten und damit die Geschwindigkeit des Blutflusses
wiedergibt. Der für die Studie entscheidende Blutfluss in der Mikrozirkulation wird aus
der ermittelten Blutflussgeschwindigkeit in Kombination mit der Summe aller
Erythrozyten ermittelt (KRUG 2007).
Wenn das Weißlicht auf Erythrozyten trifft, absorbieren diese ein Teil des Lichtes, so
dass es zur Veränderung von Farbe und Intensität des ursprünglich „weißen Lichtes“
kommt, was die Bestimmung der Hämoglobinmenge ermöglicht. Zusätzlich wird die
Sauerstoffsättigung des Hämoglobins mit Hilfe des Weißlichtes bestimmt. Dies
basiert ebenfalls auf der Veränderung von Farbe und Intensität des Lichtes. So hat
das Blut bei Oxygenierung des Hämoglobins eine rötliche Farbe und nimmt bei
62

Material und Methoden
Desoxygenierung einen bläulichen Ton an. Diese Farbunterschiede verursachen
eine unterschiedliche Absorption des Weißlichtes und erlauben die Bestimmung der
Sauerstoffsättigung des Hämoglobins (KRUG 2007).
Das O2C-Gerät misst nur die Mikrozirkulation, da im Vollblut die mitochondrienlosen
Erythrozyten nahezu das gesamte Licht absorbieren und kein Licht gestreut werden
kann (KRUG 2007).
3.2.2 Pulsoxymetrie
Bei der Pulsoxymetrie handelt es sich um eine Methode zur nichtinvasiven Messung
der arteriellen Sauerstoffsättigung des Hämoglobins (KALTENEGGER 2006). Sie
basiert auf zwei Prinzipien, die zusammen die Bestimmung der arteriellen
Sauerstoffsättigung des Hämoglobins ermöglichen:
1. Der Sauerstoffgehalt des Hämoglobins bestimmt die Farbe des Blutes. Bei
Oxygenierung des Hämoglobins hat das Blut eine rötliche Farbe, bei
Desoxygenierung nimmt es einen bläulichen Farbton an. Dadurch ändert sich die
Absorption des roten bzw. infraroten Lichtes. Das rote Licht wird vom Oxyhämoglobin
stärker absorbiert, das infrarote vom Desoxyhämoglobin (SCHÖLLER 1994;
KALTENEGGER 2006).
2. Das Pulsieren des arteriellen Blutflusses verändert das Blutvolumen in den
arteriellen Blutgefäßen, was sich wiederum auf die Lichtabsorption des roten und
infraroten Lichtes des Pulsoxymeters auswirkt (KALTENEGGER 2006).
Aus der Änderung des Verhältnisses der roten und infraroten pulsierenden
Lichtabsorption bestimmt das Gerät das Verhältnis der zwei Hauptkomponenten des
Hämoglobins: Oxyhämoglobin (O 2 Hb) sowie reduziertes Hämoglobin (Hb) und
berechnet darüber die arterielle Sauerstoffsättigung (SCHÖLLER 1994;
KALTENEGGER 2006).
Nicht pulsierendes Gewebe wie venöses Blut oder Haut kann keinen Einfluss auf die
Messung nehmen, da nur eine Veränderung der Absorption des Lichtes zur
Bestimmung der Sauerstoffsättigung genutzt wird (KALTENEGGER 2006).
63

Material und Methoden
3.2.3 Ischämie und Reperfusion
Da die Studie am mittleren Jejunum durchgeführt wurde, wurde nach Öffnung der
Bauchhöhle zunächst die Länge des Jejunums bestimmt, um anschließend die
Jejunummitte festlegen zu können. Das im Anschluss durchgeführte Ischämie-
Reperfusionsmodell bestand aus einer 90-minütigen warmen Ischämie
(Blutflussreduktion auf 10 % des ursprünglichen Blutflusses) mit anschließender 30-
minütiger Reperfusion. Die Ischämie und Reperfusion wurde zweimal durchgeführt,
die Darmabschnitte vom ersten und zweiten Durchgang hatten einen Abstand von
einem Meter. Der erste Durchgang diente als Kontrolle und im zweiten erhielten die
randomisierten Probanden nach 60 Minuten Ischämie ein NSAID intravenös in der
vom Hersteller angegebenen maximalen Dosierung (Abb. 4). Die Pferde bekamen
entweder das nicht selektive NSAID Flunixin-Meglumin in einer Dosierung von
1,1 mg/kg KGW intravenös (Flunidol ® RP 50 mg/ml, CP-Pharma Handelsgesellschaft
GmbH, Burgdorf, Deutschland) oder das selektive NSAID Firocoxib in einer
Dosierung von 0,09 mg/kg KGW intravenös (Equioxx ® 20 mg/ml, Merial, Lyon,
Frankreich).
K1 I1 R1 K2 NSAID i.v. I2 R2 K3
Ischämie 1 R 1 Ischämie 2
R 2
90 min 30 min 90 min
30 min
Abb. 4: Versuchsablauf und Zeitpunkte der Probenentnahme
K1 Probe vom ungeschädigtem Jejunum
I1 Jejunumprobe nach 90-minütiger Ischämie
R1 Jejunumprobe nach 90-minütiger Ischämie und 30-minütiger Reperfusion
K2 Probe von ungeschädigtem Jejunum
I2 Jejunumprobe nach 90-minütiger Ischämie und Behandlung mit einem NSAID
R2 Jejunumprobe nach 90-minütiger Ischämie und 30-minütiger Reperfusion und
Behandlung mit einem NSAID
K3 Probe von ungeschädigtem Jejunum und Behandlung mit einem NSAID
64

Material und Methoden
Zum Anlegen der Ischämie wurde das Jejunum in eine Schlaufe gelegt und eine
Strangulation mit Hilfe eines zirkulär um Jejunum und Gekröse gebundenen
Bühnerbandes (WDT, Garbsen, Deutschland) erzeugt (Abb. 4). Der Blutfluss wurde
dabei auf 10 % des ursprünglichen Flusses reduziert, die Überprüfung einer
adäquaten Blutflussreduktion erfolgte mit Hilfe des O2C-Gerätes und des
Pulsoxymeters. Zur Einleitung der Reperfusion wurde das Bühnerband (WDT,
Garbsen, Deutschland) nach 90-minütiger Ischämie durchtrennt (Abb. 5 C), die
Überprüfung eines adäquaten Blutflusses erfolgte wieder mit Hilfe des O2C-Gerätes
und des Pulsoxymeters.
A
B
C
Abb. 5: Ischämie- und Reperfusionsmodell
A
B
C
Legen des Jejunums in eine Schlaufe und Anlegen des Bühnerbandes
Jejunum nach 90-minütiger Ischämie
Jejunum nach 90-minütiger Ischämie und 30-minütiger Reperfusion
Die Probenentnahme erfolgte jeweils vor dem Anlegen der Ischämie (Abb. 4, K1 und
K2), nach der Ischämie (Abb. 4, I1 und I2) sowie nach der Reperfusion (Abb. 4, R1
und R2) und zusätzlich von einem ungeschädigten Jejunumabschnitt am Ende des
Versuches (Abb. 4, K3). Zur Probenentnahme wurden die den Jejunumabschnitt
versorgenden Gefäße mit einem Dafilon 1. Metric (B. Braun Medical AG,
Emmenbrücke, Schweiz) abgebunden und das Jejunumlumen mit Hilfe eines
Bühnerbandes und einer daneben angebrachten Peanklemme verschlossen.
Zwischen den beiden Begrenzungen wurde das Jejunum durchtrennt, in toto
entnommen und in warme, physiologische Kochsalzlösung gegeben. Von dem
entnommenen etwa 3 cm breiten Jejunumabschnitt wurde ein 2 cm breites Stück
65

Material und Methoden
mesenterial und antimesenterial mit einer Schere durchschnitten, so dass zwei
Proben entstanden. Beide wurden in flachem Zustand mit der Tunica mucosa nach
oben mit Stecknadeln auf Moosgummi befestigt (Abb. 6) und in neutral gepuffertem
Formalin nach Lillie (eigene Herstellung) sowie in Bouinscher Lösung (eigene
Herstellung) fixiert. Damit entstand ein Probenvolumen von je 84 (12 Pferde x 7
Probezeitpunkte: K1, I1, R1, K2, I2, R2, K3) in Formalin bzw. Bouinscher Lösung
fixierten Jejunumabschnitten. Bei der verbleibenden 1 cm breiten Jejunumprobe
wurden Tunica mucosa und Tunica muscularis im Bereich der Tela submucosa
voneinander getrennt und jeweils in ein Kryoröhrchen gegeben. Diese wurden in
flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend bei -80 °C aufbewahrt.
A
B
C
Abb. 6: Jejunumproben zu den drei Entnahmezeitpunkten
A
B
C
Jejunumprobe von ungeschädigtem Jejunum
Jejunumprobe nach 90-minütiger Ischämie
Jejunumprobe nach 90-minütiger Ischämie und 30-minütiger Reperfusion
Nach der letzten Probenentnahme wurde das Pferd intraoperativ mit Pentobarbital-
Natrium 300 mg/ml (Release ® , WDT, Garbsen, Deutschland) bzw. (Euthadorm ® , CP-
Pharma Handelsgesellschaft mbH, Burgdorf, Deutschland) euthanasiert.
Für den terminalen Tierversuch wurde der Tierschutzantrag nach § 8, Abs. 1 des
Tierschutzgesetzes an das Niedersächsische Landesamt für Verbraucherschutz und
Lebensmittelsicherheit (LAVES) gestellt und von diesem genehmigt (Az: 33.9-42502-
04-11/0572).
66

Material und Methoden
3.3 Histologie
3.3.1 Probenverarbeitung
Aus den in Bouin und Formalin fixierten Jejunumproben wurden jeweils drei 5mm
breite Darmstücke geschnitten und jeweils in eine Einbettkassette verbracht. Im
Anschluss wurden die formalinfixierten Präparate für vier Stunden unter fließendem
Leitungswasser gespült, die bouinfixierten Proben für mehrere Tage zwei mal täglich
mit 70%igem Alkohol aufgegossen, bis sich die Pikrinsäure ausreichend aus den
Präparaten gelöst hatte. Dann erfolgte über Nacht die Entwässerung sowie
Einbettung der Proben im Einbettautomat ASP 300 S (Leica Microsystems GmbH,
Wetzlar, Deutschland). Die aufsteigende Alkoholreihe diente der Entwässerung und
das Xylol als Intermedium zur Überführung in flüssiges Paraffin. Soweit nicht anders
angegeben, hatten die Reagenzien im Einbettautomaten Raumtemperatur (RT).
70 % Ethanol 2 Stunden oder länger (Präinkubation)
70 % Ethanol 1,5 Stunden
80 % Ethanol 1,5 Stunden
90 % Ethanol 1,5 Stunden
100 % Ethanol 1 Stunde
100 % Ethanol 1 Stunde
Isopropanol
1 Stunde
Xylol
1 Stunde
Xylol bei 35 °C
1 Stunde
Xylol bei 50 °C
1 Stunde
Paraffin bei 59 °C
1 Stunde
Paraffin bei 59 °C
1 Stunde
Paraffin bei 59 °C
1 Stunde
Am nächsten Tag wurden die Gewebeproben mit Hilfe einer Ausgießstation EG 1160
(Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland) in Paraffin eingebettet und so
Paraffinblöcke hergestellt. Nach Aushärtung der Blöcke wurden mit einem
Schlittenmikrotom (Jung AG, Heidelberg, Deutschland) 3-4 µm dicke Schnitte
angefertigt, diese auf einem mit 37 °C warmem Aqua dest. gefüllten Wasserbad
(Memmert GmbH & CoKG, Schwabach, Deutschland) gestreckt und auf
67

Material und Methoden
silanbeschichtete Objektträger (Objektträger Histobond ® , Paul-Marienfeld
GmbH&CoKG, Lauda-Königshof, Deutschland) gezogen. Anschließend wurden die
Schnitte über Nacht im 60 °C warmen Wärmeschrank getrocknet.
3.3.2 Vorbehandlung der Schnitte für histologische Färbungen und
Immunhistochemie
Sowohl für die Färbungen als auch für die Immunhistochemie (IHC) wurden
Objektträger mit je einem Gewebeschnitt hergestellt. Nach Einbringen der
Objektträger in ein Glasschiffchen wurden sie entparaffiniert und anschließend
rehydriert.
Entparaffinieren:
Xylol I
Xylol II
10 Minuten
10 Minuten
Rehydratation:
Isopropanol
2 Minuten
100 % Ethanol 2 Minuten
80 % Ethanol 2 Minuten (histologische Färbung)
80 % Ethanol + 3 % H 2 O 2 30 Minuten (IHC)
70 % Ethanol 2 Minuten
Die sich an die Färbung bzw. IHC anschließende Dehydratation der Proben erfolgte
sowohl für die HE-Färbung als auch für die IHC nach demselben Schema:
Dehydratation:
70 % Ethanol 2 Minuten
80 % Ethanol 2 Minuten
100 % Ethanol 2 Minuten
Isopropanol
2 Minuten
Xylol I
5 Minuten
Xylol II
5 Minuten
Bei der Lunafärbung wurde die Dehydratation modifiziert (s. 3.3.3.2).
68

Material und Methoden
3.3.3 Histologische Färbungen
Es wurden zwei histologische Färbungen durchgeführt. Zur Prüfung von Qualität und
Intaktheit der Schnitte bzw. Blöcke die HE-Färbung und für die Folgeversuche die
Lunafärbung, eine spezifische Färbung zur Darstellung von eosinophilen
Granulozyten. Die Zusammensetzung der Lösung für die HE- und Lunafärbung ist im
Anhang aufgelistet.
3.3.3.1 Hämatoxylin-Eosin Färbung
Für die HE-Färbung wurden formalinfixierte Gewebeschnitte verwendet.
Färbeprotokoll:
Das Entparaffinieren und die Rehydratation erfolgte wie unter 3.3.2 beschrieben.
Färbung und Gegenfärbung:
Aqua dest.
2 Minuten
Hämalaun nach Delafield
8 Minuten
0,1 % HCl (in Aqua dest.) 3-4 x Spülen
fließendes Leitungswasser
15 Minuten
1 % Eosin + 3-4 Tropfen Eisessig 5 Minuten
Aqua dest.
2 Minuten
Nach Dehydratation (3.3.2) wurden die Proben mit Eukitt (O. Kindler GmbH,
Freiburg, Deutschland) eingedeckt.
3.3.3.2 Lunafärbung
Für die Lunafärbung wurden Bouin fixierte Gewebeschnitte verwendet.
Färbeprotokoll:
Das Entparaffinieren und die Rehydratation erfolgte wie unter 3.3.2 beschrieben.
Färbung:
Aqua dest.
5 Minuten
Biebrich-Scharlachrot-Hämatoxylin 5 Minuten
Aqua dest.
2 Minuten
1 % Säurealkohol 16 Sekunden (in der Zeit 8 x dippen)
69

Material und Methoden
Aqua dest.
1 Minute
0,5 % Lithium-Carbonat bis zur Blaufärbung 45 Sekunden (in der Zeit 4 x
dippen)
Fließendes Leitungswasser
10 Minuten
96 % Ethanol zur Differenzierung 5 Minuten
100 % Ethanol 5 Minuten
Xylol I
5 Minuten
Xylol II
5 Minuten
Anschließend wurden die Proben mit Depex (Serva Electrophoresis GmbH,
Heidelberg, Deutschland) eingedeckt.
Die Biebrich-Scharlachrot-Hämatoxylin-Farblösung wurde täglich aus den drei
Stammlösungen Biebrich-Scharlachrot, Hämatoxylinstammlösung A und
Hämatoxylinstammlösung B frisch angesetzt.
3.3.4 Immunhistochemie
3.3.4.1 Calprotectin
Für die immunhistochemische Darstellung des Calprotectins wurden in Formalin
fixierte Gewebeschnitte verwendet. Nach Entparaffinieren, Überführung in das
wässrige Milieu sowie Blockierung der endogenen Peroxidase mit Hilfe von 3%igem
Hydrogenperoxid (H 2 O 2 ), wurden die Schnitte drei mal fünf Minuten in Phosphat
gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und anschließend für 30 Minuten bei
RT in Proteinase K (Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland) zur
Demaskierung des Antigens verbracht. Nach einmaligem Spülen mit PBS erfolgte
eine 20-minütige Inkubation mit normalem Ziegenserum (eigene Gewinnung), um
nichtspezifische Antikörperbindungen zu unterbinden. Die sich anschließende
Inkubation des Primärantikörpers (Anti-Calprotectin, Klon MAC387, monoklonal,
mouse IgG1, DCS Diagnostik Systeme, Hamburg, Deutschland) in einer Dosierung
von 1:400 erfolgte über Nacht im Kühlschrank (4 °C), wie in Tabelle 1 dargestellt. Am
nächsten Tag wurde nach dreimaligem Spülen in PBS der Sekundärantikörper
(Envision Mouse, DAKO, Hamburg, Deutschland) zugegeben und für 45 Minuten
belassen. Im Anschluss wurden die Schnitte mit dem chromogenen System DAB
70

Material und Methoden
(BioGenex, San Ramon, California, USA) unter mikroskopischer Kontrolle bis zu
einer adäquaten Farbreaktion behandelt. Anschließend wurden sie 10 Minuten unter
fließendes Leitungswasser gestellt, routinemäßig dehydriert (s. 3.3.2) und mit Eukitt
(O. Kindler GmbH, Freiburg, Deutschland) eingedeckt.
Die Negativ-Kontrollen wurden anstatt des Primärantikörpers mit 1%igem bovinem
Serumalbumin (BSA) in PBS inkubiert. Als Isotypenkontrolle wurde IgG aus
Mäuseserum (DAKO, Hamburg, Deutschland) eingesetzt.
3.3.4.2 Cyclooxygenase-1
Für die immunhistochemische Darstellung der COX-1 wurden in Bouin fixierte
Gewebeschnitte verwendet. Nach Entparaffinieren, Überführung in das wässrige
Milieu und Blockierung der endogenen Peroxidase mit Hilfe von 3%igem H 2 O 2 (E.
Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland), wurden die Schnitte drei mal fünf Minuten in
PBS gewaschen und anschließend für 20 Minuten in 96-99 °C heißem Citratpuffer
zur Demaskierung des Antigens verbracht. Nach Abkühlen auf 60-65 °C erfolgte ein
einmaliges Spülen mit PBS und anschließend eine 20-minütige Inkubation mit
3%igem BSA in PBS um nichtspezifische Antikörperbindungen zu verhindern. Die
folgende Inkubation des Primärantikörpers (COX-1, polyklonal, Kaninchen, Thermo
Fisher Scientific GmbH, Dreieich, Deutschland) in einer Dosierung von 1:500 erfolgte
über Nacht im Kühlschrank (4 °C), wie in Tabelle 1 dargestellt. Am nächsten Tag
wurde nach dreimaligem Spülen mit PBS der Sekundärantikörper (Envision Rabbit,
aus der Ziege, DAKO, Hamburg, Deutschland), der in einer ready to use Verdünnung
vorlag, zugegeben und für 45 Minuten belassen. Nach erneutem Spülen in PBS
wurden die Schnitte mit dem chromogenen System DAB (BioGenex, San Ramon,
California, USA) unter mikroskopischer Kontrolle bis zu einer adäquaten Farbreaktion
behandelt. Nach 10-minütigem Spülen unter fließendem Leitungswasser und
routinemäßiger Dehydratation wurden die Schnitte mit Eukitt (O. Kindler GmbH,
Freiburg, Deutschland) eingedeckt.
Die Negativ-Kontrollen wurden mit 1%igem BSA in PBS anstatt des
Primärantikörpers inkubiert. Als Isotypenkontrolle wurde IgG aus Kaninchenserum
(DAKO, Hamburg) eingesetzt.
71

Material und Methoden
3.3.4.3 Cyclooxygenase 2
Für die immunhistochemische Darstellung der COX-2 wurden in Bouin fixierte
Gewebeschnitte verwendet. Nach Entparaffinieren, Überführung in das wässrige
Milieu und Blockierung der endogenen Peroxidase mit Hilfe von 3%igem H 2 O 2 (E.
Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) wurden die Schnitte drei mal fünf Minuten in
PBS gewaschen und anschließend für 10 Minuten in 96-99 °C heißem
Ethylendiamintetraacetatpuffer (EDTA-Puffer) zur Demaskierung des Antigens
verbracht. Nach Abkühlen auf 60-65 °C erfolgte ein einmaliges Spülen mit PBS und
anschließend eine 20-minütige Inkubation mit normalem Ziegenserum um
nichtspezifische Antikörperbindungen zu verhindern. Die folgende Inkubation des
Primärantikörpers (COX-2, Klon SP21, monoklonal, Kaninchen, Thermo Fisher
Scientific GmbH, Dreieich, Deutschland) in einer Dosierung von 1:50 erfolgte über
Nacht im Kühlschrank (4 °C), wie in Tabelle1 dargestellt. Am nächsten Tag wurde
nach dreimaligem Spülen mit PBS der Sekundärantikörper (Envision Rabbit, aus der
Ziege, DAKO, Hamburg, Deutschland), der in einer ready to use Verdünnung vorlag,
zugegeben und für 30 Minuten belassen. Nach erneutem Spülen in PBS wurden die
Schnitte mit dem chromogenen System DAB (BioGenex, San Ramon, California,
USA) unter mikroskopischer Kontrolle bis zu einer adäquaten Farbreaktion
behandelt. Nach 10-minütigem Spülen unter fließendem Leitungswasser und
Dehydratation wurden die Schnitte mit Eukitt (O. Kindler GmbH, Freiburg,
Deutschland) eingedeckt.
Die Negativ-Kontrollen wurden mit 1%igem BSA in PBS anstatt des
Primärantikörpers inkubiert. Als Isotypenkontrolle wurde IgG aus Kaninchenserum
(DAKO, Hamburg, Deutschland) eingesetzt.
72

Material und Methoden
Tabelle 1: Übersicht der verwendeten Primärantikörper in der IHC
Primärantikörper Verdünnung Spezifität Herkunft
MAC 387
(Anti-Calprotectin)
1:400 Maus IgG,
monoklonal
DCS Diagnostik Systeme,
Hamburg
COX-1 1:500 Kaninchen IgG,
polyklonal
COX-2 1:50 Kaninchen IgG,
monoklonal
Thermo Fisher Scientific
GmbH, Dreireich
Thermo Fisher Scientific
GmbH, Dreireich
3.4 Molekularbiologie
Die molekularbiologischen Untersuchungen dienten dem Nachweis der COX-1 und
COX-2 in der Tunica muscularis des equinen Jejunums auf mRNA-Ebene bzw.
Proteinebene. Dies wurde mit Hilfe der Reverse Transkriptase
Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) bzw. des Western Blots durchgeführt.
Die Zusammensetzung aller in der RT-PCR und dem Western Blot benötigten Puffer
und Gele ist im Anhang aufgelistet.
3.4.1 Trizolextraktion
Mit der Trizolextraktion konnte gleichzeitig die für die RT-PCR benötigte
Ribonukleinsäure (RNA) und die für den Western Blot benötigten Proteine isoliert
werden. Auch fällt bei dieser Extraktionsmethode DNA an, diese wurde für diese
Studie nicht benötigt.
Für die Extraktion wurde jeweils eine in flüssigem Stickstoff (-196 °C) eingefrorene
Probe der Tunica muscularis/Tunica serosa und eine Probe der Tunica mucosa/ Tela
submucosa aufgetaut. Es handelte sich bei den Proben um Probe 3 (90-minütige
Ischämie und 30-minütige Reperfusion) desselben Probanden. Als die Proben
angetaut waren, wurde die Tunica serosa von der Tunica muscularis abgezogen, so
dass nur noch die Tunica muscularis zur Verfügung stand. Von der Tunica
muscularis und der Probe der Tunica mucosa/Tela submucosa wurden je zwei 25 mg
schwere Proben entnommen. Alle vier Proben wurden direkt in je 500 µl
Trizol ® Reagent (Life Technologies, Darmstadt) aufgenommen und anschließend mit
einem Dispergierer (Ultra Turrax ® T 10 basic, IKA ® -Werke GmbH & CoKG, Staufen)
73

Material und Methoden
circa 45 Sekunden homogenisiert. Nach fünfminütiger Inkubation bei RT wurden
100 µl Chloroform (E. Merck KGaA, Darmstadt) dazu pipettiert und das Tube
15 Sekunden in der Hand geschwenkt. Nach erneuter Inkubation bei RT (3 Minuten)
wurde die Probe 15 Minuten bei 4°C und 12.000 xg (Zentrifuge Fresco 21, Thermo
Scientific, Langenselbold) zentrifugiert (alle unter 3.4 aufgeführten Zentrifugationen
wurden mit dieser Zentrifuge durchgeführt). Das Ergebnis war eine Aufteilung der
Probe in drei Phasen: In die farblose wässrige Phase, diese enthielt die RNA, in die
weiße Interphase, in der die DNA enthalten war und in die organische rosa Phase mit
den darin enthaltenen Proteinen (Abb. 7)
Abb. 7: Die Produkte der Trizolextraktion
3.4.2 Vorbereitung für die konventionelle PCR (mRNA-Analyse)
3.4.2.1 RNA Isolierung
Die obere, farblose Phase, die die RNA enthielt wurde in ein 1,5 ml RNase freies
Tube (Eppendorf AG, Hamburg), pipettiert. Die sich anschließende RNA-Isolierung
gliederte sich in drei Schritte:
1. Präzipitation
Zum Ausfällen der RNA wurden 250 µl Isopropanol (SAV-Liquid Production GmbH,
Flintsbach) zu der wässerigen, farblosen Phase pipettiert, das Tube mehrmals
geschwenkt und zehn Minuten bei RT inkubiert. Anschließend erfolgte eine 10-
minütige Zentrifugation bei 4 °C und 12.000 xg.
74

Material und Methoden
2. Waschen
Der verbliebene Überstand wurde verworfen und das gewonnene Pellet mit 500 µl
75%igem Ethanol (SAV-Liquid Production GmbH, Flintsbach) gelöst. Damit sich das
Pellet von der Tubewand löst wurde die Probe vorsichtig gevortext (Vortexer Reax
Top, Heidolph Instruments, Schwabach) und anschließend fünf Minuten bei 4 °C und
7.500 xg zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Der Waschschritt wurde
insgesamt zweimal durchgeführt.
3. Resuspendieren
Der verbliebene Überstand wurde erneut verworfen und das gewonnene Pellet zehn
Minuten bei RT getrocknet. Anschließend wurde es in 30 µl RNase freiem Wasser
(Life Technologies, Invitrogen ® , Darmstadt) durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren
gelöst, bevor es für zehn Minuten bei 58 °C auf einem Heizblock (Thermo-
Inkubationsmischer Thriller ® , Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen) inkubierte.
Danach wurde das Tube für eine Minute auf Eis gestellt und anschließend bei -80 °C
gelagert.
3.4.2.2 RNA Vermessung
Mit einem Spektralphotometer (Smart Spec Plus Spectralphotometer, Bio-Rad
Laboratories GmbH, München) wurde sowohl die Gesamtmenge als auch die
Reinheit der extrahierten RNA bestimmt. Dazu wurde die RNA in einer Konzentration
von 1:50 mit vollentsalztem Wasser (VE-Wasser) verdünnt und die Absorption bei
260 nm sowie 280 nm gemessen. Der aus den beiden Werten berechnete Quotient
gab Aufschluss über die Qualität und Reinheit der RNA und aus der Absorption bei
260 nm wurde die Menge der enthaltenen RNA errechnet (Konzentration [μg/ml] =
OD260 × 40 μg/ml × Verdünnungsfaktor).
3.4.2.3 DNase Verdau
Um eine Verunreinigung der RNA mit DNA zu vermeiden, wurde ein DNase Verdau
durchgeführt. Es wurden 10 µg der extrahierten RNA eingesetzt. Zu dieser wurden
folgende Reagenzien in vorgegebener Reihenfolge pipettiert:
75

Material und Methoden
10 x Inkubationspuffer mit MgCl 2 5 µl
DNase, RNase free (10 U/µl) 1 µl
RNase Inhibitor (40 U/µl) 0,5 µl
RNase freies Wasser ad 50 µl
Anschließend wurden die Proben im Thermocycler (Peqlab Biotechnology GmbH,
Erlangen) nach einem festen Programm behandelt. Zunächst erfolgte eine
20-minütige Inkubation bei 37 °C, die zu einer Aktivierung der DNase führte. Danach
erfolgte eine 10-minütige Inkubation bei 75 °C, die zu einer Deaktivierung und zu
einem Abbau der DNase führte. Anschließend erfolgte eine Lagerung bei 4 °C. Das
Ergebnis des DNase Verdaus waren 10 µg DNA-freie RNA in 50 µl.
3.4.2.4 cDNA-Synthese
Die DNA-freie RNA wurde im Anschluss in cDNA (complementary DNA)
umgeschrieben. Dazu wurden 6 µl DNA-freie RNA eingesetzt. Zu dieser wurden
folgende Reagenzien in vorgegebener Reihenfolge pipettiert:
10 x RT Gold Buffer 5 µl
MgCl 2 (25 mM) 11 µl
dNTP Mix (10 Mm) 10 µl
RandomHexamers (50 µM) 2,5 µl
RNAse Inhibitor (20 U/µl) 1 µl
MultiScribe TM Reverse Transcriptase (50 U/µl) 3,125 µl
Dies wurde mit RNase freiem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 50 µl aufgefüllt.
Die sich anschließende Probenbearbeitung im Thermocycler begann mit einer 10-
minütigen Inkubation bei 25 °C, die der Anlagerung der Primer (RandomHexamers)
an die RNA diente. Es folgte eine 60-minütige Inkubation bei 37 °C, in der die
Transkription stattfand, bevor die Reverse Transkriptase während der sich
anschließenden 5-minütigen Inkubation bei 95 °C abgebaut wurde.
3.4.2.5 Konventionelle PCR für Cyclooxygenase-1 und -2
Bei der RT-PCR wird in vitro ein genau definierter Abschnitt der DNA, bzw. cDNA mit
Hilfe der DNA-Polymerase vervielfältigt. Sie wurde durchgeführt, um die Proben der
76

Material und Methoden
Tunica muscularis auf die Expression von COX-1 und COX-2 zu untersuchen und
damit die Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchung zu überprüfen bzw.
zu bestätigen.
Es wurde ein Mastermix aus folgenden Reagenzien in der angegebenen Reihenfolge
zusammenpipettiert (4-Fach Ansatz). Das Volumen des Reaktionsansatzes betrug
24µl.
H 2 O 64 µl
5 x Green Go Taq Buffer 20 µl
MgCl 2 4 µl
dNTP Mix 2 µl
Primer for (Tabelle 2) 2 µl
Primer rev (Tabelle 2) 2 µl
Go Taq Polymerase 2 µl
cDNA 1 µl
Die Go Taq Polymerase war das Enzym, die verwendeten Primer für die COX-1- und
COX-2-Amplifikation sind tabellarisch (Tabelle 2) aufgeführt.
Tabelle 2: Übersicht über die in der RT-PCR verwendeten Primer
Gen Temp. Zyklen Sequenz 5‘ 3‘ Produkt Accession Nr.
(in °C)
COX-1 60 40 for CAG ATG CTG 153 bp NM_001163976.1
AAT GGA GAG
ATG
rev GCC AGA GCG
TAG CAT AGA GC
COX-2 58 35 for AGA ACT TAC 118 bp NM_001081775.1
AGG AGA GAA
GGA
rev CGA AGA TGG
CAT CTG GG
77

Material und Methoden
Für die RT-PCR wurde der Deckel des Thermocyclers auf 99 °C erhitzt, um einen
Wasserdampfniederschlag am Deckel zu verhindern. Die Proben wurden in den
bereits erhitzten Cycler gestellt und einem zweiminütigen Denaturierungsschritt bei
95 °C unterzogen. Anschließend erfolgten in Abhängigkeit vom Gen 40 (COX-1) bzw.
35 (COX-2) Zyklen. Ein Zyklus bestand aus drei Abschnitten, die jeweils
30 Sekunden andauerten. Nach der Denaturierung bei 95 °C erfolgte die Anlagerung
des Primers bei 58 °C (COX-2) bzw. 60 °C (COX-1) und anschließend die Elongation
bei 72 °C. Nach Abschluss der Zyklen erfolgte erneut ein Elongationsschritt bei 72 °C
für sieben Minuten. Bei der Negativkontrolle wurde VE-Wasser anstatt der cDNA
eingesetzt.
Im Anschluss erfolgte eine Elektrophorese. Dazu wurden die Proben (12 µl Probe pro
Slot) in ein 2%iges Agarosegel mit Biotium pipettiert, als Laufpuffer diente TBE. Mit
Hilfe des Elektrophoresegerätes (Peqlab Biotechnology GmbH, Erlangen) wurde für
60 Minuten eine Spannung von 100 V angelegt. Anschließend wurden die Banden
mit Hilfe einer Detektionseinheit und der Vision-Capt-Software (Vilber Lourmat,
Frankreich) unter UV-Licht sichtbar gemacht.
3.4.3 Vorbereitung für den Western Blot
3.4.3.1 Proteinisolation
Es wurde die rosa Phase aus der Trizolextraktion verwendet. In dieser befanden sich
die Proteine.
Die Aufreinigung der Proteine umfasste vier Arbeitsschritte:
1. DNA-Präzipitation
Die bei -20 °C aufbewahrte Probe wurde nach dem Auftauen 15 Minuten bei 4 °C
und 12.000 xg zentrifugiert. Dann wurden die Reste der oberen farblosen Phase
(enthielt die RNA) vorsichtig abpipettiert und verworfen. Anschließend wurden 150 µl
100%iger Isopropanol hinzugegeben, das Tube mehrfach geschwenkt und drei
Minuten bei RT inkubiert. Dann erfolgte erneut eine Zentrifugation (5 Minuten, 4 °C,
2000 xg). Nach der Zentrifugation befand sich am Boden des Tubes ein Pellet,
welches die DNA enthielt. Die Proteine waren im Überstand enthalten.
78

Material und Methoden
2. Proteinpräzipitation
Der Überstand wurde abpipettiert und in ein neues Tube überführt. Nach der Zugabe
von 750 µl Isopropanol (SAV-Liquid Production GmbH, Flintsbach) erfolgte eine
10-minütige Inkubation bei RT, bevor die Probe erneut zehn Minuten bei 4 °C und
12.000 xg zentrifugiert wurde. Nach der Zentrifugation hatte sich erneut ein Pellet
gebildet, dieses enthielt die Proteine.
3. Waschen
Der Überstand wurde verworfen und es wurden 1 ml 0,3 M Guanidinhydrochlorid in
95%igem Alkohol zum Pellet gegeben. Damit das Pellet sich vom Boden löst, wurde
die Probe gevortext, bevor sie für 20 Minuten bei RT inkubierte. Anschließend
erfolgte erneut eine Zentrifugation für fünf Minuten bei 4 °C und 7.500 xg. Der
beschriebene Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Nach dem letzten
Waschschritt wurde der Überstand wieder verworfen, das Pellet in 1 ml 100%igem
Ethanol (SAV-Liquid Production GmbH, Flintsbach) gelöst, das Tube kurz gevortext
und anschließend 20 Minuten bei RT stehen gelassen bevor es für fünf Minuten bei
4 °C, 7.500 xg zentrifugiert wurde. Danach hatte man erneut ein Proteinpellet und
einen Überstand, der verworfen wurde.
4. Pellet trocknen und resuspendieren
Das Proteinpellet trocknete anschließend zehn Minuten unter dem Abzug bevor
100µl 1%iger Sodiumdodecylsulfat (SDS)-Lösung zugegeben wurde und das Pellet
durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren resuspendiert wurde. Um das
Resuspendieren zu unterstützen wurde die Probe anschließend für 90 Minuten bei
50 °C inkubiert und alle zehn Minuten vorsichtig gevortext. Danach wurde das Tube
zentrifugiert (10 Minuten, 4 °C, 10.000 xg). Nach dem Zentrifugieren enthielt der
Überstand die Proteine, so dass dieser abpipettiert und in ein neues Tube überführt
werden konnte.
Die Proteinvermessung wurde mit dem Bio-Rad DC TM Protein Assay Kit (Bio-Rad-
Laboratories GmbH, München) im Mikroplattenleser (Mithras LB 940 Berthold
Technologies, Bad Wildbad) bei einer Absorption von 700 nm durchgeführt. Als
Kalibrierung diente eine Standardreihe aus BSA (2 µg/µl). Über die gemessene
79

Material und Methoden
Proteinkonzentration konnte die Menge der Ausgangslösung errechnet werden, die
für eine Gesamtmenge von 20 µg Protein nötig war. Diese wurde anschließend mit
1%igem SDS und Lämmlipuffer entsprechend eingestellt.
3.4.3.2 SDS-Gelelektrophorese
Die Elektrophorese dient der Auftrennung von Proteinen entsprechend ihres
Molekulargewichtes. Das SDS-Gel bestand aus einem Sammel- und einem
Trenngel. Das Sammelgel dient dem Sammeln der Proteine vor dem Trenngel, das
Trenngel dient der Auftrennung der Proteine entsprechend ihres Molekulargewichtes.
Beide Gele hatten eine Dicke von 1,5 mm. Sowohl für die COX-1- als auch für
COX-2-Proteine wurde ein Trenngel mit 10 % Acrylamid verwendet. Für die
Elektrophorese wurde die Apparatur von Peqlab Biotechnology GmbH (Erlangen) mit
einem SDS-Laufpuffer eingesetzt. Nach Befüllen der Slots mit den Proben bzw. 5 µl
des Markers Page Ruler TM Prestained Protein Ladder (Fermentas Life Science
Thermo Fisher Scientific GmbH, Dreieich) wurde für zehn Minuten eine Spannung
von 100 Volt zum Durchlaufen des Sammelgels angelegt. Für das Durchlaufen des
Trenngels wurde anschließend die Spannung für 90 Minuten auf 150 Volt erhöht.
3.4.3.3 Western Blot für die Cyclooxygenase-1 und -2
Der Westernblot diente der Übertragung der aufgetrennten Proteine von der
Acrylamidmatrix des SDS-Gels auf eine Nitrocellulosemembran. Dazu wurde das
SDS-Gel aus der Elekrophoreseapparatur entnommen und zusammen mit sechs
Filtern und einer Nitrocellulosemembran in der Größe des Gels in eine Schale mit
Blotpuffer gelegt. Anschließend wurde in der Westernblotapparatur (Peqlab
Biotechnology GmbH, Erlangen) ein „Sandwich“ gebildet. Dieses bestand aus drei
Filtern auf die die Nitrocellulosemembran gelegt wurde, darauf folgte das SDS-Gel
und erneut drei Filtern. Wichtig war, dass sich zwischen den Schichten keine
Luftblasen bildeten, dieses wurde durch sorgfältiges Glattstreichen der einzelnen
Schichten bewirkt. Anschließend wurde die Westernblotapparatur mit einem Deckel
verschlossen und für 60 Minuten eine Stromstärke von 60 mA angelegt.
3.4.3.4 Immunodetektion
Die Immunodetektion diente der Visualisierung der Proteine auf der
Nitrocellulosemembran. Alle verwendeten Primär- und Sekundärantikörper stammen
80

Material und Methoden
von Santa Cruz Biotechnology, Inc., Heidelberg. Neben der COX-1 und COX-2
wurde β-Aktin als Primärantikörper eingesetzt. β-Aktin ist ein „Housekeeper“ und
diente als Ladekontrolle, um ein Vorhandensein von Proteinen in der Probe zu
überprüfen.
Zunächst wurden nichtspezifische Bindungsstellen mit 5%iger Magermilch in TBS-T
(COX-1 und β-Aktin) bzw. 2,5%igem BSA in TBS-T (COX-2) blockiert. Dazu wurde
die Membran entsprechend der später zu verwendenden Antikörper zerschnitten und
die einzelnen Abschnitte in Glasküvetten mit Magermilch bzw. BSA für eine Stunde
bei RT auf einem Schüttler (Schüttler VXR basic Vibrax ® , IKA ® -Werke GmbH &
CoKG, Staufen) inkubiert. Danach erfolgte eine dreimalige Waschung für jeweils fünf
Minuten mit TBS-T, um Magermilch- bzw. BSA-Schlieren auf der Membran zu
vermeiden. Anschließend wurden die Primärantikörper (verdünnt in TBS) in einer
Konzentration von 1:200 (COX-1 und 2) bzw. 1:5000 (β-Aktin) auf die Membran
gegeben. Zu den Negativkontrollen wurde statt der COX-1 und COX-2
Primärantikörper nur TBS pipettiert. Alle Glasküvetten wurden mit Parafilm
verschlossen, um ein Verdunsten der Flüssigkeit zu minimieren. Die Inkubation mit
den Primärantikörpern erfolgte über Nacht bei 4 °C unter leichtem Schütteln.
Am nächsten Tag wurden die Proben vier mal fünf Minuten mit TBS-T gewaschen,
bevor der Sekundärantikörper Donkey Anti-Goat (COX-1 und COX-2) bzw. Goat
Anti-Mouse (β-Aktin) beide verdünnt mit TBS und in einer Konzentration von 1:5000,
zu den entsprechenden Membranen gegeben wurden. Die Negativkontrollen
erhielten ebenfalls die entsprechenden Sekundärantikörper. Die Inkubation der
Sekundärantikörper erfolgte für 45 Minuten bei RT. Danach wurden die Membranen
erneut drei mal fünf Minuten in TBS-T und anschließend ein mal fünf Minuten in TBS
gewaschen.
81

Material und Methoden
Tabelle 3: Übersicht über die verwendeten Primärantikörper im Western Blot
Primärantikörper Verdünnung Spezifität Herkunft
COX-1 1:200 Ziegen IgG,
polyklonal
COX-2 1:200 Ziegen IgG,
polyklonal
β-Aktin 1:5000 Maus IgG,
monoklonal
Santa Cruz Biotechnology,
Inc., Heidelberg
Santa Cruz Biotechnology,
Inc., Heidelberg
Santa Cruz Biotechnology,
Inc., Heidelberg
Anschließend wurde die Nitrocellulosemembran wieder zusammengesetzt. Für die
Chemilumineszenz wurde das Super Signal ® West Dura Trial Kit (Thermo Fisher
Scientific GmbH, Dreireich) auf die Nitrocellulosemembran aufgegeben und für drei
Minuten inkubiert Daran schloss sich die Immunodetektion und die Auswertung der
Fotos mit der Fusion SL Chemilumineszenz-Detektionseinheit mit der Fusion
Software (Vilber Lourmat, Frankreich) an.
3.5 Lichtmikroskopische Untersuchung
Die Tunica muscularis und die Tunica serosa wurden von einem Untersucher (S.F.)
ausgewertet. Die Proben lagen verblindet vor. Die von der Lunafärbung (eosinophile
Granulozyten) und der Calprotectin-Immunhistochemie (neutrophile Granulozyten)
lichtmikroskopisch mit Hilfe des Axioskops (Carl Zeiss Jena GmbH, Jena) und der
Mikroskop Kamera DP-70 inklusive Software DP-Soft (Olympus Europa GmbH,
Hamburg) gewonnen Bilder wurden histomorphometrisch mit Hilfe des Programms
Image Pro Express 6.3 (Media Cybernetics, Bethesda, Maryland, USA) ausgewertet.
Die Schnitte der COX-1 und -2 Immunhistochemie wurden deskriptiv untersucht.
3.5.1 Auswertung Lunafärbung und Calprotectin-Immunhistochemie
3.5.1.1 Tunica muscularis
Die Auswertung der Tunica muscularis gliederte sich in zwei Teile:
1. Bestimmung der absoluten Anzahl sowohl an neutrophilen Granulozyten als
auch an eosinophilen Granulozyten pro Quadratmillimeter Gewebe
82

Material und Methoden
Es wurden in der Übersichtsvergrößerung (25-Fach) drei Gesichtsfelder pro Probe
zufällig ausgewählt und anschließend in der 100-Fachen Vergrößerung von jedem
Gesichtsfeld lichtmikroskopische Aufnahmen von der zirkulären, intermuskulären und
longitudinalen Muskelschicht angefertigt. Voraussetzung war, dass sich die
Gesichtsfelder nicht überlappten, alle Schichten intakt waren und sich keine
Zellcluster in den Gesichtsfeldern befanden. Als Zellcluster wurde wie in VENTE
(2011) eine traubenförmige Zellansammlung von mehr als 15 Zellen definiert, bei der
sich die Zellen nicht sicher voneinander differenzieren lassen und die sich von der
zellulären Infiltration der Umgebung abgehoben hat. Anschließend erfolgte die
Auswertung der Aufnahmen. Dafür wurde in die zirkuläre Muskelschicht ein
700 µm x 500 µm und in die longitudinale Muskelschicht ein 700 µm x 250 µm
großes, der intermuskulären Schicht anliegendes Rechteck gezeichnet (Abb. 8).
Innerhalb der Rechtecke wurden die Zellen gezählt und dann in Zellen pro
Quadratmillimeter umgerechnet. Bei der intermuskulären Schicht wurde die Fläche in
jedem Gesichtsfeld individuell ausgemessen, die Zellen gezählt und anschließend
ebenfalls in Zellanzahl pro Quadratmillimeter umgerechnet.
Tela submucosa
750 x 500 µm
individuell
750 x 250 µm
Stratum circulare
Intermuskuläre Schicht
Stratum longitudinale
Tunica
muscularis
individuell
In Anlehnung an: Caren‐Imme von Stemm
Anatomisches Institut, Tierärztliche Hochschule Hannover
Tunica serosa
Mesotheliumserosae
Abb. 8: Tunica muscularis und Tunica serosa – schematische Darstellung der
Auswertung
83

Material und Methoden
2. Deskriptive Untersuchung: Beurteilung des Vorkommens von clusterartigen
Ansammlungen von neutrophilen Granulozyten und eosinophilen
Granulozyten sowie des Verteilungsmuster der außerhalb der Cluster
gelegenen Zellen pro Gesichtsfeld.
Es wurden in der Übersichtsvergrößerung (25-Fach) drei Gesichtsfelder pro Probe
mit traubenförmigen Zellansammlungen (Zellclustern) zufällig ausgewählt und
anschließend in der 100-Fachen Vergrößerung von jedem Gesichtsfeld
lichtmikroskopische Aufnahmen von der zirkulären, intermuskulären und
longitudinalen Muskelschicht angefertigt. Voraussetzung war, dass sich die
Gesichtsfelder nicht überlappten und alle Schichten intakt waren. Anschließend
erfolgte die Auswertung der Aufnahmen. Als Zellcluster wurde eine traubenförmige
Zellansammlung von mehr als 15 Zellen definiert, bei der sich die Zellen nicht sicher
voneinander differenzieren lassen und die sich von der zellulären Infiltration der
Umgebung abgehoben hat (VENTE 2011). Zusätzlich wurde um jedes Cluster ein
Quadrat der Größe 80 µm x 80 µm gelegt, um die Zellcluster hinsichtlich ihrer Größe
einordnen zu können. Cluster, die kleiner als das Quadrat waren, wurden als
geringgradig, Cluster die die Größe des Quadrates hatten, als mittelgradig und
Cluster, die größer als das Quadrat waren, als hochgradig eingeordnet. Zum Schluss
wurde die Verteilung der neutrophilen und eosinophilen Granulozyten außerhalb der
Cluster betrachtet und wie folgt klassifiziert: keine, vereinzelte, multifokal und diffus
verteilte Zellen.
3.5.1.2 Tunica serosa
Die Auswertung der Tunica serosa gliederte sich in zwei Teile:
1. Bestimmung der absoluten Anzahl sowohl an neutrophilen Granulozyten als
auch an eosinophilen Granulozyten pro Quadratmillimeter Serosa
Es wurden in der Übersichtsvergrößerung (25-Fach) drei Gesichtsfelder pro Probe
zufällig ausgewählt und anschließend in der 100-Fachen Vergrößerung von jedem
Gesichtsfeld lichtmikroskopische Aufnahmen der Tunica serosa angefertigt. Eine
Voraussetzung war, dass sich die Gesichtsfelder nicht überlappten, alle Schichten
intakt waren und sich keine Zellcluster in den Gesichtsfeldern befanden.
84

Material und Methoden
Anschließend erfolgte die Auswertung der lichtmikroskopischen Aufnahmen. Dafür
wurde die Fläche der Tunica serosa für jedes Gesichtsfeld individuell ausgemessen
(Abb. 8), die Zellen gezählt und anschließend die Zellanzahl pro Quadratmillimeter
berechnet.
2. Deskriptive Untersuchung: Beurteilung des Vorkommens von clusterartigen
Ansammlungen von neutrophilen Granulozyten und eosinophilen
Granulozyten sowie des Verteilungsmuster der außerhalb der Cluster
gelegenen Zellen pro Gesichtsfeld.
Es wurden in der Übersichtsvergrößerung (25-Fach) drei Gesichtsfelder pro Probe
mit traubenförmigen Zellansammlungen ausgewählt und anschließend in der 100-
Fachen Vergrößerung von jedem Gesichtsfeld lichtmikroskopische Aufnahmen
angefertigt. Voraussetzung war, dass sich die Gesichtsfelder nicht überlappten und
die Tunica serosa intakt war. Anschließend erfolgte die Auswertung der
lichtmikroskopischen Aufnahmen wie für die Tunica muscularis beschrieben. Ein
weiteres Verteilungsmuster in der Tunica serosa war eine Aneinanderreihung von
Calprotectin positiven Zellen am mesothelialen Rand der Tunica serosa. Dieses
Verteilungsmuster wurde als Zellsaum am mesothelialen Rand der Tunica serosa
bezeichnet.
3.5.2 Auswertung Cyclooxygenase-1 und -2 Immunhistochemie
3.5.2.1 Tunica muscularis und Tunica serosa
Die immunhistochemische Reaktion der COX-1 und 2 wurde deskriptiv ausgewertet
und umfasste drei Teile:
1. Beurteilung der positiven Reaktionen in den glatten Muskelzellen der Tunica
muscularis
Beurteilt wurde:
85

Material und Methoden
Die Intensität der positiven Reaktion:
- = keine positive Reaktion
(+) = sehr schwache Färbung
+ = schwache Färbung
++ = starke Färbung
+++ = sehr starke Färbung
Welcher Teil der Muskelzelle positiv reagiert:
ZP
PN
ZK
Zytoplasma
perinukleär
Zellkern
Verteilung der positiven Reaktion innerhalb der Muskelschicht:
H
IN
homogene Verteilung innerhalb der Muskelschicht
inhomogene Verteilung innerhalb der Muskelschicht
Bei einer inhomogenen Verteilung wurde zusätzlich das
Verteilungsmuster beschrieben: positive Reaktion zur Tela submucosa
bzw. Tunica serosa oder zur intermuskulären Schicht orientiert
Verteilung der Stärke der positiven Reaktion innerhalb der Muskelschicht:
H
IN
homogene Verteilung der Stärke der positiven Reaktion innerhalb der
Muskelschicht
inhomogene Verteilung der Stärke der positiven Reaktion innerhalb der
Muskelschicht
Bei inhomogener Verteilung wurde zusätzlich das Verteilungsmuster
beschrieben: stärkere Reaktionen zur Tela submucosa bzw. Tunica
serosa oder zur intermuskulären Schicht orientiert
86

Material und Methoden
2. Beurteilung von positiv reagierenden Zellen innerhalb der Tunica muscularis
und Tunica serosa
Zelltyp:
Zelltyp A: dunkelbraun, rund, kleiner als Zelltyp C
Zelltyp B: hellbraun, spindelförmig
Zelltyp C: hellbraun, unregelmäßig rund, größer als Zelltyp A
Verteilung der positiven Zellen:
k keine
f fokal
mf multifokal
d diffus
3. Beurteilung einer positiven Reaktionen der Endothelzellen innerhalb der
Tunica muscularis und Tunica serosa
Reaktion der Endothelzellen:
H homogen
IH inhomogen
Zusätzlich wurde geprüft, ob der Gefäßtyp bestimmt werden konnte:
A Arterie
V Vene
L Lymphgefäß
Außerdem wurde notiert, ob alle Gefäße innerhalb einer Schicht positiv reagiert
hatten oder ob nur einige eine positive Reaktion zeigten und andere nicht.
87

Ergebnisse
4 Ergebnisse
Es werden zunächst die Ergebnisse der Lunafärbung (eosinophile Granulozyten) und
anschließend die Ergebnisse der Calprotectin (neutrophile Granulozyten) sowie
COX-1- und COX-2-IHC erläutert. Daran schließen sich die Ergebnisse der RT-PCR
und des Western Blots an, die zur Validierung der COX-1- und
COX-2-immunhistochemischen Ergebnisse in der Tunica muscularis des equinen
Jejunums dienten.
4.1 Lunafärbung
4.1.1 Deskription
Sowohl in der Tunica muscularis als auch in der Tunica serosa konnten die
eosinophilen Granulozyten nur selten beobachtet werden und lagen dann einzeln
vor. In der Ring- und Längsmuskelschicht wurden sie selten direkt zwischen den
glatten Muskelzellen beobachtet (Abb. 9 A und B), häufiger lagen sie im
Bindegewebe zwischen den glatten Muskelzellen (Abb. 9 E). In der intermuskulären
Schicht und der Tunica serosa konnten keine besonderen Lokalisationen festgestellt
werden (Abb. 9 C und F). Intravaskulär wurden die eosinophilen Granulozyten selten
beobachtet und lagen dann ebenfalls einzeln vor (Abb. 9 D). Eine Ansammlung von
eosinophilen Granulozyten in Form von Clustern konnte nicht festgestellt werden.
Da es zwischen den Probezeitpunkten K1 – K3 in der Lokalisation der eosinophilen
Granulozyten in der Tunica muscularis und der Tunica serosa keine Unterschiede
gab, sind die folgenden lichtmikroskopischen Aufnahmen repräsentativ für die Lage
der eosinophilen Granulozyten in den einzelnen Schichten.
88

Ergebnisse
RM
RM
A
IM
B
RM
IM
LM
C
IM
LM
D
LM
LM
S
E
F
Abb. 9: Lunafärbung - Repräsentative Darstellung der eosinophilen Granulozyten in
der Tunica muscularis und Tunica serosa
A, B: eosinophiler Granulozyt in der Ringmuskelschicht
C: intravaskulärer eosinophiler Granulozyt in der intermuskulären Schicht
D: intravaskulärer eosinophiler Granulozyt in der Längsmuskelschicht
E: eosinophile Granulozyten in der Längsmuskelschicht
F: perivaskulär gelegener eosinophiler Granulozyt in der Serosa
A, B: R1; C: K2; D, E: K1; F: K3
A, C, E: 200-Fache Vergrößerung; B, D, F: 400-Fache Vergrößerung
89

Ergebnisse
4.1.2 Quantifizierung der eosinophilen Granulozyten
Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit Unterstützung von Dr. K. Rohn,
Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung, Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover.
Die statistische Berechnung der Daten wurde mit dem Statistikprogramm SAS,
Version 9.3 (SAS Institute, Cary, NC) durchgeführt. Die Auswertung des linearen
Modells erfolgte mit der Prozedur „MIXED“. Dabei wurden
Irrtumswahrscheinlichkeiten von p ≤ 0,05 berücksichtigt.
Die Annahme auf Normal- bzw. Lognormalverteilung der quantitativen Merkmale
wurde mittels Kolmogorov-Smirnov-Test und visueller Beurteilung der qq-plots der
Modellresiduen geprüft. Die eosinophilen Granulozyten waren in den einzelnen
Schichten (Ringmuskelschicht, intermuskuläre Schicht, Längsmuskelschicht, Tunica
serosa) weder normal- noch log-normalverteilt. Aufgrund dessen wurde die
Zellanzahl zu den Probezeitpunkten 1-7 innerhalb der einzelnen Schichten mit Hilfe
des Permutationstests, einem verteilungsfreien Test für Stichproben mit
Messwiederholungen (repeatedmeasurements), miteinander verglichen. Zum
Vergleich des Einflusses der NSAIDs Flunixin-Meglumin und Firocoxib auf die
Zellanzahl in den einzelnen Schichten wurde der Wilcoxon´s-two-sample Test
eingesetzt. Für die graphische Darstellung wurde eine Dichotomisierung der Werte
vorgenommen und diese dann im Säulendiagramm dargestellt.
4.1.2.1 Tunica muscularis
In der zirkulären Muskelschicht war die Anzahl der eosinophilen Granulozyten pro
Quadratmillimeter in keiner Probe signifikant erhöht (Abb. 10 links). Beim Vergleich
der Medikamente Firocoxib sowie Flunixin-Meglumin ergab sich kein signifikanter
Unterschied (p > 0,05) (Abb. 10 rechts).
90

Ergebnisse
Abb. 10: Eosinophile Granulozyten pro mm 2 in der zirkulären Muskelschicht
Abb. links: eosinophile Granulozyten pro mm² in der zirkulären Muskelschicht zu den 7
Probeentnahmezeitpunkten
K1 = Kontrolle 1, I1 = Ischämie 1, R1 = Reperfusion 1, K2 = Kontrolle 2, I2 = Ischämie 2
+ NSAID, R2 = Reperfusion 2 + NSAID, K3 = Kontrolle 3 + NSAID; Proben die mit
einem NSAID behandelt wurden
Abb. rechts: eosinophile Granulozyten pro mm² in der zirkulären Muskelschicht zu den
Probeentnahmezeitpunkten 4 bis 7
K2 = Kontrolle 2, I2 + FC = Ischämie 2 + Firocoxib, I2 + FM = Ischämie 2 + Flunixin-
Meglumin, R2 + FC = Reperfusion 2 + Firocoxib, R2 + FM = Reperfusion 2 + Flunixin-
Meglumin, K3 + FC = Kontrolle 3 + Firocoxib; K3 + FM = Kontrolle 3 + Flunixin-Meglumin
mit Firocoxib behandelte Probanden, mit Flunixin-Meglumin behandelte Probanden
Abb. links und rechts: dargestellt sind der Mittelwert und die Standardabweichung
In der intermuskulären Schicht war die Anzahl der eosinophilen Granulozyten pro
Quadratmillimeter in keiner Probe signifikant erhöht (Abb. 11). Beim Vergleich der
Medikamente Firocoxib sowie Flunixin-Meglumin ergab sich kein signifikanter
Unterschied (p > 0,05).
91

Ergebnisse
Abb. 11: Eosinophile Granulozyten pro mm 2 in der intermuskulären Schicht
Eosinophile Granulozyten pro mm² in der intermuskulären Schicht zu den 7
Probeentnahmezeitpunkten
K1 = Kontrolle 1, I1 = Ischämie 1, R1 = Reperfusion 1, K2 = Kontrolle 2, I2 = Ischämie 2
+ NSAID, R2 = Reperfusion 2 + NSAID, K3 = Kontrolle 3 + NSAID
dargestellt sind der Mittelwert und die Standardabweichung
In der longitudinalen Muskelschicht war die Anzahl der eosinophilen Granulozyten
pro Quadratmillimeter in keiner Probe signifikant erhöht (Abb. 12 links). Beim
Vergleich der Medikamente Firocoxib sowie Flunixin-Meglumin ergab sich kein
signifikanter Unterschied (p > 0,05) (Abb. 12 rechts).
92

Ergebnisse
Abb. 12: Eosinophile Granulozyten pro mm 2 in der longitudinalen Muskelschicht
Abb. links: eosinophile Granulozyten pro mm² in der longitudinalen Muskelschicht zu
den 7 Probeentnahmezeitpunkten
K1 = Kontrolle 1, I1 = Ischämie 1, R1 = Reperfusion 1, K2 = Kontrolle 2, I2 = Ischämie 2
+ NSAID, R2 = Reperfusion 2 + NSAID, K3 = Kontrolle 3 + NSAID; Proben die mit
einem NSAID behandelt wurden
Abb. rechts: eosinophile Granulozyten pro mm² in der longitudinalen Muskelschicht zu
den Probeentnahmezeitpunkten 4 bis 7
K2 = Kontrolle 2, I2 + FC = Ischämie 2 + Firocoxib, I2 + FM = Ischämie 2 + Flunixin-
Meglumin, , R2 + FC = Reperfusion 2 + Firocoxib, R2 + FM = Reperfusion 2 + Flunixin-
Meglumin, K3 + FC = Kontrolle 3 + Firocoxib; K3 + FM = Kontrolle 3 + Flunixin-
Meglumin;
mit Firocoxib behandelte Probanden, mit Flunixin-Meglumin behandelte Probanden
Abb. links und rechts: dargestellt sind der Mittelwert und die Standardabweichung
4.1.2.2 Tunica serosa
Die Anzahl der eosinophilen Granulozyten pro Quadratmillimeter war in der Tunica
serosa in keiner Probe signifikant erhöht (Abb. 13 links). Beim Vergleich der
Medikamente Firocoxib sowie Flunixin-Meglumin ergab sich aber ein signifikanter
Unterschied bei Probe R2. In den mit Flunixin-Meglumin behandelten Pferden
wurden signifikant mehr eosinophile Granulozyten festgestellt als bei den mit
Firocoxib behandelten Pferden (p = 0,028) (Abb. 13 rechts).
93

Ergebnisse
Abb. 13: Eosinophile Granulozyten pro mm 2 in der Tunica serosa
Abb. links: eosinophile Granulozyten pro mm² in der Tunica serosa zu den 7
Probeentnahmezeitpunkten
K1 = Kontrolle 1, I1 = Ischämie 1, R1 = Reperfusion 1, K2 = Kontrolle 2, I2 = Ischämie 2
+ NSAID, R2 = Reperfusion 2 + NSAID, K3 = Kontrolle 3 + NSAID; Proben die mit
einem NSAID behandelt wurden
Abb. rechts: eosinophile Granulozyten pro mm² in der zirkulären Muskelschicht zu den
Probeentnahmezeitpunkten 4 bis 7
K2 = Kontrolle 2, I2 + FC = Ischämie 2 + Firocoxib, I2 + FM = Ischämie 2 + Flunixin-
Meglumin, R2 + FC = Reperfusion 2 + Firocoxib, R2 + FM = Reperfusion 2 + Flunixin-
Meglumin, K3 + FC = Kontrolle 3 + Firocoxib; K3 + FM = Kontrolle 3 + Flunixin-
Meglumin; mit Firocoxib behandelte Probanden, mit Flunixin-Meglumin behandelte
Probanden
C: signifikant zu c
Abb. links und rechts: dargestellt sind der Mittelwert und die Standardabweichung
4.2 Immunhistochemie
4.2.1 Calprotectin
4.2.1.1 Deskription
4.2.1.1.1 Kontrolle 1 (K1) – ungeschädigtes Jejunum 1
In den ungeschädigten Jejunumproben 1 konnten im überwiegenden Teil der
beurteilten Gesichtsfelder sowohl in der Tunica muscularis als auch in der Tunica
serosa keine Calprotectin positiven Zellen beobachtet werden. In etwa 20 % der
beurteilten Gesichtsfelder wurden wenige, vereinzelt liegende Calprotectin positive
94

Ergebnisse
Zellen festgestellt, ohne Präferenz zu einer bestimmten Schicht. Bei zwei Pferden
befanden sich diese positiven Zellen in allen beurteilten Schichten. In einem Pferd
befanden sich Calprotectin positive Zellen diffus in der Längsmuskelschicht und der
Tunica serosa. In der Tunica serosa konnte zusätzlich ein Zellcluster festgestellt
werden. In einem weiteren Pferde wurden Calprotectin positive Zellen multifokal in
der Tunica serosa bzw. Längsmuskelschicht festgestellt. Weitere Zellcluster gab es
in der ungeschädigten Jejunumprobe nicht.
4.2.1.1.2 Ischämisch geschädigtes Jejunum (I1)
In den ischämisch geschädigten Proben waren im überwiegenden Teil der Proben
Calprotectin positive Zellen vorhanden. Es handelte sich um wenige Zellen, die
häufig intra- oder perivaskulär lagen und zum größten Teil vereinzelt vorkamen. Bei
drei Pferden konnte mehrfach eine multifokale Verteilung beobachtet werden, diese
kam am wenigsten in der Ringmuskelschicht vor. Zwischen den anderen drei
Schichten gab es keine deutlichen Unterschiede. Bei drei Pferden waren Zellcluster
vorhanden, wobei in der Ringmuskelschicht insgesamt nur ein und in den anderen
Schichten mehrere festgestellt wurden (Abb. 14 B). Ein Pferd hatte ein Cluster in der
Längsmuskelschicht. Ein weiteres hatte auffällig viele Cluster in der Tunica serosa.
Dieser Proband war in der ungeschädigten Kontrollprobe ebenfalls auffällig
(vereinzelte Calprotectin positive Zellen in fast allen beurteilten Ausschnitten). Das
dritte Pferd hatte Cluster in allen Schichten außer der Tunica serosa. Dabei handelte
es sich um dasselbe Pferd, dass auch schon in der ungeschädigten Kontrollprobe mit
einem Cluster in der Tunica serosa und diffuser Zellverteilung auffiel. Zusätzlich
wurde bei dem Pferd am mesothelialen Rand der Tunica serosa ein Zellsaum aus
Calprotectin positiven Zellen sowie eine vermehrte Orientierung der positiven Zellen
zum Mesothel festgestellt. Diese Zellverteilung wurde bei keinem anderen
Probanden festgestellt. Die positiven Zellen in der Tunica serosa lagen in allen
anderen Proben in der Nähe der Längsmuskelschicht bis zur Mitte der Tunica serosa
oder waren gleichmäßig über die gesamte Serosabreite verteilt.
Die beschriebenen Zellcluster und der beschriebene Zellsaum aus Calprotectin
positiven Zellen am Mesothel der Tunica serosa ist auch zu allen folgenden
Probezeitpunkten festgestellt worden. Deswegen sind im Folgenden exemplarische
95

Ergebnisse
Bilder von Zellclustern und einem Zellsaum aus Calprotectin positiven Zellen zu
verschiedenen Probezeitpunkten dargestellt.
IM
LM
LM
80μm x 80μm
80μm x 80μm
80μm x 80μm
S
S
A
B
200 μm
LM
LM
S
S
C
D
200 μm 200 μm
Abb. 14: Immunhistochemische Darstellung von Zellclustern und Zellsaum der
neutrophilen Granulozyten am equinen Jejunum
A: Cluster aus neutrophilen Granulozyten in der Längsmuskelschicht
B: Cluster aus neutrophilen Granulozyten in der Tunica serosa, der
Längsmuskelschicht anliegend
C, D: Saum aus neutrophilen Granulozyten am mesothelialen Rand der Tunica serosa
A: R2; B: I2; C: K2; D: K3
A, B, C, D: 100-Fache Vergrößerung
4.2.1.1.3 Durch Ischämie und Reperfusion geschädigtes Jejunum (R1)
In den durch Ischämie und Reperfusion geschädigten Proben wurde sowohl in der
Tunica muscularis als auch Tunica serosa ein Anstieg der Zellanzahl im Vergleich zu
den Proben von ungeschädigtem (K1) und ischämisch geschädigtem Jejunum (I1)
festgestellt. In fast allen Gesichtsfeldern waren Calprotectin positive Zellen
vorhanden. Wenige zellfreie Gesichtsfelder gab es nur in der Ringmuskelschicht
sowie in der intermuskulären Schicht. Außerdem zeigte sich beim Vergleich der
96

Ergebnisse
einzelnen Schichten eine unterschiedliche Verteilung der Zellen. In der
Ringmuskelschicht lagen die Zellen vereinzelt vor (Abb. 15 A und B), zweimal wurde
eine multifokale Verteilung beobachtet. In der intermuskulären Schicht war zu etwa
gleichen Teilen eine vereinzelte Lage bzw. eine multifokale Verteilung der Zellen
vorhanden. In der Längsmuskelschicht und der Tunica serosa herrschte eine
multifokale Verteilung vor. Teilweise wurde eine diffuse Verteilung festgestellt,
vereinzelte Zellen wurden selten beobachtet. Bei multifokaler Verteilung in der
Längsmuskelschicht befanden sich die Zellen vor allem im Bindegewebe zwischen
den glatten Muskelzellen (Abb. 15 C und D). Bei multifokaler Verteilung in der Tunica
serosa waren die Zellansammlungen in der Regel zur Längsmuskelschicht orientiert
und „schmiegten“ sich dieser an, häufig waren in dem zum Mesothel orientierten
Serosadrittel keine Zellen vorhanden. Bei diffuser Verteilung in der Tunica serosa
waren die Zellen über die gesamte Serosabreite verteilt. Einen deutlichen
Unterschied gab es in der Anzahl der Cluster. In der Ringmuskelschicht befanden
sich keine clusterförmigen Zellansammlungen, in der intermuskulären Schicht wiesen
zwei Pferde ein bzw. zwei Cluster auf. Die zwei Cluster befanden sich bei dem Pferd,
welches bereits in den beiden ersten Probezeitpunkten (K1 und I1) Cluster aufwies.
Fünf Pferde hatten Cluster in der Längsmuskelschicht und neun Pferde in der Tunica
serosa, wobei die Gesamtclusterzahl in der Tunica serosa mehr als doppelt so hoch
war, wie in der Längsmuskelschicht. Ein Saum aus Calprotectin positiven Zellen am
mesothelialen Rand der Tunica serosa wurde bei demselben Pferd wie bei
Probezeitpunkt I1 festgestellt.
Die folgende Abbildung zeigt das für die Ring- und Längsmuskelschicht typische
Verteilungsmuster der Calprotectin positiven Zellen ab Probezeitpunkt R1 im
Vergleich.
97

Ergebnisse
RM
RM
A
IM
200 μm
B
IM
200 μm
LM
LM
C
D
Abb. 15: Immunhistochemische Darstellung der neutrophilen Granulozyten am
equinen Jejunum in der Ring- und Längsmuskelschicht in den Reperfusionsproben
A, B: vereinzelt neutrophile Granulozyten im Bindegewebe der Ringmuskelschicht
C: multifokale Verteilung von neutrophilen Granulozyten im Bindegewebe
Längsmuskelschicht
D: clusterförmige Ansammlung von neutrophilen Granulozyten im Bindegewebe der
Längsmuskelschicht
A, B: R2; C, D: R1
A, B, C, D: 100-Fache Vergrößerung
4.2.1.1.4 Kontrolle 2 (K2) – ungeschädigtes Jejunum 2
Die ungeschädigten Jejunumproben 2 (K2) unterschieden sich deutlich von den
ungeschädigten Jejunumproben 1 (K1). Es waren im überwiegenden Anteil der
Gesichtsfelder Calprotectin positive Zellen vorhanden. Insgesamt kam es zu einer
deutlichen Zunahme der Zellanzahl in allen Schichten (Ringmuskelschicht,
intermuskuläre Schicht, Längsmuskelschicht, Tunica serosa). Etwa die Hälfte der
Gesichtsfelder der Ringmuskelschicht und wenige der Gesichtsfelder in der
intermuskulären Schicht wiesen keine Zellen auf.
98

Ergebnisse
Wie in den durch Ischämie und Reperfusion geschädigten Proben (R1) war die
Zellverteilung zwischen den Schichten unterschiedlich. In der Ringmuskelschicht und
der intermuskulären Schicht lagen die Zellen zum größten Teil vereinzelt, selten
multifokal vor. In der Längsmuskelschicht lagen die Zellen etwa zur Hälfte vereinzelt
vor (Abb. 16 B) und zur anderen Hälfte waren sie multifokal bis diffus verteilt (Abb. 16
A). In der Tunica serosa waren die Zellen fast ausschließlich diffus und in wenigen
Gesichtsfeldern multifokal verteilt (Abb. 16 A und B). Sowohl bei multifokaler als auch
bei diffuser Verteilung der Zellen in der Tunica serosa war die Zellanordnung wie bei
der Ischämie-Reperfusionsprobe (R1) beschrieben. In vier Proben wurde außerdem
ein Zellsaum aus Calprotectin positiven Zellen am mesothelialen Rand der Tunica
serosa festgestellt. Zellcluster waren in fünf Proben vorhanden, am häufigsten in der
Tunica serosa und der Längsmuskelschicht und jeweils nur einmal in der
intermuskulären Schicht und der Ringmuskelschicht.
IM
IM
LM
LM
S
A
200 μm
S
B
200 μm
Abb. 16: Immunhistochemische Darstellung der neutrophilen Granulozyten am
equinen Jejunum in den ungeschädigten Jejunumproben 2 (K2)
A: neutrophile Granulozyten multifokal in der Tunica serosa, multifokal im
Bindegewebe der Längsmuskelschicht
B: neutrophile Granulozyten diffus in der Tunica serosa und vereinzelt im
Bindegewebe der Längsmuskelschicht
A, B: K2
A, B: 100-Fache Vergrößerung
99

Ergebnisse
4.2.1.1.5 Ischämisch geschädigtes und mit einem NSAID behandeltes Jejunum
(I2)
Die Proben vom ischämisch geschädigten und mit einem NSAID behandelten
Jejunum unterschieden sich ebenfalls deutlich von den Vergleichsproben I1. So gab
es in der Ring- und Längsmuskelschicht sowie in der intermuskulären Schicht jeweils
nur zwei Gesichtsfelder, die keine Zellen aufwiesen. In der Ringmuskelschicht lagen
die Zellen vereinzelt vor, bis auf zwei Pferde mit diffuser bzw. multifokaler Verteilung.
In der intermuskulären Schicht waren die positiven Zellen zu gleichen Teilen
vereinzelt bzw. multifokal verteilt. In der Längsmuskelschicht lagen die Zellen zum
größten Teil vereinzelt vor, eine diffuse Verteilung wurde mehrfach beobachtet und
ein Pferd zeigte eine multifokale Zellverteilung. In der Tunica serosa dominierte die
diffuse Verteilung, es gab aber auch einige Gesichtsfelder mit vereinzelten Zellen
und ein Pferd mit multifokaler Verteilung. Eine intra- bzw. perivaskuläre Lage der
Zellen wie in der Vergleichsprobe (I1) konnte in den meisten Proben beobachtet
werden, war aber nicht so eindeutig. Vor allem in der Tunica serosa lagen viele
positive Zellen frei im Gewebe. Cluster gab es im Gegensatz zu der Vergleichsprobe
(I1) bei wesentlich mehr Pferden (sieben Pferde bei I2 im Vergleich zu drei Pferden
bei I1). Diese dominierten deutlich in der intermuskulären Schicht sowie der Tunica
serosa und wurden nur selten in der Ring- sowie Längsmuskelschicht beobachtet.
Bei fünf Pferden wurde ein Zellsaum aus Calprotectin positiven Zellen am
mesothelialen Rand der Tunica serosa festgestellt, zwei davon waren die gleichen
wie in den ungeschädigten Jejunumproben 2 (K2).
4.2.1.1.6 Durch Ischämie und Reperfusion geschädigtes und mit einem NSAID
behandeltes Jejunum (R2)
Der Unterschied zwischen den durch Ischämie und Reperfusion geschädigten und
mit einem NSAID behandelten Proben (R2) und den Vergleichsproben ohne
systemische Behandlung mit einem NSAID (R1) war nicht so stark, wie es bei den
Probezeitpunkten K2 und I2 und deren Vergleichsproben K1 und I1 beobachtet
wurde. In der Ringmuskelschicht lagen die positiven Zellen wie in der ersten
Ischämie- und Reperfusionsprobe (R1) zum größten Teil vereinzelt vor, aber es gab
auch mehrere Gesichtsfelder mit multifokaler sowie ein Pferd mit diffuser
Zellverteilung in allen Schichten (Ringmuskelschicht, intermuskuläre Schicht,
100

Ergebnisse
Längsmuskelschicht, Tunica serosa). In der intermuskulären Schicht überwog die
multifokale Verteilung, in einigen Gesichtsfeldern lagen die Zellen vereinzelt vor. In
der Vergleichsprobe (R1) war das Verhältnis zwischen vereinzelt liegenden Zellen
und einer multifokalen Verteilung hingegen ausgeglichen. In der Längsmuskelschicht
waren die Zellen vor allem multifokal verteilt, in wenigen Gesichtsfeldern wurde eine
diffuse Verteilung bzw. vereinzelt liegende Zellen festgestellt. Dieses
Verteilungsmuster entsprach dem der Vergleichsprobe (R1). In der Tunica serosa
dominierte eine diffuse Lage der Zellen, in den übrigen Gesichtsfeldern lagen sie
multifokal vor. Dieses war in der Vergleichsprobe (R1) umgekehrt, es dominierte eine
multifokale Zellverteilung und in den restlichen Gesichtsfeldern lagen die Zellen diffus
vor. In den durch Ischämie und Reperfusion geschädigten und mit einem NSAID
behandelten Proben (R2) waren im Vergleich zu allen anderen Probezeitpunkten
(K1, I1, R1, K2, I2) die meisten Zellcluster vorhanden. In der Ringmuskelschicht
wurden 2, in der intermuskulären Schicht sowie Tunica serosa 15 bzw. 16 und in der
Längsmuskelschicht 23 Zellcluster festgestellt (Abb. 14 A). Dies ist auch eine
deutliche Zunahme an Clustern im Vergleich zur vorangegangenen Ischämieprobe
(I2) und der ersten Ischämie-Reperfusionsprobe (R1). Ein Saum aus Calprotectin
positiven Zellen am mesothelialen Rand der Tunica serosa wurde in zwei Proben
beobachtet, eine davon hatte diesen auch in der I2 Probe.
4.2.1.1.7 Kontrolle 3 (K3) – ungeschädigtes Jejunum 3
Der Unterschied zwischen den Kontrollprobe K3 und K1 war noch deutlicher als
zwischen den Kontrollproben K2 und K1. In der Ringmuskelschicht sowie der
intermuskulären Schicht gab es nur noch wenige zellfreie Gesichtsfelder. Die Zellen
lagen wie in den beiden anderen ungeschädigten Jejunumproben (K1 und K2) in
beiden Schichten überwiegend vereinzelt vor. In der intermuskulären Schicht gab es
wie bei Probe K2 aber auch einige multifokale Verteilungsmuster. In der
Längsmuskelschicht lag wie in den zweiten ungeschädigten Jejunumproben (K2) ein
relativ gemischtes Bild vor. Vereinzelt und diffus liegende Zellen waren zu etwa
gleichen Teilen zu beobachten, eine multifokale Verteilung wurde in wenigen Fällen
beobachtet (Abb. 17 A und B). Genau wie bei Probe K2 herrschte in der Tunica
serosa die diffuse Zellverteilung vor (Abb. 17 B). Derselbe Proband wie in Probe I2
101

Ergebnisse
wies in allen Schichten (Ringmuskelschicht, intermuskuläre Schicht,
Längsmuskelschicht, Tunica serosa) eine diffuse Zellverteilung auf. In der Zahl der
Zellcluster gab es keinen deutlichen Unterschied und in der Verteilung der Cluster
auf die einzelnen Schichten gab es geringfügige Unterschiede zu den zweiten
Kontrollproben (K2). So gab es kein Zellcluster in der Ringmuskelschicht. Die
meisten lagen in der Längsmuskelschicht, gefolgt von der Tunica serosa. In den
zweiten Kontrollproben (K2) lagen die meisten Zellcluster in der Tunica serosa,
gefolgt von der Längsmuskelschicht. Ein Saum aus Calprotectin positiven Zellen am
mesothelialen Rand der Tunica serosa wurde in vier Proben beobachtet (Abb. 14 D),
zwei davon hatten diesen auch in den zweiten Kontrollproben (K2).
IM
LM
LM
S
A
B
200 μm 200 μm
Abb. 17: Immunhistochemische Darstellung der neutrophilen Granulozyten am
equinen Jejunum in den ungeschädigten Jejunumproben 3 (K3)
A: neutrophile Granulozyten vereinzelt im interstitiellen Bindegewebe der
Längsmuskelschicht
B: neutrophile Granulozyten diffus in der Tunica serosa und multifokal im interstitiellen
Bindegewebe der Längsmuskelschicht
A, B: K3
A, B: 100-Fache Vergrößerung
In der deskriptiven Untersuchung der Proben I2, R2 und K3 konnte kein Unterschied
zwischen den Behandlungen mit Flunixin-Meglumin und Firocoxib festgestellt
werden.
102

Ergebnisse
Zusammenfassend ist Folgendes festzustellen:
1. In der Ringmuskelschicht lagen die Calprotectin positiven Zellen im
interstitiellen Bindegewebe und bis auf wenige Ausnahmen einzeln vor. Häufig
wurde eine perlschnurartige Anordnung mit breiten Abständen beobachtet.
Zellcluster waren selten.
2. In der Längsmuskelschicht lagen die Calprotectin positiven Zellen im
interstitiellen Bindegewebe und waren häufig multifokal bis diffus angeordnet.
Es befanden sich deutlich mehr Zellen im interstitiellen Bindegewebe der
Längsmuskelschicht als im interstitiellen Bindegewebe der Ringmuskelschicht.
Die Zellen schienen häufig von der Tunica serosa in das interstitielle
Bindegewebe der Längsmuskelschicht hineinzuziehen, teilweise wurde dieses
auch von der intermuskulären Schicht ausgehend beobachtet.
3. Zellcluster wurden zu jedem Probeentnahmezeitpunkt festgestellt (Ausnahme
K1). In den Ischämieproben kam es zu einem Anstieg der Zellcluster im
Vergleich mit den Kontrollproben. Die meisten Cluster befanden sich in den
Reperfusionsproben. Beim Vergleich aller Schichten (Ringmuskelschicht,
intermuskuläre Schicht, Längsmuskelschicht, Tunica serosa) befanden sich in
der Tunica serosa und der Längsmuskelschicht die meisten Cluster. Beim
Vergleich der beiden Muskelschichten befanden sich in der
Längsmuskelschicht mehr Cluster als in der Ringmuskelschicht.
4. In der Tunica serosa wurde eine multifokale Zellverteilung, die sich häufig in
clusterförmigen Zellansammlungen widerspiegelte, vor allem in dem zur
Längsmuskelschicht gelegenen Bereich der Tunica serosa beobachtet. Häufig
„schmiegten“ sich die Zellansammlungen der Längsmuskelschicht regelrecht
an.
5. Zellansammlungen in Form eines Zellsaums aus Calprotectin positiven Zellen
wurden nur am mesothelialen Rand der Tunica serosa beobachtet. In diesen
Proben war auch häufig ein Teil der Zellen vermehrt zum mesothelialen Rand
der Tunica serosa orientiert. Die Anzahl an Proben, die einen Zellsaum
aufwiesen, nahm ab Probezeitpunkt K2 zu. Das Vorkommen eines Zellsaums
103

Ergebnisse
kam bei manchen Pferden in zwei Proben, bei anderen auch nur in einer vor.
Bei drei Pferden wurde in keiner Probe ein Zellsaum festgestellt.
6. Bei den Kontrollproben K2 und K3, die jeweils von einem makroskopisch
ungeschädigten Darmabschnitt genommen wurden und sich in einem Abstand
von einem Meter voneinander befanden, konnte eine deutliche Zunahme der
Zellinfiltration im Vergleich zu der Kontrollprobe K1 beobachtet werden
(inklusive clusterförmiger Zellansammlung und Zellsaum), obwohl keine von
den Proben zuvor manipuliert wurde.
4.2.1.2 Negativ- und Isotypenkontrolle
Die Negativ- und Isotypenkontrolle des MAC 387-Antikörpers (Calprotectin) zeigten
keine Reaktionen (Abb. 18).
RM
IM
S
LM
A
B
RM
IM
S
LM
C
D
Abb. 18: Repräsentative Negativ- und Isotypenkontrolle MAC 387 (Calprotectin)
A, B: Negativkontrolle MAC 387
C, D: Isotypenkontrolle (Maus IgG)
A, B, C, D: R1
A, B, C, D: 100-Fache Vergrößerung
104

Ergebnisse
4.2.1.3 Quantifizierung der neutrophilen Granulozyten
Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit Unterstützung von Dr. K. Rohn,
Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung, Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover.
Die statistische Berechnung der Daten wurde mit dem Statistikprogramm SAS,
Version 9.3 (SAS Institute, Cary, NC) durchgeführt. Die Auswertung des linearen
Modells erfolgte mit der Prozedur „MIXED“. Dabei wurden
Irrtumswahrscheinlichkeiten von p ≤ 0,05 berücksichtigt.
Für die Modellresiduen der neutrophilen Granulozyten wurde eine log-
Normalverteilung bestätigt. Ein Globalvergleich der einzelnen Schichten war
aufgrund signifikanter Wechselwirkung mit den innerhalb-Schicht-Messungen nicht
möglich. Deshalb erfolgte nach Schichten stratifiziert ein multipler Vergleich der
Zellanzahl innerhalb der Schichten mit Hilfe des Dunnett-Tests. Es wurde jeweils
überprüft ob Probe I1, R1, K2 und K3 eine signifikante Erhöhung zu Probe K1 und ob
Probe I2, R2 und K3 eine signifikante Erhöhung zu Probe K2 zeigen. Die beiden
NSAIDs wurden in einem zweifaktoriellen Vergleich mit Hilfe des Tukey-Kramer-Test
verglichen. Beim Vergleich der Medikamente Firocoxib sowie Flunixin-Meglumin
ergab sich in keiner Schicht ein signifikanter Unterschied (p > 0,05). Die Verteilung
der neutrophilen Granulozyten pro Quadratmillimeter ist mit Hilfe von Box-Plot
Diagrammen dargestellt.
4.2.1.3.1 Tunica muscularis
Die zirkuläre Muskelschicht war die Schicht in der am wenigsten neutrophile
Granulozyten festgestellt wurden. Die Anzahl der neutrophilen Granulozyten pro mm²
zirkulärer Muskelschicht stieg nach der Reperfusion in beiden Ischämie-
Reperfusionsmodellen signifikant an (R1 > K1, p = 0,0036 und R2 > K2, p < 0,0001).
Im zeitlichen Verlauf des Versuches kam es ebenfalls zu einem Anstieg der
neutrophilen Granulozyten in den Kontrollproben (K2 > K1, p = 0,0997; K3 > K1, p <
0,0001; K3 > K2, p = 0,0059). Die Anzahl der neutrophilen Granulozyten pro mm²
war in Probe R1 und K3 signifikant erhöht zu Probe K1(p = 0,0036 bzw. p < 0,0001)
sowie in Probe R2 und K3 signifikant erhöht zu Probe K2 (p = 0,0001 bzw. p =
105

Ergebnisse
0,0059) (Abb. 19). Beim Vergleich der Medikamente Firocoxib sowie Flunixin-
Meglumin ergab sich kein signifikanter Unterschied (p > 0,05) (Abb. 20).
Abb. 19: Neutrophile Granulozyten pro mm 2 in der zirkulären Muskelschicht
Neutrophile Granulozyten pro mm² in der zirkulären Muskelschicht zu den 7
Probeentnahmezeitpunkten
K1 = Kontrolle 1, I1 = Ischämie 1, R1 = Reperfusion 1, K2 = Kontrolle 2, I2 = Ischämie 2
+ NSAID, R2 = Reperfusion 2 + NSAID, K3 = Kontrolle 3 + NSAID; Proben die mit
einem NSAID behandelt wurden
dargestellt ist das Minimum und Maximum, der Median, sowie das obere und untere
Quartil
A = signifikant im Vergleich zu a; B = signifikant im Vergleich zu b
106

Ergebnisse
Abb. 20: Vergleich des Einflusses von Flunixin-Meglumin und Firocoxib auf die Anzahl
neutrophiler Granulozyten pro mm 2 in der zirkulären Muskelschicht
Neutrophile Granulozyten pro mm² in der zirkulären Muskelschicht zu den
Probeentnahmezeitpunkten K2 bis K3
K2 = Kontrolle 2, I2 + FC = Ischämie 2 + Firocoxib, I2 + FM = Ischämie 2 + Flunixin-
Meglumin, R2 + FC = Reperfusion 2 + Firocoxib, R2 + FM = Reperfusion 2 + Flunixin-
Meglumin, K3 + FC = Kontrolle 3 + Firocoxib; K3 + FM = Kontrolle 3 + Flunixin-Meglumin
mit Firocoxib behandelte Probanden, mit Flunixin-Meglumin behandelte Probanden
dargestellt ist das Minimum und Maximum, der Median sowie das obere und untere
Quartil
In der intermuskulären Schicht stieg die Anzahl der neutrophilen Granulozyten pro
mm² intermuskulärer Schicht nach der Reperfusion in beiden Ischämie-
Reperfusionsmodellen signifikant an (R1 > K1, p < 0,0001 und R2 > K2, p = 0,0081).
Im zeitlichen Verlauf des Versuches kam es ebenfalls zu einem signifikanten Anstieg
der neutrophilen Granulozyten in den Kontrollproben (K2 > K1, p < 0,0001; K3 > K1,
p < 0,0001; K3 > K2, p = 0,0064). Die Anzahl der neutrophilen Granulozyten pro mm²
intermuskulärer Schicht war in Probe R1, K2 und K3 signifikant erhöht zu Probe K1
(p < 0,0001 bzw. p < 0,0001 bzw. p < 0,0001) sowie in Probe K3 signifikant erhöht zu
Probe K2 (p = 0,0064) (Abb. 21). Beim Vergleich der Medikamente Firocoxib sowie
Flunixin-Meglumin ergab sich kein signifikanter Unterschied (p > 0,05) (Abb. 22).
107

Ergebnisse
Abb. 21: Neutrophile Granulozyten pro mm 2 in der intermuskulären Schicht
Neutrophile Granulozyten pro mm² in der intermuskulären Schicht zu den 7
Probeentnahmezeitpunkten
K1 = Kontrolle 1, I1 = Ischämie 1, R1 = Reperfusion 1, K2 = Kontrolle 2, I2 = Ischämie 2
+ NSAID, R2 = Reperfusion 2 + NSAID, K3 = Kontrolle 3 + NSAID; Proben die mit
einem NSAID behandelt wurden
dargestellt ist das Minimum und Maximum, der Median sowie das obere und untere
Quartil
A = signifikant im Vergleich zu a; B = signifikant im Vergleich zu b
108

Ergebnisse
Abb. 22: Vergleich des Einflusses von Flunixin-Meglumin und Firocoxib auf die Anzahl
neutrophiler Granulozyten pro mm 2 in der intermuskulären Schicht
Neutrophile Granulozyten pro mm² in der intermuskulären Schicht zu den
Probeentnahmezeitpunkten K2 bis K3
K2 = Kontrolle 2, I2 + FC = Ischämie 2 + Firocoxib, I2 + FM = Ischämie 2 + Flunixin-
Meglumin, , R2 + FC = Reperfusion 2 + Firocoxib, R2 + FM = Reperfusion 2 + Flunixin-
Meglumin, K3 + FC = Kontrolle 3 + Firocoxib; K3 + FM = Kontrolle 3 + Flunixin-Meglumin
mit Firocoxib behandelte Probanden, mit Flunixin-Meglumin behandelte Probanden
dargestellt ist das Minimum und Maximum, der Median sowie das obere und untere
Quartil
In der Längsmuskelschicht stieg die Anzahl der neutrophilen Granulozyten pro mm²
Gewebe nach der Reperfusion in beiden Ischämie-Reperfusionsmodellen an (R1 >
K1, p < 0,0001 und R2 > K2, p = 0,6693). Im zeitlichen Verlauf des Versuches kam
es ebenfalls zu einem Anstieg der neutrophilen Granulozyten in den Kontrollproben
(K2 > K1, p < 0,0001; K3 > K1, p < 0,0001; K3 > K2, p = 0,1840). Die Anzahl der
neutrophilen Granulozyten pro mm² Längsmuskelschicht war in Probe R1, K2 und K3
signifikant erhöht zu Probe K1 (p < 0.0001 bzw. p < 0,0001 bzw. p < 0,0001), zu
Probe K2 gab es keine signifikanten Erhöhungen in der Zellanzahl (Abb. 23). Beim
Vergleich der Medikamente Firocoxib sowie Flunixin-Meglumin ergab sich kein
signifikanter Unterschied (p > 0,05) (Abb. 24).
109

Ergebnisse
Abb. 23: Neutrophile Granulozyten pro mm 2 in der longitudinalen Muskelschicht
Neutrophile Granulozyten pro mm² in der longitudinalen Muskelschicht zu den 7
Probeentnahmezeitpunkten
K1 = Kontrolle 1, I1 = Ischämie 1, R1 = Reperfusion 1, K2 = Kontrolle 2, I2 = Ischämie 2
+ NSAID, R2 = Reperfusion 2 + NSAID, K3 = Kontrolle 3 + NSAID; Proben die mit
einem NSAID behandelt wurden
dargestellt ist das Minimum und Maximum, der Median sowie das obere und untere
Quartil
A = signifikant im Vergleich zu a
110

Ergebnisse
Abb. 24: Vergleich des Einflusses von Flunixin-Meglumin und Firocoxib auf die Anzahl
neutrophiler Granulozyten pro mm 2 in der longitudinalen Muskelschicht
Neutrophile Granulozyten pro mm² in der longitudinalen Muskelschicht zu den
Probeentnahmezeitpunkten K2 bis K3
K2 = Kontrolle 2, I2 + FC = Ischämie 2 + Firocoxib, I2 + FM = Ischämie 2 + Flunixin-
Meglumin, , R2 + FC = Reperfusion 2 + Firocoxib, R2 + FM = Reperfusion 2 + Flunixin-
Meglumin, K3 + FC = Kontrolle 3 + Firocoxib; K3 + FM = Kontrolle 3 + Flunixin-Meglumin
mit Firocoxib behandelte Probanden, mit Flunixin-Meglumin behandelte Probanden
dargestellt ist das Minimum und Maximum, der Median sowie das obere und untere
Quartil
4.2.1.3.2 Tunica serosa
In der Tunica serosa stieg die Anzahl der neutrophilen Granulozyten pro mm²
Gewebe nach der Reperfusion in beiden Ischämie-Reperfusionsmodellen an (R1 >
K1, p < 0,0001 und R2 > K2, p = 0,0517). Im zeitlichen Verlauf des Versuches kam
es ebenfalls zu einem Anstieg der neutrophilen Granulozyten in den Kontrollproben
(K2 > K1, p < 0,0001; K3 > K1, p < 0,0001; K3 > K2, p = 0,3583). Die Anzahl der
neutrophilen Granulozyten pro mm² Tunica serosa war in Probe I1, R1, K2 und K3
signifikant erhöht zu Probe K1(p = 0,0006 bzw. p < 0,0001 bzw. p < 0,0001 bzw. p <
0,0001), zu Probe K2 gab es keine signifikanten Erhöhungen in der Zellanzahl (Abb.
111

Ergebnisse
25). Beim Vergleich der Medikamente Firocoxib sowie Flunixin-Meglumin ergab sich
kein signifikanter Unterschied (p > 0,05) (Abb. 26).
Abb. 25: Neutrophile Granulozyten pro mm 2 in der Tunica serosa
Neutrophile Granulozyten pro mm² in der Tunica serosa zu den 7
Probeentnahmezeitpunkten
K1 = Kontrolle 1, I1 = Ischämie 1, R1 = Reperfusion 1, K2 = Kontrolle 2, I2 = Ischämie 2
+ NSAID, R2 = Reperfusion 2 + NSAID, K3 = Kontrolle 3 + NSAID; Proben die mit
einem NSAID behandelt wurden
dargestellt ist das Minimum und Maximum, der Median sowie das obere und untere
Quartil
A = signifikant im Vergleich zu a
112

Ergebnisse
Abb. 26: Vergleich des Einflusses von Flunixin-Meglumin und Firocoxib auf die Anzahl
neutrophiler Granulozyten pro mm 2 in der Tunica serosa
Neutrophile Granulozyten pro mm² in der Tunica serosa zu den
Probeentnahmezeitpunkten K2 bis K3
K2 = Kontrolle 2, I2 + FC = Ischämie 2 + Firocoxib, I2 + FM = Ischämie 2 + Flunixin-
Meglumin, , R2 + FC = Reperfusion 2 + Firocoxib, R2 + FM = Reperfusion 2 + Flunixin-
Meglumin, K3 + FC = Kontrolle 3 + Firocoxib; K3 + FM = Kontrolle 3 + Flunixin-Meglumin
Firocoxib behandelte Probanden, mit Flunixin-Meglumin behandelte Probanden
dargestellt ist das Minimum und Maximum, der Median sowie das obere und untere
Quartil
4.2.2 Cyclooxygenase-1
4.2.2.1 Deskription
Die Auswertung der COX-1 Immunhistochemie erfolgte ausschließlich deskriptiv.
4.2.2.1.1 Kontrolle 1 (K1) – ungeschädigtes Jejunum
In der zirkulären Muskelschicht der Tunica muscularis war eine Expression der
COX-1 bereits im ungeschädigten Jejunum (K1) zu erkennen (Abb. 27). Diese stellte
sich überwiegend homogen (gleichmäßige Expression in der gesamten zirkulären
Schicht der Tunica muscularis) dar (Abb. 27 A - C). Bei zwei Pferden nahm die
Stärke der Expression von der Tela submucosa zur intermuskulären Schicht zu (Abb.
27 D), bei drei Pferden war die Verteilung inhomogen mit ausschließlicher
Expression in dem Teil der zirkulären Muskelschicht, welcher der intermuskulären
113

Ergebnisse
Schicht anliegt. Die Intensität der Färbung umfasste das gesamte Spektrum von
einer schwachen (Abb. 27 D) bis sehr starken Färbung (Abb. 27 B). Bei der Hälfte
der Proben war sie homogen und bei der anderen Hälfte lag eine Intensitätszunahme
von der Tela submucosa zur intermuskulären Schicht vor. Die Expression der COX-1
war am deutlichsten perinukleär, sowohl im Längs- als auch im Querschnitt der
Muskelzellen, festzustellen (Abb. 28).
In der longitudinalen Muskelschicht konnte in drei Proben eine sehr schwache bis
schwache, inhomogene Expression der COX-1 ausschließlich in dem Teil der
longitudinalen Muskelschicht, welcher der intermuskulären Schicht anliegt,
festgestellt werden.
114

Ergebnisse
RM
RM
IM
LM
A
IM
B
RM
IM
LM
C
RM
IM
LM
D
Abb. 27: Immunhistochemische Darstellung der COX-1 am ungeschädigten equinen
Jejunum (K1)
A, B, C, D: positive, perinukleäre Reaktion der Muskelzellen der Ringmuskelschicht; die
Muskelzellen bzw. Kerne der Muskelzellen der Längsmuskelschicht zeigen keine
positive Reaktion; zusätzlich zeigen C und D: positive Zellen im interstitiellen
Bindegewebe der Ring- und Längsmuskelschicht (teilweise mit Kreis markiert);
zusätzlich zeigt B:COX-1-positives Gefäß (durchgehender Pfeil) und negative Gefäße
(unterbrochener Pfeil) in der intermuskulären Schicht
A, B, C, D: 100-Fache Vergrößerung
Die nachfolgenden Abbildungen der perinukleären COX-1-Reaktion in der Ring- und
Längsmuskelschicht, der COX-1 positiven Zellen vom Typ A und B und die
Darstellung der COX-1 positiven und negativen Endothelzellen sind zu allen
7 Probezeitpunkten K1 – K3 beobachtet worden und exemplarische Bilder für die
beschriebenen Befunde. Die Abbildungen werden bereits bei Probe K1 gezeigt, da
sie dort auch zum ersten Mal beobachtet wurden und im Text erläutert werden.
115

Ergebnisse
RM
RM
A
B
RM
RM
C
D
Abb. 28: Immunhistochemische Darstellung der COX-1 positiven perinukleären
Reaktion in den Muskelzellen der Ringmuskelschicht
A, B: Muskelzellen im Längsschnitt; C, D: Muskelzellen im Querschnitt
A, B, C, D: K2
A, C: 200-Fache Vergrößerung; B, D: 400-Fache Vergrößerung (Vergrößerungen des
Bildes A bzw. C)
In der Tunica muscularis und der Tunica serosa stellten sich zwei Arten von Zellen,
welche mit Zelltyp A und B benannt wurden, positiv dar. Zellen vom Typ A hatten
eine homogene, die ganze Zelle ausfüllende COX-1-Färbung und eine runde Form
(Abb. 29 und Abb. 30). Der Zelltyp B hatte eine spindelförmige Form, teilweise mit
zytoplasmatischen Fortsätzen. Die Färbung war homogen, wobei die Fortsätze nur
eine schwache bis keine Färbung aufwiesen (Abb. 30). Im Stratum circulare
befanden sich bei acht Pferden vereinzelt positive Zellen vom Typ A und diese
überwiegend im interstitiellen Bindegewebe (Abb. 29 A und B), zum Teil wurden sie
auch zwischen den einzelnen glatten Muskelzellen beobachtet (Abb. 29 C und D). In
der intermuskulären Schicht konnten lediglich bei einem Pferd vereinzelt positive
116

Ergebnisse
Zellen vom Typ A festgestellt werden. Im Stratum longitudinale befanden sich bei der
Hälfte Pferde vereinzelt Zellen vom Typ A und B im interstitiellen Bindegewebe (Abb.
30 A und B). In der Tunica serosa befanden sich bei neun Pferden vereinzelt positive
Zellen vom Typ A und im überwiegenden Teil dieser Proben vereinzelt Zellen vom
Typ B (Abb. 30 C und D).
RM
RM
A
B
RM
RM
C
D
Abb. 29: Immunhistochemische Darstellung von COX-1 positiven Zellen vom Zelltyp A
in der Ringmuskelschicht
A-D: Zelltyp A (im Kreis); zusätzlich zeigt B: positive Endothelzellen (mit Pfeil markiert),
bei einem inhomogen positiven Gefäß (zwischen den positiven Endothelzellen teilweise
keine positive COX-1-Immunreaktion)
A: K1; B: R1; C, D: I1
A, B, D: 200-Fache Vergrößerung; C: 100-Fache Vergrößerung
117

Ergebnisse
LM
LM
A
B
S
S
C
D
Abb. 30: Immunhistochemische Darstellung von COX-1 positiven Zellen vom Zelltyp A
und B in der Längsmuskelschicht (A, B) und in der Tunica serosa (C, D)
Zelltyp A (im Kreis) und Zelltyp B (durchgehender Pfeil)
A, B: K2; C, D: K3
A, C: 100-Fache Vergrößerung; B: 200-Fache Vergrößerung; D: 400-Fache
Vergrößerung
In allen untersuchten Schichten wurden COX-1 positive Reaktionen der
Endothelzellen festgestellt (Abb. 31). Die Endothelzellen zeigten zum Teil eine
positive Expression und zum Teil keine Immunreaktion. Dieses wurde auch bei
benachbarten Gefäßen (Abb. 31 B und C) und in der Tunica muscularis sowie in der
Tunica serosa festgestellt.
118

Ergebnisse
RM
RM
A
B
RM
IM
LM
C
LM
S
D
Abb. 31: Immunhistochemische Darstellung der COX-1-Expression in den
Endothelzellen
A, B: COX-1 positive Gefäße (durchgängige Pfeile) und ein COX-1 negatives Gefäß
(gestrichelter Pfeil) im interstitiellen Bindegewebe der Ringmuskelschicht; C: ein COX-1
positives Gefäß (durchgängiger Pfeil) und COX-1 negative Gefäße (gestrichelte Pfeile)
in der intermuskulären Schicht; D: COX-1 positive Gefäße (durchgängige Pfeile) im
interstitiellen Bindegewebe der Längsmuskelschicht
A: R2; B: K1; C: I1; D: K3
A, D: 100-Fache Vergrößerung; B: 400-Fache Vergrößerung C: 200-Fache
Vergrößerung
4.2.2.1.2 Ischämisch geschädigtes Jejunum (I1)
Nach 90-minütiger Ischämie (I1) zeigte die zirkuläre Muskelschicht der Tunica
muscularis ebenfalls eine Expression der COX-1 (Abb. 32). Diese stellte sich bei fünf
Pferden homogen dar (Abb. 32 A und C). Bei vier Pferden nahm die Stärke der
Expression in unterschiedlich starker Ausprägung von der Tela submucosa zur
intermuskulären Schicht hin zu (Abb. 32 B) bzw. war bei drei Pferden inhomogen mit
ausschließlicher Expression in dem Teil der zirkulären Muskelschicht welcher der
intermuskulären Schicht anliegt. Die Intensität der Färbung lag beim überwiegenden
119

Ergebnisse
Teil bei einer schwachen (Abb. 32 B) bis starken Färbung (Abb. 32 C und D), ein
Pferd zeigte eine sehr starke Farbintensität. Die Expression der COX-1 in den glatten
Muskelzellen der zirkulären Muskelschicht war scheinbar perinukleär.
In der longitudinalen Muskelschicht wurde bei zwei Pferden eine inhomogene
Expression in dem Teil der longitudinalen Muskelschicht, der der intermuskulären
Schicht anliegt, festgestellt. Beide Pferde zeigten auch im ungeschädigten Zustand
eine sehr schwache bis schwache COX-1 positive Reaktion in der longitudinalen
Muskelschicht. Eine dritte Probe hatte denselben Befund, zeigte aber im
ungeschädigten Zustand keine COX-1-Expression.
In der Tunica muscularis und der Tunica serosa stellten sich wie in den
ungeschädigten Jejunumproben (K1) Zellen vom Typ A und B positiv dar. Im Stratum
circulare befanden sich bei neun Pferden vereinzelt positive Zellen vom Typ A (Abb.
32 B). Diese lagen überwiegend im interstitiellen Bindegewebe, zum Teil wurden sie
aber auch zwischen den einzelnen glatten Muskelzellen beobachtet. In der
intermuskulären Schicht konnten lediglich bei einem Pferd vereinzelt positive Zellen
vom Typ A festgestellt werden. Im Stratum longitudinale befanden sich bei sieben
Pferden im interstitiellen Bindegewebe vereinzelt positive Zellen vom Typ A und auch
vom Typ B. In der Tunica serosa befanden sich bei allen Pferden vereinzelt positive
Zellen vom Typ A und im überwiegenden Teil dieser Proben auch vereinzelt positive
Zellen vom Typ B.
Bei den Endothelzellen wurde kein Unterschied zu den ungeschädigten
Kontrollproben (K1) festgestellt.
Insgesamt fiel auf, dass sich kaum Unterschiede zwischen den ungeschädigten
Jejunumproben (K1) und den Jejunumproben nach 90-minütiger Ischämie (I1)
zeigten.
120

Ergebnisse
RM
IM
RM
LM
A
B
IM
RM
IM
LM
C
D
Abb. 32: Immunhistochemische Darstellung der COX-1 am ischämisch geschädigten
equinen Jejunum (I2)
A, B, C, D: positive, perinukleäre Reaktion der Muskelzellen der Ringmuskelschicht; die
Muskelzellen bzw. Kerne der Muskelzellen der Längsmuskelschicht zeigen keine
positive Reaktion; zusätzlich zeigt B: positive Zellen im interstitiellen Bindegewebe der
Ringmuskelschicht (teilweise mit Kreis markiert); zusätzlich zeigt C: positives Blutgefäß
(durchgehender Pfeil), D: Vergrößerung eines Abschnitts von C : perinukleäre Reaktion
der Muskelzellkerne der Ringmuskelschicht
A, B, C: 100-Fache Vergrößerung D: 400-Fache Vergrößerung
4.2.2.1.3 Durch Ischämie und Reperfusion geschädigtes Jejunum (R1)
Nach 90-minütiger Ischämie und 30-minütiger Reperfusion (R1) wurden ähnliche
Befunde erhoben, wie in den zuvor genommenen Proben. In der zirkulären
Muskelschicht der Tunica muscularis stellte sich die Expression der COX-1
überwiegend homogen dar (Abb. 33 A, D). Bei zwei Pferden nahm die Stärke der
Expression von der Tela submucosa zur intermuskulären Schicht hin zu (Abb. 33 C)
bzw. war bei zwei Pferden inhomogen mit ausschließlicher Expression im dem Teil
der zirkulären Muskelschicht, welcher der intermuskulären Schicht anliegt. Die
121

Ergebnisse
Intensität der Färbung umfasste das gesamte Spektrum von einer schwachen (Abb.
33 C) bis starken Färbung (Abb. 33 A), wobei letztere bei mehreren Pferden
beobachtet wurde. Bei der Hälfte der Pferde war die Färbung homogen und bei der
anderen Hälfte lag eine Intensitätszunahme von der Tela submucosa zur
intermuskulären Schicht vor. Die Expression der COX-1 war perinukleär.
In der longitudinalen Muskelschicht konnte bei vier Pferden eine schwache,
inhomogene Expression mit ausschließlicher Expression in dem Teil der
longitudinalen Muskelschicht, welcher der intermuskulären Schicht anliegt,
festgestellt werden (Abb. 33 A und B).
In der Tunica muscularis und der Tunica serosa stellten sich Zellen vom Typ A und
B, wie in den beiden vorherigen Proben, positiv dar. Unterschiedlich war, dass zum
einen bei mehr Proben positive Zellen festgestellt und zum anderen ein Anstieg der
Anzahl positiver Zellen, vor allem in der Tunica serosa, beobachtet werden konnte.
Es zeigten subjektiv geringgradig mehr Endothelzellen eine positive
COX-1-Expression. Darüber hinaus gab es hinsichtlich der Endothelzellen keine
Unterschiede zu den vorherigen Proben.
122

Ergebnisse
RM
RM
IM
IM
LM
LM
A
B
RM
RM
C
IM
D
IM
Abb. 33: Immunhistochemische Darstellung der COX-1 nach Ischämie und
Reperfusion des equinen Jejunums (R1)
A, B: positive, perinukleäre Reaktion der Muskelzellen der Ring- und
Längsmuskelschicht
C, D: positive, perinukleäre Reaktion der Muskelzellen der Ringmuskelschicht und
positive Zellen im interstitiellen Bindegewebe der Ringmuskelschicht (mit Kreis markiert),
positive, inhomogene Reaktion der Endothelzellen (durchgehender Pfeil)
A, C: 100-Fache Vergrößerung; B, D: 200-Fache Vergrößerung
Die beschriebenen Befunde der ersten drei Probenzeitpunkte (K1, I1, R1) wurden im
zweiten Versuchsabschnitt (Probezeitpunkte K2, I2, R2) ebenfalls beobachtet. Die
verabreichten NSAIDs schienen einen geringen Einfluss auf die COX-1-Expression
zu haben. So entstand der Eindruck, dass nach Verabreichung von
Flunixin-Meglumin zum einen die Ausprägung und zum anderen die Farbintensität
der COX-1-Expression sowohl nach 90-minütiger Ischämie als auch nach
zusätzlicher Reperfusion geringgradig reduziert wurde. Nach Verabreichung von
Firocoxib schien die Ausprägung und die Farbintensität der COX-1-Expression nach
123

Ergebnisse
90-minütiger Ischämie geringer zu sein, nach anschließender Reperfusion aber
wieder zuzunehmen.
Die ungeschädigten Jejunumproben 3 (K3) unterschieden sich im Vergleich zu den
anderen beiden Kontrollproben dadurch, dass subjektiv bei mehr Pferden COX-1
positive Zellen vorhanden waren.
4.2.2.2 Negativ- und Isotypenkontrolle
Die Negativ- und Isotypenkontrolle des COX-1-Antikörpers zeigten keine Reaktionen
(Abb. 34).
RM
IM
LM
S
LM
A
RM
B
LM
IM
S
LM
C
D
Abb. 34: Repräsentative Negativ- und Isotypenkontrolle COX-1
A, B: Negativkontrolle
C, D: Isotypenkontrolle (Kaninchen IgG)
A, B, C, D: R1
A, B, C, D: 100-Fache Vergrößerung
124

Ergebnisse
Zusammenfassend ist Folgendes festzustellen:
1. Ein Nachweis der COX-1 erfolgte in allen 7 Probezeitpunkten.
2. Die COX-1-Expression beschränkte sich in der Tunica muscularis fast
ausschließlich auf das Stratum circulare und wurde nur sehr selten und dann
in schwacher Ausprägung im Stratum longitudinale beobachtet.
3. Im Stratum circulare wurden neben einer homogenen COX-1-Expression über
die gesamte Breite der Muskelschicht auch inhomogene Verteilungen
beobachtet. Diese erstreckten sich häufig auf den Bereich, welcher der
intermuskulären Schicht anlag.
4. In der zirkulären und longitudinalen Muskelschicht waren die positiven
COX-1-Reaktionen perinukleär. Dieses wurde sowohl im Längs- als auch im
Querschnitt der Muskelschicht beobachtet.
5. Die Endothelzellen zeigten zum Teil eine positive Immunreaktion und zum Teil
keine Färbung. Dieses wurde auch bei Gefäßen, die direkt benachbart lagen,
und sowohl in der Tunica muscularis als auch in der Tunica serosa
festgestellt. Die positiven Gefäße zeigten überwiegend eine positive
Immunreaktion in allen Endothelzellen (homogene Färbung), in wenigen
Fällen gab es zwischen COX-1 positiven Endothelzellen eines Gefäßes keine
positive Immunreaktion (inhomogene Färbung).
6. Es konnten in allen Proben zwei verschiedene Zelltypen, Zelltyp A und B,
beobachtet werden. In den Ring- und Längsmuskelschicht lagen diese im
interstitiellen Bindegewebe. Bei den anderen beiden Schichten konnte keine
auffällige Lokalisation festgestellt werden. Die Zellen vom Typ A wurden in
allen Schichten beobachtet, die Zellen vom Typ B lagen ausschließlich in der
Tunica serosa und selten im interstitiellen Bindegewebe der
Längsmuskelschicht. In der Tunica serosa wurden sehr selten runde Zellen
beobachtet, die größer als Zelltyp A waren und eine hellere Farbe aufwiesen.
7. Es wurden keine deutlichen Unterschiede zwischen den Probezeitpunkten
beobachtet.
125

Ergebnisse
8. Einen Einfluss der Medikamente und einen Unterschied zwischen den
Behandlungen mit Firocoxib bzw. Flunixin-Meglumin festzustellen ist mit Hilfe
der Deskription nur eingeschränkt möglich.
4.2.3 Cyclooxygenase-2
4.2.3.1 Deskription
Die Auswertung der COX-2-Immunhistochemie erfolgte ausschließlich deskriptiv.
Der Aufbau dieses Kapitel unterscheidet sich von der Struktur des vorherigen
Kapitels der COX-1, da es nicht nur in den durch Ischämie und Reperfusion
geschädigten Jejunumabschnitten zu einem Anstieg der COX-2 exprimierenden
Zellen kam, sondern auch in den nicht manipulierten Kontrollproben. Um deutlich zu
machen, dass die Ischämie und Reperfusion nicht nur in den direkt betroffenen
Darmabschnitten zu einer Induktion der COX-2 führt, sondern das es auch zu einer
Induktion des Enzyms in benachbarten, nicht direkt geschädigten Darmabschnitten
kommt, wurden die Proben im Vergleich beschrieben: K1, K2, K3 und I1, I2 sowie
R1, R2.
4.2.3.1.1 ungeschädigtes Jejunum zu den Probezeitpunkten K1, K2 und K3
In den ersten ungeschädigten Jejunumproben (K1) war bei einem Pferd eine sehr
schwache COX-2-Expression in der zirkulären Muskelschicht der Tunica muscularis
zu erkennen, bei allen anderen Pferden war sowohl die zirkuläre als auch die
longitudinale Muskelschicht COX-2 negativ (Abb. 35 A und B). Bei drei Pferden
wurden in der Tunica serosa vereinzelt positive Zellen beobachtet, in einer dieser
Proben waren diese auch vereinzelt in der Tunica muscularis vorhanden. Die
Endothelzellen zeigten sowohl in der Tunica muscularis als auch in der Tunica
serosa zum Teil eine positive Expression und zum Teil keine Färbung (Abb. 36 A).
Dieses wurde auch bei Gefäßen die direkt benachbart lagen beobachtet (Abb. 35 A).
In den zweiten ungeschädigten Jejunumproben (K2) zeigten fünf Pferde eine
inhomogene COX-2-Expression in der longitudinalen Muskelschicht, die sich
ausschließlich auf den zur Tunica serosa orientierten Bereich erstreckte (Abb. 35 C)
und eine schwache bis sehr starke Intensität aufwies. Zwei Pferde zeigten eine
positive Reaktion in der Ringmuskelschicht, eins davon mit homogener Verteilung
126

Ergebnisse
und starker Intensität, das andere mit inhomogener, vermehrt zur intermuskulären
Schicht orientierten Verteilung und schwacher Intensität. Bei elf Pferden konnten
positive Zellen in der Tunica serosa beobachtet werden, dort lagen die Zellen
vereinzelt bis diffus vor (Abb. 35 C und D). In der Längsmuskelschicht waren bei
sieben Pferden und in der Ringmuskelschicht bei drei Pferden vereinzelt positive
Zellen im interstitiellen Bindegewebe vorhanden (Abb. 35 C und D). In der
intermuskulären Schicht wurden keine positiven Zellen festgestellt. Hinsichtlich der
Endothelzellen gab es keinen Unterschied zu den ersten ungeschädigten
Jejunumproben (K1).
In den dritten ungeschädigten Jejunumproben (K3) zeigten zehn Pferde eine positive
COX-2-Expression in der longitudinalen Muskelschicht (Abb. 35 E und F). Davon
waren acht homogen verteilt und zwei inhomogen, mit einer vermehrten Reaktion zur
Tunica serosa orientiert (Abb. 35 E). Die Reaktion war unterschiedlich stark positiv
und reichte von einer sehr schwachen bis zu einer sehr starken Intensität. Zwei
Pferde zeigten eine positive Reaktion in der Ringmuskelschicht. Eins davon mit
homogener Verteilung und starker Intensität, dass andere mit inhomogener, vermehrt
zur intermuskulären Schicht orientierter Verteilung und schwacher Intensität. Bei elf
Pferden konnten positive Zellen vom Typ A und B (Abb. 37 C und D) in der Tunica
serosa beobachtet werden, dort lagen die Zellen vereinzelt bis diffus vor, wobei im
Vergleich zu den zweiten ungeschädigten Jejunumproben 2 (K2) bei deutlich mehr
Pferden eine diffuse Zellverteilung vorlag (Abb. 37 C, D). Weiterhin konnten Zellen
vom Typ C beobachtet werden, diese lagen vereinzelt und kamen selten vor. Das
Pferd, welches keine Zellen aufwies, war dasselbe wie bei Probezeitpunkt K2. Im
interstitiellen Bindegewebe der Längsmuskelschicht waren bei sieben Pferden
positive Zellen mit einer sehr unterschiedlichen Verteilung (vereinzelt, multifokal,
diffus) vorhanden. In der Ringmuskelschicht befanden im interstitiellen Bindegewebe
eines Pferdes diffus positive Zellen. In der intermuskulären Schicht wurden bei sechs
Pferden vereinzelt bis diffus verteilte positive Zellen festgestellt. Bei den
Endothelzellen gab es keinen Unterschied zu den vorherigen ungeschädigten
Jejunumproben (K1 und K2) (Abb. 36 D).
127

Ergebnisse
RM
RM
IM
LM
A
IM
LM
B
IM
LM
LM
C
IM
LM
S
S
D
RM
IM
LM
S
E
S
F
Abb. 35: Immunhistochemische Darstellung der COX-2 am ungeschädigten equinen
Jejunum im Zeitverlauf (K1, K2, K3)
A und B: Kontrollprobe 1 (K1), Ring- und Längsmuskelschicht zeigen keine positive
Reaktion, ein positives Gefäß (durchgehender Pfeil), ein negatives Gefäß
(unterbrochener Pfeil) in der intermuskulären Schicht
C und D: Kontrollprobe 2 (K2), C: positive, perinukleäre Reaktion von Muskelzellen der
Längsmuskelschicht (im Kreis); C, D: positive Gefäße im interstitiellen Bindegewebe der
Längsmuskelschicht bzw. in der intermuskulären Schicht, positive Zellen im interstitiellen
Bindegewebe der Längsmuskelschicht und der Tunica serosa
128

Ergebnisse
E und F: Kontrollprobe 3 (K3), positive, perinukleäre Reaktion von Muskelzellen der
Längs- und z.T. von der Ringmuskelschicht, positive Zellen im interstitiellen
Bindegewebe der Längsmuskelschicht und der Tunica serosa;
A, B, C, D, E, F: 100-Fache Vergrößerung
Die positive COX-2 Reaktion in der zirkulären und longitudinalen Muskelschicht war
bei allen Pferden perinukleär (Abb. 38).
Die nachfolgenden Abbildungen der COX-2 positiven Reaktion der Endothelzellen,
der COX-2 positiven Zellen und der perinukleären COX-2 Reaktion in der Ring- und
Längsmuskelschicht sind exemplarische Bilder für die beschriebenen Befunde und
ab dem Probezeitpunkten I1 beobachtet worden. Die Abbildungen werden bereits zu
Beginn gezeigt, da sie hier auch zum ersten Mal beobachtet wurden und im Text
erläutert werden.
RM
RM
IM
LM
A
RM
IM
B
LM
IM
LM
S
C
S
D
Abb. 36: Immunhistochemische Darstellung der COX-2 im Bereich der Endothelzellen
COX-2 positive Gefäße (durchgängige Pfeile) und COX-2 negative Gefäße (gestrichelter
Pfeil) im Septum der Ringmuskelschicht (A, B), in der Längsmuskelschicht (C), in der
Tunica serosa
A: K1; B: I2; C: R2; D: K3
A, B, C, D: 100-Fache Vergrößerung
129

Ergebnisse
RM
RM
A
IM
B
LM
S
S
C
Abb. 37: Immunhistochemische Darstellung von COX-2 positiven Zellen in der
Ringmuskelschicht (A, B) und der Tunica serosa (C, D)
Zelltyp A (Kreis), Zelltyp B (Pfeil) und Zelltyp C (Dreieck)
A, B: R2; C, D: K2
A, C: 100-Fache Vergrößerung; B, D: 200-Fache Vergrößerung
D
130

Ergebnisse
RM
A
B
LM
C
D
Abb. 38: Immunhistochemische Darstellung der COX-2 positiven perinukleären
Reaktion in den Muskelzellen der Längsmuskelschicht
A, B: Muskelzellen im Längsschnitt; C, D: Muskelzellen im Querschnitt
A, B, C, D: K2
A, C: 200-Fache Vergrößerung; B, D: 400-Fache Vergrößerung
4.2.3.1.2 Ischämisch geschädigtes Jejunum zu den Probezeitpunkten I1 und I2
In den ischämisch geschädigten Jejunumproben (I1) war bei einem Pferd eine sehr
schwache COX-2-Expression in der zirkulären Muskelschicht und bei einem anderen
Pferd eine schwache bis starke COX-2-Expression in der longitudinalen
Muskelschicht der Tunica muscularis zu erkennen. Alle anderen Pferde waren
sowohl in der zirkulären als auch in der longitudinalen Muskelschicht COX-2 negativ.
In der Tunica serosa aller Pferde befanden sich positive Zellen, diese waren
überwiegend einzeln verteilt, bei drei Pferden lag eine diffuse Verteilung vor. Bei
einem Pferd waren vereinzelt Zellen im interstitiellen Bindegewebe der
Ringmuskelschicht vorhanden, bei einem weiteren Pferd waren positive Zellen in der
intermuskulären Schicht sichtbar. Die Endothelzellen stellten sich so wie bereits bei
den Kontrollproben (K1, K2, K3) beschrieben dar.
131

Ergebnisse
Die Unterschiede der ischämisch geschädigten Jejunumproben (I2) zu den ersten
ungeschädigten Jejunumproben (K1) waren gering.
In den ischämisch geschädigten und mit einem NSAID behandelten Jejunumproben
(I2) zeigten zehn Pferde eine inhomogene COX-2-Expression in der longitudinalen
Muskelschicht, die sich ausschließlich auf den zur Tunica serosa orientierten Bereich
erstreckte und eine schwache bis sehr starke Intensität aufwies (Abb. 39 C und D).
Ein Pferd zeigte in der Längsmuskelschicht eine homogene COX-2-Expression von
schwacher Intensität. Zwei Pferde zeigten eine sehr schwache positive Reaktion in
der Ringmuskelschicht mit inhomogener, vermehrt zur intermuskulären Schicht
orientierter Verteilung und sehr schwacher Intensität. Bei allen Pferden konnten
positive Zellen in der Tunica serosa beobachtet werden, diese lagen vereinzelt bis
diffus vor. In der Längsmuskelschicht befanden sich bei fünf Pferden vereinzelt bzw.
bei zwei Pferden diffus positive Zellen im interstitiellen Bindegewebe (Abb. 39 A und
B). In der Ringmuskelschicht lagen bei drei Pferden vereinzelt positive Zellen im
interstitiellen Bindegewebe. Hinsichtlich der Endothelzellen gab es keinen
Unterschied zu den ischämisch geschädigten Jejunumproben ohne NSAID
Behandlung (I1).
Insgesamt war festzustellen, dass es in den ischämisch geschädigten und mit einem
NSAID behandelten Jejunumproben (I2) eine deutliche Zunahme der immunpositiven
COX-2-Zellen im Vergleich zu den ischämisch geschädigten Jejunumproben zum
Probezeitpunkt I1 gab.
132

Ergebnisse
IM
LM
LM
S
A
B
IM
LM
LM
C
S
D
Abb. 39: Immunhistochemische Darstellung der COX-2 am ischämisch geschädigten
Jejunum und Behandlung mit einem NSAID (R2)
A, B, C, D: positive, perinukleäre Reaktion der Muskelzellen der Längsmuskelschicht;
die Muskelzellen der Ringmuskelschicht zeigen keine positive Reaktion, positive Zellen
im interstitiellen Bindegewebe der Längsmuskelschicht (im Kreis)
A, B: Muskelzellen im Querschnitt
C, D: Muskelzellen im Längsschnitt
A, C: 100-Fache Vergrößerung; B, D: 200-Fache Vergrößerung
4.2.3.1.3 Durch Ischämie und Reperfusion geschädigtes Jejunum zu den
Probezeitpunkten R1 und R2
In den ersten durch Ischämie und Reperfusion geschädigten Jejunumproben (R1)
zeigten zwei Pferde eine inhomogene COX-2-Expression in der longitudinalen
Muskelschicht, die sich vermehrt auf den zur Tunica serosa orientierten Bereich
erstreckte und eine sehr starke Intensität aufwies. Ein Pferd zeigte eine positive
Reaktion in der Ringmuskelschicht mit inhomogener, vermehrt zur intermuskulären
Schicht orientierten Verteilung und schwacher Intensität. Bei elf Pferden konnten
vereinzelt positive Zellen in der Tunica serosa beobachtet werden, ein Pferd hatte an
133

Ergebnisse
einer Stelle einen Saum aus positiven Zellen am mesothelialen Serosarand. In der
Längsmuskelschicht waren bei fünf Pferden, in der Ringmuskelschicht bei zwei
Pferden vereinzelt positive Zellen im interstitiellen Bindegewebe vorhanden. In der
intermuskulären Schicht wurden keine positiven Zellen festgestellt. Die
Endothelzellen stellten sich wie für die vorherigen Probezeitpunkte beschrieben dar.
In den durch Ischämie und Reperfusion geschädigten und mit einem NSAID
behandelten Jejunumproben (R2) zeigten neun Pferde eine inhomogene
COX-2-Expression in der longitudinalen Muskelschicht, die sich bei fünf Pferden
vermehrt auf den zur Tunica serosa orientierten Bereich erstreckte und bei vier
Pferden von der Tunica serosa zur intermuskulären Schicht hin abnahm (Abb. 40 A
und B). Die Intensität der Färbung umfasste das gesamte Spektrum von sehr
schwach bis sehr stark. Drei Pferde zeigten eine inhomogene COX-2-Expression in
der Längsmuskelschicht, die ausschließlich in dem Bereich, welcher der
intermuskulären Schicht anliegt, vorhanden war. Die Intensität reichte von sehr
schwach bis stark. Bei drei Pferden zeigte sich eine schwache bis starke positive
Reaktion in der Ringmuskelschicht mit einer inhomogenen, vermehrt zur
intermuskulären Schicht orientierten Verteilung (Abb. 40 B und C). In der Tunica
serosa konnten bei allen Pferden positive Zellen beobachtet werden, bei fünf Pferden
lagen die Zellen vereinzelt bis diffus vor (Abb. 40 D). Bei zwei Pferden lag ein
Zellsaum am mesothelialen Serosarand vor. In der Längsmuskelschicht befanden
sich bei sieben Pferden vereinzelt bzw. bei zwei Pferden diffus positive Zellen im
interstitiellen Bindegewebe. In der Ringmuskelschicht lagen bei drei Pferden
vereinzelt positive Zellen im interstitiellen Bindegewebe. In der intermuskulären
Schicht lagen bei keinem Pferd positive Zellen. Hinsichtlich der Endothelzellen gab
es keinen Unterschied zu den durch Ischämie und Reperfusion geschädigten
Jejunumproben des Probezeitpunktes R1.
134

Ergebnisse
RM
IM
RM
LM
IM
LM
A
B
S
RM
LM
IM
LM
C
S
D
Abb. 40: Immunhistochemische Darstellung der COX-2 nach Ischämie und
Reperfusion des equinen Jejunums und Behandlung mit einem NSAID (R2)
A, B: positive, perinukleäre Reaktion in Muskelzellen der Längsmuskelschicht
(geschlossener Kreis); die Muskelzellen bzw. Kerne der Muskelzellen der
Ringmuskelschicht zeigen keine, oder eine sehr schwache positive Reaktion
(gestrichelter Kreis)
C: schwache, positive, perinukleäre Reaktion der Muskelzellen der Ringmuskelschicht
(geschlossener Kreis)
D: positive Zellen in der Tunica serosa: Zelltyp A (im Kreis) und vorherrschend Zelltyp B
(z.T. mit durchgehendem Pfeil markiert)
A, B, C, D: 100-Fache Vergrößerung
4.2.3.2 Negativ- und Isotypenkontrolle
Die Negativ- und Isotypenkontrolle des COX-2-Antikörpers zeigten keine Reaktionen
(Abb. 41 A, C und D).
4.2.3.3 Positivkontrolle
Die als Positivkontrolle verwendete Tunica mucosa zeigte eine deutliche
COX-2-Expression im Epithelium mucosae wie in anderen Studien beschrieben
(MATYJASZEK et al. 2009; MORTON et al. 2009) (Abb. 41 B).
135

Ergebnisse
RM
IM
LM
S
A
B
RM
IM
S
LM
C
D
Abb. 41: Repräsentative Negativ- und Isotypenkontrolle COX-2 sowie Positivkontrolle
COX-2
A: Negativkontrolle COX-2
B: Positivkontrolle COX-2, Zottenepithel der Tunica mucosa
C, D: Isotypenkontrolle (Kaninchen IgG)
A, B, C, D: R1
A, B, C, D: 100-Fache Vergrößerung
Zusammenfassend ist Folgendes festzustellen:
1. Es konnte ein deutlicher Anstieg der COX-2-Expression im Vergleich zu der
ungeschädigten Jejunumprobe (K1) in allen folgenden Probenzeitpunkten
festgestellt werden.
2. Im Vergleich zur COX-1 war die COX-2-Expression in der Tunica muscularis
in wesentlich geringerem Ausmaß und in deutlich geringerer Intensität
vorhanden. Ein weiterer Unterschied ist, dass sich die COX-2-Expression fast
ausschließlich auf das Stratum longitudinale beschränkt und nur sehr selten
und dann in schwacher Ausprägung im Stratum circulare beobachtet wurde.
136

Ergebnisse
3. Im Stratum longitudinale lag fast ausschließlich eine inhomogene Verteilung
vor, die sich zur Tunica serosa orientierte.
4. Wie bei der COX-1 waren in der zirkulären und longitudinalen Muskelschicht
die positiven COX-2-Reaktionen in Muskelzellen perinukleär nachweisbar.
Dieses wurde sowohl im Längs- als auch im Querschnitt der Muskelschicht
beobachtet.
5. Bei den Gefäßen wurden dieselben Beobachtungen wie bei der COX-1
gemacht. Die Gefäße zeigten zum Teil eine positive Expression und zum Teil
keine Färbung. Dieses wurde auch bei Gefäßen die direkt benachbart lagen
sowohl in der Tunica muscularis als auch in der Tunica serosa festgestellt. Die
positiven Gefäße zeigten überwiegend eine positive Immunreaktion aller
Endothelzellen (homogene Färbung), in wenigen Fällen gab es zwischen
positiven COX-2-Endothelzellen eines Gefäßes keine positive Immunreaktion
(inhomogene Färbung). Es konnte kein deutlicher Anstieg in der
COX-2-Expression im Laufe der Probenentnahme festgestellt werden.
6. Wie bei der COX-1 konnten in allen Proben verschiedene Zelltypen
beobachtet werden. In den Muskelschichten lagen diese im interstitiellen
Bindegewebe. Bei den anderen beiden Schichten konnte keine auffällige
Lokalisation festgestellt werden. Die Zellen vom Typ A wurden in allen
Schichten beobachtet. Die Zellen vom Typ B lagen ausschließlich in der
Tunica serosa und selten im interstitiellen Bindegewebe der
Längsmuskelschicht vor. Der Zelltyp C wurde ausschließlich in der Tunica
serosa beobachtet, dort vereinzelt und seltener als die anderen beiden
Zelltypen. Insgesamt kam es zu einer deutlichen Zunahme an COX-2
immunpositiven Zellen vom Probezeitpunkt K1 zu K3.
7. Es wurde eine deutliche Zunahme der COX-2-Expression zum einen über die
Zeit (ohne Manipulation des Jejunums) beobachtet (Vergleich K1, K2 und K3)
und zum anderen nach Ischämie, bzw. Ischämie und Reperfusion. Wobei kein
deutlicher Unterschied zwischen den Ischämie- und Reperfusionsproben
festzustellen war.
137

Ergebnisse
8. Einen Einfluss der Medikamente und einen Unterschied zwischen den
Behandlungen mit Firocoxib bzw. Flunixin-Meglumin festzustellen ist mit Hilfe
der Deskription nur eingeschränkt möglich.
4.3 RT-PCR
Die RT-PCR diente dem Nachweis von COX-1 und COX-2 mRNA in der Tunica
muscularis des Jejunums und damit als Bestätigung der Ergebnisse der COX-1 und
COX-2 Immunhistochemie. In der RT-PCR konnte mRNA der COX-1 und COX-2 in
der Tunica muscularis des equinen Jejunums nachgewiesen werden. Für beide COX
zeigte sich je eine spezifische Bande auf der zu erwartenden Höhe (COX-1: 153 bp,
COX-2: 118 bp) zu erwarten war (Abb. 42).
bp
500
400
300
200
100
bp
500
400
300
200
100
A
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
B
Abb. 42: Qualitativer Nachweis von COX-1 und COX-2 mRNA in der Tunica muscularis
des equinen Jejunums mittels RT-PCR
A: COX-1 RT-PCR: COX-1 spezifische Bande bei 153 bp (Pfeil); Analyse der PCR-
Produkte in der Gelelektrophorese. bp = Basenpaare; Lanes 1 - 5: 1 = 100 bp-DNA-
Marker; 2 = COX-1 Probe 1; 3 = COX-1 Probe 2; 4 = Negativkontrolle; 5 = 100 bp-DNA-
Marker
B: COX-2 RT-PCR: COX-2 spezifische Bande bei 118 bp (Pfeil); Analyse der PCR-
Produkte in der Gelelektrophorese. bp = Basenpaare; Lanes 1 - 5: 1 = 100 bp-DNA-
Marker; 2 = COX-2 Probe 1; 3 = COX-2 Probe 2; 4 = Negativkontrolle; 5 = 100 bp-DNA-
Marker
4.4 Western Blot
Der Western Blot diente dem weiteren Nachweis von COX-1 und COX-2 auf
Proteinebene in der Tunica muscularis des Jejunums und damit als Bestätigung für
die Ergebnisse der COX-1- und COX-2-Immunhistochemie. Im Western Blot konnte
138

Ergebnisse
die COX-1 auf Proteinebene in der Tunica muscularis des equinen Jejunums
nachgewiesen werden. Für die COX-1 zeigte sich eine spezifische Bande auf der zu
erwartenden Höhe (COX-1: 72 kDa) (Abb. 43 A). Das Protein β-Aktin (43 kDa) wurde
als Ladekontrolle eingesetzt (Abb. 43). Der Versuch des Nachweises für die COX-2
auf Proteinebene ergab trotz mehrmaliger Versuche sowohl für die als
Positivkontrolle eingesetzte Probe aus Tunica mucosa und Tela submucosa als auch
für die zu untersuchende Probe der Tunica muscularis kein spezifisches Ergebnis.
Das als Ladekontrolle eingesetzte β-Aktin (43 kDa) zeigte eine spezifische Bande auf
der zu erwartenden Höhe (Abb. 43 B).
Abb. 43: Qualitativer Nachweis von COX-1 und COX-2 in der Tunica muscularis des
equinen Jejunums mittels Western Blot
Abb. A (links): Qualitativer Nachweis von COX-1 Proteinen mittels Western Blot; β-
Aktin als Ladekontrolle; COX-1 spezifische Bande bei 72 kDa (durchgängiger Pfeil); β-
Aktin spezifische Bande bei 43 kDa (gestrichelter Pfeil); kDa = Kilodalton; P1 =
Muscularisprobe 1 (20 µg Protein eingesetzt), P2 = Muscularisprobe 2 (40 µg Protein
eingesetzt), pos. K. = Positivkontrolle (Tunica mucosa und Tela submucosa), neg. K. =
Negativkontrolle (nur TBS, kein Primärantikörper)
Abb. B (rechts): Qualitativer Nachweis von COX-2 Proteinen mittels Western Blot; β-
Aktin als Ladekontrolle; COX-2 spezifische Bande bei 70-72 kDa kann bei Probe und
Positivkontrolle nicht nachgewiesen werden (gepunkteter Pfeil); β-Aktin spezifische
Bande bei 43 kDa (gestrichelter Pfeil); kDa = Kilodalton; P1 = Muscularisprobe 1 (20 µg
Protein eingesetzt), P2 = Muscularisprobe 2 (40 µg Protein eingesetzt), pos. K. =
Positivkontrolle (Tunica mucosa und Tela submucosa), pos. K.1 (20 µg Protein
eingesetzt), pos. K.2 (40 µg Protein eingesetzt), neg. K. = Negativkontrolle (nur TBS,
kein Primärantikörper)
139

Diskussion
5 Diskussion
5.1 Methodik – in vivo Versuch
5.1.1 Probanden
Die für die Studie zur Verfügung stehende Anzahl von insgesamt zwölf Probanden
und damit sechs Probanden pro untersuchtem NSAID ist vergleichbar mit anderen
Ischämie-Reperfusionsstudien am equinen Jejunum (TOMLINSON et al. 2004;
LITTLE et al. 2005, 2007b; COOK et al. 2009a) bzw. Colon (MATYJASZEK et al.
2009). Der Versuchsaufbau war in einen ersten und zweiten Versuchsabschnitt
aufgeteilt, die identisch hinsichtlich Ischämie und Reperfusion sowie der
Probenentnahme waren. Der Unterschied bestand darin, dass die Pferde im zweiten
Versuchsabschnitt nach 60 Minuten das selektive NSAID Firocoxib oder das nicht
selektive NSAID Flunixin-Meglumin erhielten. Die Proben des ersten
Versuchsabschnittes sollten als Kontroll- bzw. Vergleichsproben für den zweiten
Versuchsabschnitt dienen. Dieser Versuchsaufbau wurde gewählt, um die zur
Verfügung stehenden zwölf Probanden effektiv zu nutzen. Bei anderen Studien
bestand die Kontrollgruppe aus sechs Pferden die kein NSAID, sondern NaCl als
Placebo erhielten (TOMLINSON et al. 2004; LITTLE et al. 2005, 2007b; COOK et al.
2009a; MATYJASZEK et al. 2009). Die nach dem ersten Versuchsabschnitt in nicht
manipulierten Jejunumabschnitten festgestellte deutliche Entzündungsreaktion hat
den zweiten Versuchsabschnitt möglicherweise beeinflusst, so dass ein Vergleich
zum ersten Versuchsabschnitt und eine Beurteilung der Wirkung der NSAIDs nur
eingeschränkt möglich ist. Diese Befunde zeigen, dass sich der gewählte
Versuchsaufbau nicht bewährt hat. Daher sollte in zukünftigen Projekten mit einer
zusätzlichen Kontrollgruppe, die kein NSAID bekommt, gearbeitet werden.
Die Altersspanne der Tiere von 3 bis 25 Jahren mit einem Gewicht von 350 bis
591 kg ähnelt den vorherigen Ischämie-Reperfusionsstudien am equinen Dünn- und
Dickdarm (LITTLE et al. 2007b; COOK et al. 2009a; MATYJASZEK et al. 2009;
MARSHALL u. BLIKSLAGER 2011; MORTON et al. 2011) und anderen
Untersuchungen am Darm des Pferdes (HOPSTER-IVERSEN et al. 2011). Das
Probandengut sollte ausschließlich aus ausgewachsenen Pferden bestehen, dies
140

Diskussion
war mit einem Alter ab 3 Jahren gegeben. Das Gewicht war von untergeordneter
Bedeutung, so dass die Pferde hinsichtlich dieser Parameter für den Versuch
geeignet waren.
Bei allen Probanden wurde eine klinische Allgemeinuntersuchung durchgeführt,
welche bei keinem der Pferde Hinweise auf eine Erkrankung des
Gastrointestinaltraktes lieferte. Dieses Vorgehen ist auch in weiteren Ischämie-
Reperfusionsstudien beschrieben (GROSCHE et al. 2008, 2011; MATYJASZEK et
al. 2009; HOPSTER-IVERSEN et al. 2011; MORTON et al. 2011; VENTE 2011) und
sinnvoll, da nur Pferde ohne eine Erkrankung des Gastrointestinaltraktes für den
Versuch geeignet sind. Zusätzlich wurde in der vorliegenden Studie am Tag vor der
Operation die Leukozytenzahl, der Hämatokrit sowie der Gesamteiweißgehalt aus
venösem Blut bestimmt, um eine akute oder chronische Entzündung auszuschließen.
Die Werte befanden sich bei allen Probanden im Normbereich. Die Untersuchung
von Blutparametern wurde nur in älteren Studien in Form eines vollständigen,
hämatologischen Profils (PRICHARD et al. 1991) bzw. einer reinen Kontrolle der
Leukozytenzahl (SNYDER et al. 1988; WILKINS et al. 1994) durchgeführt. Auch
wenn die Untersuchung der Blutparameter in den Ischämie-Reperfusionsstudien der
aktuellen Literatur nicht durchgeführt wurde, ist diese Untersuchung sinnvoll, denn
dadurch können Pferde mit einer Entzündung erkannt werden. Dies ist wichtig, da bei
einer Entzündungsreaktion auch der Darm beteiligt sein könnte und dies die
Ergebnisse der Studie verfälschen könnte. Aus diesem Grund sollte eine
Untersuchung der Blutparameter auch in zukünftigen Projekten erfolgen.
Die Behandlung der Probanden mit einem Anthelmintikum war notwendig, um einen
Einfluss von intestinalen Parasiten auf die Entzündungsreaktion des Jejunums, vor
allem in Hinblick auf die eosinophilen Granulozyten, auszuschließen. Denn bei einer
Untersuchung des equinen Dickdarms konnte eine Zunahme der eosinophilen
Granulozyten im Rahmen einer Infektion mit Cyathostominae nachgewiesen werden
(COLLOBERT-LAUGIER et al. 2002). Es wurde zunächst auf den Wirkstoff
Moxidectin zurückgegriffen, da dieser nachweislich gegen Strongyliden wirkt
(EYSKER et al. 1997; DORCHIES et al. 1998) und zwei Vorgängerarbeiten diesen
141

Diskussion
eingesetzt haben (HOPSTER-IVERSEN et al. 2011; VENTE 2011). Bei dem zweiten
Probanden waren nach Behandlung mit dem Anthelmintikum Parasiteneier im
Flotationsverfahren nachweisbar. Deswegen wurde dieser zusätzlich mit einem
Kombinationspräparat aus Ivermectin und Praziquantel behandelt, da die
Parasiteneier möglicherweise auf Resistenzen gegen Moxidectin zurückzuführen
waren und daher der Einsatz eines anderen makrozyklischen Laktons sinnvoll
erschien. Ein Breitspektrumanthelmintikum wurde eingesetzt um auch einen Einfluss
von Zestoden auszuschließen. Die nachfolgenden Probanden wurden aus den
genannten Gründen direkt mit dem Kombinationspräparat aus Ivermectin und
Praziquantel behandelt.
Den Pferden wurde acht Stunden vor der Operation das Futter, nicht aber das
Wasser entzogen. Die Dauer der Futterkarenz ist vergleichbar mit anderen Ischämie-
Reperfusionsstudien am equinen Jejunum, von sechs (VENTE 2011), acht
(PRICHRARD et al. 1991; MARSHALL u. BLIKSLAGER 2011) und zwölf Stunden
(VATISTAS et al. 1998) und wurde in der aktuellen Studie gewählt, da dieses die
Standardvorbereitung für die Allgemeinanästhesie war. Bei Studien am Colon
ascendens des Pferdes hatten die Probanden 24 Stunden keinen Zugang zu Futter
(MOORE et al. 1994; WILKINS et al. 1994). Dieses war für die vorliegende Studie
am Jejunum nicht notwendig, da das Jejunum („Leerdarm“) physiologisch nicht mit
Inhalt gefüllt ist und somit auch keine verlängerte Futterkarenz wie bei Studien am
Dickdarm notwendig war. Auch in zukünftigen Studien am Dünndarm kann sich damit
an der gewählten Zeitspanne orientiert werden.
5.1.2 Versuchsaufbau
Die vorliegende Studie wurde am mittleren Abschnitt des Jejunums durchgeführt. Der
Großteil der Ischämie-Reperfusionsstudien am equinen Jejunum wurde am distalen
Jejunum drei Meter (CAMPBELL u. BLIKSLAGER 2000) bzw. einen Meter oral der
Plica ileocaecalis (TOMLINSON et al. 2004, 2005; LITTLE et al. 2005, 2007b;
MARSHALL u. BLIKSLAGER 2011) und im Bereich der distalsten großen
Mesenterialgefäße des Jejunums (VATISTAS et al. 1998; HILTON et al. 2011)
durchgeführt. Für die Vergleichbarkeit mit diesen Arbeiten wäre es gut gewesen, die
vorliegende Studie ebenfalls am distalen Jejunum durchzuführen. Dieser
142

Diskussion
Jejunumabschnitt stand aber nicht zur Verfügung, da er von einer anderen
Arbeitsgruppe benötigt wurde. Der distale Abschnitt des Jejunums wird in Ischämieund
Reperfusionsstudien bevorzugt verwendet, da es häufig zu einer Inkarzeration
vom distalen Dünndarmabschnitt (42,3 % distales Jejunum und Ileum, 23,9 % nur
Ileum, 33,8 % nur Jejunum) in das Foramen epiploicum kommt (ARCHER et al.
2004; FREEMAN u. SCHAEFFER 2005). Damit werden die Ischämie- und
Reperfusionsstudien an einem Darmabschnitt durchgeführt, der auch bei der
spontanen Dünndarminkarzeration häufig betroffen ist. Eine weitere häufige Form
der Darmstrangulation ist die spontane Strangulation durch gestielte Lipoma
pendulans. Dabei ist der Dünndarm häufiger betroffen als der Dickdarm. Beim
Dünndarm ist keine prädisponierte Lokalisation beschrieben, es sind aber häufig
mehrere Meter betroffen, die Länge von reseziertem Darm liegt in einer Studie bei
3,6 +/- 2,4 Meter (0,30 bis 9,70 Meter) (EDWARDS u. PROUDMAN 1994; FREEMAN
u. SCHAEFFER 2005; GARCIA-SECO et al. 2005). So ist auch das in der aktuellen
Ischämie- und Reperfusionsstudie genutzte mittlere Jejunum ein geeigneter
Abschnitt, der auch bei spontaner Dünndarmstrangulation betroffen ist.
5.1.3 Anlegen der Ischämie
Zur Herstellung der warmen Ischämie wurden 30 cm Jejunum in eine Schlaufe gelegt
und diese mit einem Bühnerband abgebunden. So wurde der Blutfluss über zu- und
abführende Gefäße reduziert. Dieses Modell ähnelt der spontanen Strangulation
beim Koliker (BLIKSLAGER 2008) und es ist vorstellbar, dass es mit der warmen
Ischämie wie sie zum Beispiel bei einer Dünndarmstrangulation durch ein Lipoma
pendulans hervorgerufen wird, vergleichbar ist. In anderen Studien wurde die
Ischämie erzeugt, indem das Darmlumen an beiden Enden mit Penrosedrainagen
(SULLINS et al. 1985; VATISTAS et al. 1998; HILTON et al. 2011) oder Bühnerband
(PRICHARD et al. 1991; CAMPBELL u. BLIKSLAGER 2000) abgebunden oder mit
Doyenklemmen (TOMLINSON et al. 2004; TOMLINSON u. BLIKSLAGER 2005;
LITTLE et al. 2005, 2007b; COOK et al. 2009a; MARSHALL u. BLIKSLAGER 2011)
verschlossen wurde. Zusätzlich wurden die Gefäße mit Penrosedrainagen und
aufgesetzten Gefäßklemmen (TOMLINSON et al. 2004; COOK et al. 2009a;
MARSHALL u. BLIKSLAGER 2011) oder nur mit Gefäßklemmen (VATISTAS et al.
143

Diskussion
1998; HILTON et al. 2011) verschlossen. Es ist zum einen zu erwarten, dass der
Verschluss der Gefäße mit Penrosedrainagen und aufgesetzten Gefäßklemmen zu
einer Reduktion, aber Erhaltung des Blutflusses führt, so dass eine warme Ischämie
erzeugt wird. Zum anderen ist zu erwarten, dass der direkte Aufsatz von Klemmen
auf das Gefäß zu einer vollständigen Unterbrechung des Blutflusses führt, so dass
eine kalte Ischämie entsteht. In der vorliegenden Studie wurde ein modifiziertes
Modell eingesetzt. Es wurde Bühnerband und keine Penrosedrainage zum Anlegen
der Ischämie verwendet. Denn die Penrosedrainagen besitzen den Nachteil, dass sie
weich sind und leicht abrutschen. Zusätzlich hat die Erfahrung der verantwortlichen
Chirurgin gezeigt, dass diese Eigenschaften eine kontinuierliche und gleichbleibende
Kompression von Darmlumen und Gefäßen schwierig machen. Der Vorteil des
Bühnerbandes ist, dass es mehr Reibung besitzt, so dass ein Abrutschen vom Darm
weniger wahrscheinlich und die Zugfestigkeit besser steuerbar ist. Es ist zudem
vorstellbar, dass das gleichzeitige Abbinden des Darmlumens sowie der zu- und
abführenden Blutgefäße mit Bühnerband der spontanen Darmstrangulation am
ehesten entspricht. Im Gegensatz zur separaten Reduktion des Blutflusses und dem
zusätzlichen Verschluss des Darmlumens.
5.1.4 O2C-Gerät und Pulsoxymeter
Um beim Anlegen der Ischämie eine vergleichbare Reduktion des Blutflusses bei
allen Probanden zu erreichen, wurde dieser in der Darmwand mit Hilfe der
O2C-Sonde vor Anlegen der Ischämie überprüft und dann auf 10 % des
ursprünglichen Flusses reduziert. Dadurch wurde auch das Anlegen einer warmen
Ischämie sichergestellt und eine versehentliche vollständige Unterbrechung der
Blutzufuhr verhindert. Weitere Ischämie-Reperfusionsstudien verwendeten andere
Techniken zur Objektivierung der Blutflussreduktion. In der Studie von HILTON et al.
(2011) wurde der Blutfluss in den Mesenterialgefäßen des equinen Jejunums mit
einer Strömungssonde („flow probe“) gemessen. Nach Bestimmung einer Baseline
wurde eine Blutflussreduktion auf 20 % des ursprünglichen Flusses durchgeführt.
Eine Ischämie-Reperfusionsstudie am equinen Colon setzte ein Pulsoxymeter auf
der Serosaoberfläche ein. Es diente der Überprüfung der pulsierenden Strömung
(„pulsatile flow“) sowie ausreichenden Sauerstoffsättigung der Serosaoberfläche um
144

Diskussion
dadurch eine segmentale Ischämie und die ausreichende Versorgung benachbarter
Darmabschnitte sicherzustellen (MATYJASZEK et al. 2009). In zwei Studien wurde
mit einer Dopplerultrasonografie („doppler ultrasound blood flow probe“) gearbeitet.
In einer erfolgte eine kontinuierliche Blutflussmessung, indem die Sonde um die das
ventrale Colon versorgende Arterie gelegt wurde. Nach Bestimmung einer Baseline
wurde der Blutfluss auf 20 % des ursprünglichen Flusses reduziert (MOORE et al.
1994). In der anderen Studien wurde zwei Wochen vor dem Beginn der Ischämie-
Reperfusionsstudie auf die rechte Colonarterie in der Nähe der Beckenflexur über
eine Flankenlaparotomie eine Sonde für die Dopplerultrasonografie („doppler
ultrasound blood flow probe“) fixiert. Die Messungen konnten so bereits vor
Versuchsbeginn und während der 48 Stunden nach Ischämie in der
Reperfusionsphase fortgesetzt werden. (WILKINS et al. 1994).
Das O2C-Gerät bot gegenüber den anderen Messmethoden verschiedene Vorteile.
Zum einen erfolgte die Messung sowohl des Blutflusses als auch der
Sauerstoffsättigung im peripheren Gewebe und nicht an den zuführenden Gefäßen,
was eine direkte Überprüfung der Gewebeischämie ermöglichte. Zum anderen
erwies sich die Messung des Blutflusses beim Anlegen der Ischämie als ein sehr
sensibles Messverfahren, da eine Reduktion zeitgleich mit dem Anlegen des
Bühnerbandes erfasst werden konnte und damit eine Messung der Reduktion des
Gewebeblutflusses in Echtzeit möglich war. Die Sauerstoffsättigung des Gewebes
fiel mit deutlicher Verzögerung ab, dasselbe galt für die Zunahme, so dass das
Anlegen der Ischämie anhand dieses Parameters wesentlich schwieriger gewesen
wäre. Darüber hinaus ist die Sauerstoffsättigung des Gewebes beim Anlegen der
Ischämie ein weniger entscheidender Parameter. Die Messung der
Sauerstoffsättigung stellte sich auch als entscheidender Nachteil des Pulsoxymeters
dar. Zusätzlich benötigt das Pulsoxymeter zur Messung eine pulsierende Strömung.
Da es bei der Ischämie zu einer deutlichen Reduktion dieser kommt, konnte das
Gerät die Sauerstoffsättigung im Gewebe häufig nicht bestimmen. Aus diesen
Gründen scheint das Pulsoxymeter zum Anlegen und zur Überprüfung des Grades
der Ischämie nicht geeignet zu sein. Einschränkungen für den Einsatz des
O2C-Gerätes könnten darin gesehen werden, dass zum einen zurzeit keine Studien
145

Diskussion
vorliegen, die dieses Gerät am Tier etabliert haben. Zum anderen haben Studien aus
der Humanmedizin das O2C-Gerät zwar zur Untersuchung der Mikrozirkulation in
verschiedenen Organen eingesetzt, unter anderem zur Bestimmung des Blutflusses
an der distalen Gliedmaße von Patienten mit Diabetes (BECKERT et al. 2004) bzw.
an gesunden Gliedmaßen (DARMANIN et al. 2013) sowie zur intraoperativen
Bestimmung der Mikrozirkulation der Leber (LADURNER et al. 2009) sowie von
transplantierten Nieren (FECHNER et al. 2009), aber zur Zeit liegen keine Studien für
den Einsatz am Darm vor.
Zusammenfassend kann aber festgehalten werden, dass sich die O2C-Sonde in der
aktuellen Studie als sehr hilfreich erwiesen und darüber hinaus sehr gut und
zuverlässig funktioniert hat, so dass das O2C-Gerät für zukünftige Studien
empfohlen werden kann.
5.1.5 Ischämie und Reperfusionslänge
In der vorliegenden Studie wurde eine Ischämiezeit von 90 Minuten gewählt. Zum
einen sollte durch die Ischämie eine auswertbare Entzündungsreaktion verursacht
werden, zum anderen sollte die Ischämie jedoch nicht zu einer zu starken
Gewebeschädigung führen. Da eine einstündige Ischämie in der Tunica mucosa und
Tela submucosa des equinen Colons (GROSCHE et al. 2008) bzw. Jejunums
(LITTLE et al. 2005) zu keinem signifikanten Anstieg der Calprotectin positiven Zellen
im Vergleich zur Kontrollprobe führte, wurde eine Ischämielänge von mehr als 60
Minuten gewählt. Dass bei einer Ischämie von zwei Stunden der Anstieg der
Calprotectin positiven Zellen in beiden Studien signifikant war (LITTLE et al. 2005;
GROSCHE et al. 2008), zeigte, dass die Ischämiezeit nicht über 2 Stunden liegen
musste. Da die Arbeit von VENTE (2011) bereits nach einer 90-minütigen Ischämie
einen signifikanten Anstieg der Zellzahl festgestellt hat, wurde diese Ischämiezeit als
ausreichend angesehen. Sie liegt damit in der Mitte von den in anderen Studien
gewählten Zeitspannen: eine Stunde (CAMPBELL u. BLIKSLAGER 2000), zwei
Stunden (TOMLINSON et al. 2004; TOMLINSON u. BLIKSLAGER 2005; COOK et
al. 2009a; MARSHALL u. BLIKSLAGER 2011) bzw. eine Stunde und zwei Stunden
an einem Probanden (LITTLE et al. 2005, 2007b; GROSCHE et al. 2008).
146

Diskussion
In der vorliegenden Studie wurde eine Reperfusionszeit von 30 Minuten gewählt. Die
in vorherigen Studien eingesetzten Reperfusionslängen lagen bei 75 Minuten
(HILTON et al. 2011), zwei Stunden (VATISTAS et al. 1998; VENTE 2011) bzw. 18
Stunden, bei letzteren Versuchen standen die Pferde nach dem Lösen der Ischämie
wieder auf (TOMLINSON et al. 2004; LITTLE et al. 2005, 2007b; COOK et al. 2009a;
MORTON et al. 2011). Unsere Reperfusionslänge ist damit deutlich geringer. Sie
basiert auf den Ergebnissen von zwei Studien. Zum einen wurde in einer Arbeit am
equinen Jejunum, die während einer zweistündigen Reperfusion mehrere Proben
entnommen hat, nach 30-minütiger Reperfusion ein Plateau in der Anzahl an
Calprotectin positiven Zellen festgestellt (VENTE 2011). Zum anderen zeigte eine
Studie am equinen Colon nach 30-minütiger Reperfusion bereits einen signifikanten
Anstieg an Calprotectin positiven Zellen im Vergleich zur Kontrollprobe (GROSCHE
et al. 2008). Diese beiden Studien deuten darauf hin, dass eine Reperfusionslänge
von 30 Minuten zu signifikanten Ergebnissen führt und eine längere Reperfusionszeit
deswegen nicht notwendig ist.
5.1.6 Abstände der Proben zueinander
Der gewählte Abstand von einem Meter, den die drei Kontrollproben und damit auch
das durch Ischämie und Reperfusion geschädigte Jejunum voneinander hatten war
größer bzw. genauso groß wie in den bisher beschriebenen Studien. So lag der
Abstand zwischen Kontrolle und ischämisch geschädigtem Jejunum bei
25 Zentimetern (SULLINS et al. 1985) bzw. einem Meter (TOMLINSON et al. 2004;
LITTLE et al. 2005, 2007b; TOMLINSON u. BLIKSLAGER 2005; MARSHALL u.
BLIKSLAGER 2011). Der Abstand von einem Meter sollte eine Vergleichbarkeit der
Proben ermöglichen und wurde deswegen aus folgenden Gründen gewählt. Zum
einen sollten die Proben einen größtmöglichen Abstand voneinander haben, um eine
Entzündungszellinfiltration durch Manipulation an benachbartem Darm zu vermeiden
und zum anderen sollte der Abstand zwischen den Proben möglichst gering sein, da
die Verteilung der eosinophilen Granulozyten innerhalb des Darms unterschiedlich ist
(RÖTTING et al. 2008a). Allerdings diskutieren TOMLINSON et al. (2004) auf Basis
ihrer Ergebnisse, dass ein Abstand von zwei Metern zwischen Ischämie- und
Kontrollprobe möglicherweise zu gering ist und zu einer indirekten Schädigung von
147

Diskussion
benachbarten, nicht manipulierten Darmabschnitten führt. In zukünftigen Studien
könnte die Ausprägung der Entzündungsreaktion durch Ischämie und Reperfusion in
verschiedenen, nicht manipulierten Darmabschnitten untersucht werden. Zum einen
könnte damit das Ausmaß einer Enteritis beurteilt und zum anderen adäquate
Probenabstände zwischen Ischämie und Kontrollprobe bestimmt werden.
5.1.7 Zeitpunkt der Applikation des nichtsteroidalen Antiphlogistikums
Das NSAID wurden nach 60-minütiger Ischämie und damit 30 Minuten vor Beginn
der Reperfusion verabreicht. Der Zeitpunkt der NSAID-Applikation in Ischämie-
Reperfusionsstudien ist unterschiedlich. So wurden die NSAIDs bei Ischämiestudien
am equinen Dünndarm direkt vor Narkoseeinleitung (COOK et al. 2009a) oder mit
Einsetzen der Reperfusion (TOMLINSON et al. 2004; LITTLE et al. 2005, 2007b)
gegeben. Letzteres ist auch bei Ischämiestudien am Colon ascendens des Pferdes
beschrieben (MATYJASEK et al. 2009; MORTON et al. 2011). Die Studien, die das
NSAID mit Reperfusionsbeginn verabreichten, entnahmen Proben nach 18-stündiger
Reperfusion. Mit dem in der vorliegenden Studie gewählten Applikationszeitpunkt
sollten möglichst praxisnahe Bedingungen geschaffen werden. Dem kolikenden
Pferd wird das NSAID in der Regel verabreicht, wenn der Darm bereits ischämisch
geschädigt ist. Das NSAID wirkt also während der Ischämie und bereits vor
Einsetzen der Reperfusion, die in der Regel erst in der Kolikoperation durch
Behebung der Strangulation eingeleitet wird. Der gewählte Applikationszeitpunkt
entspricht damit den tatsächlichen Bedingungen am ehesten.
5.1.8 Auswahl der nichtsteroidalen Antiphlogistika
Als NSAIDs wurden in der Studie Flunixin-Meglumin und Firocoxib eingesetzt. In
vorherigen Ischämie- und Reperfusionsstudien am equinen Jejunum wurde als nicht
selektives NSAID Flunixin-Meglumin und als Vertreter der selektiven NSAIDs
Etodolac (TOMLINSON et al. 2004; LITTLE et al. 2005), Meloxicam (LITTLE et al.
2007a) bzw. Firocoxib (COOK et al. 2009a) eingesetzt. Am Colon des Pferdes
erfolgten Untersuchungen ausschließlich zu Flunixin-Meglumin (MATYJASZEK et al.
2009; MORTON et al. 2011). In der aktuellen Studie wurden Flunixin-Meglumin und
Firocoxib aus verschiedenen Gründen gewählt. Beide Präparate sind in Deutschland
für das Pferd zugelassen (IONITA u. BREHM 2010) im Gegensatz zu dem in den
148

Diskussion
amerikanischen Studien verwendeten selektiven NSAID Etodolac. Darüber hinaus
wird Flunixin-Meglumin als Vertreter der nicht selektiven NSAIDs im Rahmen der
Koliktherapie häufig sowohl als potentes Schmerzmittel als auch präoperativ
eingesetzt. Firocoxib als Vertreter der selektiven NSAIDs wurde dem selektiven
NSAID Meloxicam (welches für das Pferd in Deutschland ebenfalls zugelassenen ist)
vorgezogen, da es das für das Pferd zurzeit selektivste zugelassene NSAID ist
(IONITA u. BREHM 2010).
5.2 Methodik - Histologische und molekularbiologische Auswertung
5.2.1 Lunafärbung
Die eosinophilen Granulozyten wurden mit Hilfe der Lunafärbung (LUNA 1992)
nachgewiesen. Die Granula der eosinophilen Granulozyten stellt sich deutlich rot dar
(LUNA 1992) wodurch sich die Zellen sehr gut von der Umgebung abgrenzen.
Alternativ hätte man die Anfärbung der Zellen mit der HE-Färbung vornehmen
können, wie es auch am Pferdedarm beschrieben ist (MOORE et al. 1994). Die
Lunafärbung wurde für die aktuelle Studie zur Darstellung der eosinophilen
Granulozyten aus mehreren Gründen verwendet. Zum einen konnten die
eosinophilen Granulozyten sehr gut differenziert werden, dies ermöglichte eine
zuverlässige und einfache Auswertung der Proben. Zum anderen haben eine
ausführlichen Studie, die den gesamten Gastrointestinaltrakt des Pferdes auf das
Vorkommen von eosinophilen Granulozyten mit Hilfe der Lunafärbung untersucht
hat, (RÖTTING et al. 2008a) und weitere Arbeiten diese Spezialfärbung am equinen
Darm erfolgreich eingesetzt (RÖTTING et al. 2003; GROSCHE et al. 2011;
HOPSTER-IVERSEN et al. 2011; VENTE 2011).
5.2.2 Calprotectin-Immunhistochemie
Die Darstellung der neutrophilen Granulozyten erfolgte mit dem Nachweis von
Calprotectin in der Immunhistochemie. Die Alternative zur Immunhistochemie wäre
die Darstellung der neutrophilen Granulozyten in der HE-Färbung gewesen, so wie
es in anderen Studien am Dünn- und Dickdarm des Pferdes durchgeführt wurde
(MOORE et al. 1994; VATISTAS et al. 1998; TOMLINSON et al. 2004; LITTLE et al.
2007b). Der Nachteil der konventionellen Darstellung mit der HE-Färbung ist, dass
die Zelldifferenzierung schwierig und sehr subjektiv ist und einen hohen Zeitaufwand
149

Diskussion
erfordert (MOORE et al. 1994). Die Calprotectin-Immunhistochemie hingegen
ermöglicht eine kontrastreiche Darstellung der positiven Zellen gegenüber der
Umgebung und damit eine zuverlässige und einfache Auswertung der Proben. Hinzu
kommt, dass es nach einem Ischämie- und Reperfusionsschaden zu einem
deutlichen Anstieg von Zellen im Gewebe kommt, was einen Nachweis von
einzelnen neutrophilen Granulozyten mit Hilfe der HE-Färbung schwierig macht
(MOORE et al. 1994).
Außerdem ist die Calprotectin-Immunhistochemie eine etablierte Methode zur
Bestimmung der neutrophilen Granulozyten im Gastrointestinaltrakt (GROSCHE et
al. 2008). Es gibt zwei Studien die die neutrophilen Granulozyten sowohl in der HE-
Färbung als auch in der Calprotectin-Immunhistochemie quantifiziert und die
Ergebnisse miteinander verglichen haben. Die eine Arbeit, welche alle
Darmschichten des equinen Jejunums untersuchte, ergab das die Verteilung der
Calprotectin positiven Zellen der Verteilung der neutrophilen Granulozyten in der HE-
Färbung entspricht (LITTLE et al. 2005). Eine weitere Studie, die die Tunica mucosa
und Tela submucosa des equinen Colon ascendens untersuchte, zeigte ebenfalls
eine signifikante Korrelation in der Anzahl der neutrophilen Granulozyten in der HE-
Färbung mit Calprotectin positiven Zellen in der Immunhistochemie (GROSCHE et al.
2008). Nach Etablierung haben mehrere Studien die Calprotectin-Immunhistochemie
zur Bestimmung der Anzahl der neutrophilen Granulozyten am equinen Darm
erfolgreich angewendet (MATYJASZEK et al. 2009; GRSOCHE et al. 2011;
HOPSTER-IVERSEN et al. 2011; VENTE 2011). Aus den genannten Gründen war
die Calprotectin-Immunhistochemie in der aktuellen Studie für die Bestimmung der
neutrophilen Granulozyten ebenfalls die Methode der Wahl.
5.2.3 Cyclooxygenase-1 und Cyclooxygenase-2
Die Expression der COX-1 und COX-2 in der Tunica muscularis und Tunica serosa
wurde in der vorliegenden Arbeit mit Hilfe der Immunhistochemie dargestellt, da die
zelluläre Verteilung der COX-1 und COX-2 positiven Zellen in der Tunica muscularis
und Tunica serosa beim Pferd bis jetzt nicht beschrieben ist. Auch die Beeinflussung
der Expression der beiden Enzyme in der Ring- und Längsmuskelschicht der Tunica
muscularis durch selektive NSAIDs und nicht selektive NSAIDs ist beim Pferd
150

Diskussion
immunhistochemisch nicht untersucht. Die Darstellung der COX-1 und COX-2 ist von
Interesse gewesen, da zum Beispiel eine unterschiedlich starke Expression der
Enzyme in der Ring- und Längsmuskelschicht Hinweise auf einen unterschiedlichen
Einfluss der selektiven NSAIDs und nicht selektiven NSAIDs liefern könnte. Damit
könnten eventuell Rückschlüsse auf eine unterschiedliche Motilitätsbeeinflussung
des Darms, durch eine unterschiedliche Hemmung der Prostaglandinbiosynthese,
durch NSAIDs gezogen werden.
Die COX-1- und COX-2-Immunhistochemie wurde am equinen Colon bereits
erfolgreich angewendet (MATYJASZEK et al. 2009; MORTON et al. 2009;
GROSCHE et al. 2011) und ist auch am Ileum des Schweins beschrieben
(BLIKSLAGER et al. 2002). Die genannten Arbeiten beschreiben alle ausschließlich
die Expression der COX-1 und COX-2 in der Tunica mucosa und Tela submucosa.
Für die Tunica muscularis und Tunica serosa liegen am Pferd keine Studien vor. In
weiteren Studien am Dünn- und Dickdarm des Pferdes wurde die COX-1 und COX-2
in Mucosaproben auf Proteinebene mit Hilfe des Western Blots (TOMLINSON et al.
2004; LITTLE et al. 2007b; COOK et al. 2009a; MATYJASZEK et al. 2009;
MARSHALL et al. 2011) und auf mRNA Ebene mit Hilfe der PCR (HILTON et al.
2011) nachgewiesen. Mit Hilfe des Western Blots und der PCR kann zwar ein
Nachweis der COX-1 und COX-2 im Gewebe erfolgen, diese Methoden geben aber
keinen Hinweis darauf, welche Zellen die COX exprimieren. Da dies für die aktuelle
Studie aber von Interesse war, wurde die Immunhistochemie zur Darstellung der
COX-1- und COX-2-Verteilung im Gewebe gewählt.
Um falsch positive Ergebnisse auszuschließen, wurden für beide Antikörper Negativund
Isotypenkontrollen durchgeführt. Sie zeigten für beide Antikörper keine
Reaktionen.
Zur Bestätigung der COX-1- und COX-2-Expression wurde die COX-1 und COX-2 in
der Tunica muscularis auf mRNA Ebene mit Hilfe der RT-PCR erfolgreich
nachgewiesen. Zusätzlich gelang für die COX-1 auch auf Proteinebene im Western
Blot ein erfolgreicher Nachweis in der Tunica muscularis. Dies gelang für die COX-2
trotz mehrmaliger Versuche nicht. Eine β-Aktin spezifische Bande bei 43 kDa zeigte
151

Diskussion
sich bei der COX-2, womit eine Proteinladung der Probe bestätigt wurde. Dies spricht
gegen das grundsätzliche Fehlen von Proteinen oder einen Fehler in der Probe. Da
auch die als Positivkontrolle eingesetzte Probe aus Tunica mucosa und Tela
submucosa keine COX-2 spezifische Bande erzeugte, deutet dies auf einen nicht
adäquat funktionierenden Primärantikörper hin.
5.3 Ergebnisse
5.3.1 Eosinophile Granulozyten
Sowohl in der Tunica muscularis als auch in der Tunica serosa wurden sehr selten
und vereinzelt eosinophile Granulozyten festgestellt. Ähnliche Befunde sind in den
Studien am equinen Colon (HOPSTER-IVERSEN et al. 2011) und Jejunum (VENTE
2011) beschrieben. Eine Zunahme der eosinophilen Granulozyten nach Ischämie
und Reperfusion des Jejunums konnte nicht beobachtet werden. Zu diesem Ergebnis
kommen auch Ischämie-Reperfusionsstudien, welche die Tunica mucosa des
equinen Colons untersucht haben (GROSCHE et al. 2011, 2012). Auch nach
mechanischer Manipulation des equinen Colons kam es zu keiner Zunahme der
eosinophilen Granulozyten in der Tunica muscularis und Tunica serosa (HOPSTER-
IVERSEN et al. 2011). Eine weitere Studie hingegen beobachtete in der frühen
Reperfusionsphase einen signifikanten Anstieg der eosinophilen Granulozyten in der
Tunica serosa des equinen Jejunums, nicht aber in der Tunica muscularis (VENTE
2011). Die Ergebnisse der Studien stimmen überein mit den Befunden von RÖTTING
et al. (2008a), die die eosinophilen Granulozyten als gewebsständige Zellen des
Gastrointestinaltraktes beschreibt. So können sie in die schnelle lokale
Immunantwort des Darms eingebunden werden (RÖTTING et al. 2008a). Die
genannten Studien deuten darauf hin, dass sich dieses nicht in der Zunahme der
Zellanzahl widerspiegelt, da keine oder nur eine geringe Rekrutierung der
eosinophilen Granulozyten beobachtet wurde. Aber es konnte eine Aktivierung,
gemessen an der Nitrotyrosinproduktion der Zellen nach ischämischer Schädigung,
festgestellt werden. Diese wurde während der frühen Reperfusionsphase aufrecht
erhalten (GROSCHE et al. 2012). Bei anderer Schädigung des Darms hingegen
kann eine Zunahme der eosinophilen Granulozyten beobachtet werden, so zum
Beispiel im Rahmen der idiopathischen fokalen eosinophilen Enteritis (IFEE) des
152

Diskussion
Pferdes. Dabei konnte eine Leukozytenakkumulation, bei der die eosinophilen
Granulozyten und Makrophagen die dominierenden Zellspezies waren, in der Tela
submucosa und Tunica muscularis des equinen Darms festgestellt werden
(MÄKINEN et al. 2008). Insgesamt deuten die Befunde der Studien auf
unterschiedliche Bedeutung und Aufgaben der eosinophilen Granulozyten bei
verschiedenen Schädigungen des Gastrointestinaltraktes hin.
5.3.2 Neutrophile Granulozyten
5.3.2.1 Allgemein
In der ersten ungeschädigten Jejunumprobe (K1) wurden keine oder selten einzelne
neutrophile Granulozyten festgestellt. In nichtgeschädigten Proben vom distalen bzw.
proximalen Jejunum von nicht gastrointestinal erkrankten Pferden waren die
Ergebnisse vergleichbar (LITTLE et al. 2005; VENTE 2011). Die Ergebnisse deuten
daraufhin, dass sich im nicht geschädigten Jejunum keine bis sehr wenige
neutrophile Granulozyten befinden.
In der zweiten ungeschädigten Jejunumprobe (K2) war die Anzahl der neutrophilen
Granulozyten trotz nicht vorhandener Manipulation des Darmabschnittes im
Vergleich zur ersten ungeschädigten Jejunumprobe signifikant erhöht. In der dritten
ungeschädigten Jejunumprobe (K3) war die Neutrophileninfiltration in
Ringmuskelschicht und intermuskulärer Schicht signifikant höher als in der zweiten
ungeschädigten Jejunumprobe. Dies lässt vermuten, dass bereits die Ischämie und
Reperfusion vom benachbarten Darmabschnitt zu einer Infiltration mit neutrophilen
Granulozyten in den nicht manipulierten Darmabschnitt geführt hat. Die Befunde
deuten darauf hin, dass bei einer Dünndarmstrangulation und damit einhergehender
Ischämie mit anschließender Reperfusion von einer Entzündungsreaktion in
benachbarten, makroskopisch ungeschädigten Darmabschnitten ausgegangen
werden muss. KALFF et al. (1998a) beschreiben bei der Ratte bereits eine Infiltration
der Tunica muscularis externa des distalen Jejunums mit neutrophilen Granulozyten
nach Öffnung der Bauchhöhle und bei Öffnung der Bauchhöhle mit Vorlagern des
Darms. Dieselben Beobachtungen wurden am Colon der Ratte gemacht (TÜRLER et
al. 2002). Die Eröffnung der Bauchhöhle und das Vorlagern des Darms scheint beim
153

Diskussion
Pferd eine eher untergeordnete Rolle in Hinblick auf die Infiltration mit neutrophilen
Granulozyten in die Tunica muscularis zu haben, denn in den ersten Kontrollproben
(K1) wurden nur selten neutrophile Granulozyten beobachtet.
In beiden oben genannten Studien konnte ein deutlicher Anstieg der neutrophilen
Granulozyten in der Tunica muscularis externa nach Ausstreichen und Kompression
des Dünndarms (KALFF et al. 1998a) bzw. Dickdarms (TÜRLER et al. 2002)
festgestellt werden. Ein einfaches Ausstreichen des Darms wurde in der aktuellen
Studie nicht durchgeführt. Ob es zu einer Entzündungszellinfiltration nach
Ausstreichen des gesamten Dünndarms bzw. nach mehrmaligem Ausstreichen, wie
es in der Kolikchirurgie teilweise notwendig ist, kommt könnte das Ziel weiterer
Studien sein. Bekannt ist, dass eine mechanische Manipulation auch am equinen
Colon zu einer Entzündungsreaktion führt (HOPSTER-IVERSEN et al. 2011). So
konnte nach 10-minütiger Manipulation der Tunica mucosa mit einem feuchten
Tupfer ein signifikanter Anstieg der neutrophilen Granulozyten in der Tunica mucosa,
Tela submucosa und Tunica serosa festgestellt werden. Bei gleicher Manipulation
der Tunica serosa kam es zu einem signifikanten Anstieg der neutrophilen
Granulozyten in der Tela submucosa, der Ringmuskelschicht der Tunica muscularis
und der Tunica serosa (HOPSTER-IVERSEN et al. 2011).
Dass es nach Ischämie bzw. nach Ischämie und Reperfusion in benachbarten
Darmabschnitten zu einer deutlichen Infiltration mit neutrophilen Granulozyten
kommt, wie es in der vorliegenden Arbeit festgestellt wurde, ist in anderen Studien
am equinen Jejunum und Colon nicht beschrieben (TOMLINSON et al. 2004; LITTLE
et al. 2005, 2007a; MATYJASZEK et al. 2009). Nach 18-stündiger Reperfusion des
equinen Jejunums konnte in der Kontrollprobe, die in einem Meter Abstand zur
Reperfusionsprobe entnommen wurde, kein Anstieg in der Anzahl der neutrophilen
Granulozyten festgestellt werden (TOMLINSON et al. 2004). Denkbar wäre, dass
keine Erhöhung der Anzahl der neutrophilen Granulozyten 18 Stunden nach Beginn
der Reperfusion festgestellt wurde, weil die Zellen bereits wieder aus dem Gewebe
migriert waren. Studien die die Zellinfiltration des Darms über einen Zeitraum von 18
Stunden Reperfusion untersucht haben sind nicht bekannt, so dass diese Vermutung
154

Diskussion
nicht abschließend beantwortet werden kann. Die Ursache für die in den
Kontrollproben der vorliegenden Arbeit beobachtete starke Infiltration ist fraglich. Der
Abstand der Kontrollproben zum ischämisch geschädigten Darm betrug einen Meter
und lag damit bei einem Abstand mit dem andere Studien auch arbeiteten
(TOMLINSON et al. 2004; LITTLE et al. 2005, 2007b; TOMLINSON und
BLIKSLAGER 2005). Einige Studien entnahmen die Kontrollproben erst nach
Ischämie und Reperfusion vom benachbarten, ungeschädigten Jejunum
(TOMLINSON et al. 2004; LITTLE et al. 2005, 2007a) bzw. Colon (MATYJASZEK et
al. 2009). Diese Studien beschreiben einen signifikanten Unterschied zwischen den
ischämisch geschädigten bzw. durch Ischämie und Reperfusion geschädigten
Proben im Vergleich zu den Kontrollproben. Allerdings wurden in diesen Studien
keine Kontrollproben vor Beginn der Ischämie entnommen, so dass nicht beurteilt
werden kann, ob die nach Ischämie bzw. Ischämie-Reperfusion entnommenen
Kontrollproben zwar signifikant weniger Zellen als die geschädigten Proben
aufwiesen, aber mehr Zellen als Proben vor Anlegen der Ischämie aufgewiesen
hätten. Daher kann nicht beurteilt werden, ob es in diesen Studien bereits Hinweise
auf eine verstärkte Entzündungsreaktion in nicht manipulierten Darmabschnitten gab.
In den Studien von GROSCHE et al. (2008) und GROSCHE et al. (2011) wurden
Kontrollproben vor dem Anlegen der Ischämie entnommen, um Einflüsse von
Ischämie und Reperfusion auszuschließen. Nach Ischämie und Reperfusion wurden
keine Proben von benachbartem ungeschädigtem Darm entnommen. Somit ist die in
unserer Studie vorgenommene Entnahme einer ungeschädigten Kontrolle vor
Anlegen der Ischämie, sowie nach Ischämie und Reperfusion bisher in keiner
anderen Studie beschrieben. Zum einen gab es im Vorfeld unserer Studie keine
Untersuchungen am Pferd, die ungeschädigte Darmproben vor und nach Ischämie
bzw. Ischämie-Reperfusion verglichen haben und damit auch keine Hinweise, die auf
eine so starke Entzündungsreaktion im ungeschädigten Darm schließen ließen. Zum
anderen wurde die Zellinfiltration in Kontrollproben nach Ischämie bzw. Ischämie-
Reperfusion in den oben genannten Studien nicht als auffällig beschrieben, somit
gab es keine Hinweise einer starken Entzündungsreaktion in benachbarten
Darmabschnitten, so dass das vorliegende Versuchsmodell gewählt wurde.
155

Diskussion
5.3.2.2 Vergleichende Betrachtung in der Ring- und Längsmuskelschicht
In der Probe, die nach 90 Minuten Ischämie und 30 Minuten Reperfusion (R1)
entnommen wurde, befanden sich in der Längsmuskelschicht schwach signifikant
(p = 0,052) mehr Calprotectin positive Zellen im Vergleich zur Ringmuskelschicht. In
zwei weiteren Ischämie-Reperfusionsstudien am equinen Jejunum waren in den
Reperfusionsproben in der Längsmuskelschicht ebenfalls signifikant mehr
neutrophile Granulozyten als in der Ringmuskelschicht (LITTLE et al. 2005; VENTE
2011). Bei mechanischer Manipulation der Serosa des equinen Colons wurde
hingegen ein signifikanter Anstieg an neutrophilen Granulozyten in der zirkulären
Muskelschicht im Vergleich zur Kontrollprobe festgestellt. In der Längsmuskelschicht
kam es zu keiner signifikanten Zunahme der neutrophilen Granulozyten
(HOPSTER-IVERSEN et al. 2011). Die Ergebnisse der Studien werfen die Frage auf,
ob es an der Art der Manipulation liegt in welche Muskelschicht die neutrophilen
Granulozyten vermehrt migrieren oder ob der Unterschied abhängig ist von den
verschiedenen untersuchten Darmabschnitten, Jejunum und Colon. Diese
Fragestellung in Kombination mit einer Motilitätsstudie zu untersuchen sollte das Ziel
weiterer Studien sein, um in Hinblick auf die Ursachen des POI beim Pferd weitere
Erkenntnisse zu erlangen.
5.3.2.3 Neutrophilencluster in der Tunica muscularis und Tunica serosa
Es wurden clusterförmige Ansammlungen von neutrophilen Granulozyten
beobachtet. Die Mehrheit befand sich in den Reperfusionsproben. Eine mögliche
Erklärung dafür ist, dass es nach der Öffnung der Gefäße und der damit
verbundenen Wiederherstellung des Blutflusses zu einem weiteren Einstrom von
Zellen in das Gewebe kommt. Die Cluster aus neutrophilen Granulozyten lagen vor
allem in der Tunica serosa und der Längsmuskelschicht. Diese Beobachtung stimmt
mit den Ergebnissen der Vorgängerarbeit überein, welche die meisten Cluster
ebenfalls in der Tunica serosa, der Längsmuskelschicht und vor allem in den
Reperfusionsproben festgestellt hat (VENTE 2011). Die Studie von VENTE (2011)
diskutiert eine hämodynamische Ursache, da die Cluster häufig um Gefäße
beobachtet wurden. Eine Arbeit am Gastrointestinaltrakt der Ratte beschreibt im
nicht manipulierten Darm Neutrophilencluster oberhalb von Peyerschen Platten
156

Diskussion
(KALFF et al. 1998b). In der Arbeit wird ein Zusammenhang mit der Abschirmung
bakterieller Produkte vermutet. Da die in der vorliegenden Arbeit untersuchten
Proben vom mittleren equinen Jejunum stammen und sich in diesem Darmabschnitt
keine Peyerschen Platten befinden kann eine Assoziation von neutrophilen
Granulozyten und Peyerschen Platten in dieser Studie nicht beurteilt werden.
Fraglich ist, warum in keiner anderen Ischämie-Reperfusionsstudie am equinen
Darm Neutrophilencluster beschrieben sind. Mögliche Ursachen sind das in der
vorliegenden Arbeit und in der Vorgängerstudie von VENTE (2011) gewählte
ähnliche Ischämie-Reperfusionsmodell oder das andere Arbeiten die
Zellansammlungen nicht beschrieben haben. Des Weiteren sind Studien notwendig,
um die Ursache und die Bedeutung der Cluster näher zu charakterisieren.
5.3.2.4 Einfluss der nichtsteroidalen Antiphlogistika
Es wurde in keiner der mit einem NSAID behandelten Proben (I2, R2, K3) ein
signifikanter Unterschied in der Anzahl der Calprotectin positiven Zellen zwischen
den beiden Behandlungsgruppen Flunixin-Meglumin und Firocoxib festgestellt. Dies
stimmt mit einer weiteren Ischämie-Reperfusionsstudie, in der equine
Jejunumproben 18 Stunden nach Ende einer ein- oder zweistündigen Ischämie
untersucht wurden, überein. In der Studie wurde in allen Darmschichten die Anzahl
der neutrophilen Granulozyten bestimmt und in keiner gab es einen signifikanten
Unterschied zwischen den Behandlungsgruppen mit Kochsalzlösung
(Kontrollgruppe), dem nicht selektiven NSAID Flunixin-Meglumin und dem selektiven
NSAID Etodolac. Die NSAIDs bzw. das NaCl wurde am Ende der Ischämie gegeben
(LITTLE et al. 2005). Eine weitere Studie konzentrierte sich auf die equine Tunica
mucosa und stellte in den Proben, welche direkt nach einer zweistündigen Ischämie
entnommen wurden, keinen Unterschied zwischen den Behandlungsgruppen (NaCl,
Flunixin-Meglumin und Meloxicam) fest (LITTLE et al. 2007b). In den Proben, die
nach 18-stündiger Reperfusion im Anschluss an die zweistündige Ischämie
entnommen wurden, befanden sich in den mit Flunixin-Meglumin und Meloxicam
behandelten Proben signifikant mehr neutrophile Granulozyten als in den mit NaCl
behandelten. Die NSAIDs bzw. die isotonische Kochsalzlösung wurde eine Stunde
vor dem Anlegen der Ischämie gegeben (LITTLE et al. 2007b). In einer Studie am
157

Diskussion
equinen Colon ergaben sich sowohl in den Proben, die direkt nach zweistündiger
Ischämie als auch in den Proben, die nach 18-stündiger Reperfusion entnommen
wurden, keine signifikanten Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen NaCl
und Flunixin-Meglumin, das mit Beginn der Reperfusion verabreicht wurde
(MATYJASZEK et al. 2009). Den Studien ist zum einen gemeinsam, dass keine
Unterschiede zwischen den nicht selektiven NSAIDs und den selektiven NSAIDs in
Bezug auf den Neutrophileneinstrom festgestellt wurden und zum anderen, dass
sowohl die nicht selektiven NSAIDs als auch die selektiven NSAIDs nicht zu einer
Reduktion der Anzahl der neutrophilen Granulozyten sowohl nach Ischämie als auch
nach Ischämie und Reperfusion geführt haben. Obwohl dies nur ein kleiner Pool an
Studien ist, werfen die Ergebnisse die Frage auf, ob NSAIDs beim Pferd überhaupt
einen Einfluss auf den Neutrophileneinstrom nehmen und ob dieser durch andere
Medikamente, wie steroidale Antiphlogistika, reduziert werden kann. Die Reduktion
der Entzündungsreaktion des durch Ischämie und Reperfusion geschädigten equinen
Darms sollte weiterhin das Ziel von zukünftigen Studien sein.
Wie oben bereits diskutiert, ergab der Vergleich der Wirkung der beiden NSAIDs auf
die Neutrophileninfiltration keinen Unterschied zwischen den Behandlungsgruppen.
Dieses Ergebnis ist allerdings nur eingeschränkt beurteilbar, da die zweite
ungeschädigte Jejunumprobe (K2) bereits eine deutliche Infiltration mit neutrophilen
Granulozyten aufwies, die zum Teil höher war als in den folgenden Ischämie- und
Reperfusionsproben. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Fragestellung dieser
Studie, die Überprüfung des Einflusses von NSAIDs auf die durch Ischämie und
Reperfusion verursachte Entzündungsreaktion, nicht beurteilt werden kann, da eine
Entzündungszellinfiltration bereits vor der Schädigung des Jejunums durch Ischämie
und Reperfusion bestand. Es kann keine Aussage darüber getroffen werden, ob es
auch beim Pferd Hinweise gibt, dass die Neutrophilenrekrutierung durch NSAIDs
beeinflusst wird und inwieweit ein Zusammenhang zwischen neutrophilen
Granulozyten, NSAID und Motilität besteht. In weiteren Studien sollte mit einem
veränderten Versuchsaufbau das ursprüngliche Ziel dieser Studie evaluiert werden.
Wobei auch in anderen Studien am equinen Jejunum und Kolon, die andere
Ischämie-und Reperfusionsmodelle verwendeten und in denen die NSAIDs vor dem
158

Diskussion
Anlegen oder direkt vor dem Lösen der Ischämie intravenös verabreichten wurden,
keine Reduktion der Infiltration der neutrophilen Granulozyten in die Tunica mucosa
(TOMLINSON et al. 2004; LITTLE et al. 2007b; MATYJASZEK et al. 2009) bzw. in
alle Darmschichten (LITTLE et al. 2005) beobachtet werden konnte. Dagegen konnte
eine Studie am Dünndarm der Ratte eine signifikante Abnahme der Extravasation
von neutrophilen Granulozyten in die intestinale Tunica muscularis feststellen, wenn
vor der mechanischen Dünndarmmanipulation Dexamethason intravenös verabreicht
wurde (SCHWARZ et al. 2004).
5.3.2.5 Klinische Relevanz
5.3.2.5.1 Postoperativer Ileus
In der aktuellen Studie wurde auch in nicht manipulierten, makroskopisch
unveränderten Jejunumabschnitten eine Entzündungsreaktion festgestellt. Dieses
wirft die Frage auf, inwiefern diese Darmabschnitte, die im Rahmen der
Kolikchirurgie nicht reseziert werden würden, zur Entwicklung eines POI neigen. Bei
der Ratte war die Entzündungsreaktion in Folge der Darmmanipulation mit einer
Beeinträchtigung der Colonmotorik in vivo und einer Hemmung der glatten
Muskulatur in vitro assoziiert (TÜRLER et al. 2002). In einer weiteren Studie an
Ratten wurde nach Manipulation des Jejunums eine Hemmung der gesamten
gastrointestinalen Passage in vivo sowie eine Reduktion der zirkulären
Muskelkontraktilität in vitro beobachtet. Bei Vorbehandlung der Ratten mit
Dexamethason konnte eine Reduktion der Extravasation der neutrophilen
Granulozyten in die Tunica muscularis beobachtet werden und es kam zu keiner
Beeinflussung der Jejunumkontraktilität (SCHWARZ et al. 2004). Ob es beim Pferd
mit steigender Infiltration der neutrophilen Granulozyten in die Ring- und
Längsmuskelschicht zu einer Reduktion der Kontraktilität der Muskelschichten
kommt, muss die zu der vorliegenden Arbeit parallel durchgeführte Studie, welche
die Kontraktilität der Ring- und Längsmuskelschicht von durch Ischämie und
Reperfusion geschädigtem equinen Jejunum in vitro untersucht, zeigen.
Desweiteren ist unklar, ob die deutliche Infiltration von neutrophilen Granulozyten in
den nicht manipulierten Darmabschnitten des mittleren Jejunums auch weitere
159

Diskussion
Darmanteile betrifft. Dies muss in weiteren Studien durch Probenentnahme von
anderen Darmabschnitten (Duodenum, proximales und distales Jejunum, Ileum,
Caecum, Colon) untersucht werden. Eine Studie liegt dazu bereits vor, so konnten
HOPSTER-IVERSEN et al. (2011) nach Ischämie-Reperfusion am equinen Jejunum
keinen signifikanten Anstieg von neutrophilen Granulozyten in der Darmwand des
Colons feststellen.
5.3.2.6 Versuchsaufbau
Die deutliche Infiltration der zweiten und dritten Kontrollprobe (K2 und K3) mit
neutrophilen Granulozyten zeigt, dass der gewählte Versuchsaufbau mit zwei
identischen Versuchsabschnitten seinen Zweck nicht erfüllt hat. Denn bereits in dem
nicht manipulierten Jejunumabschnitt der Kontrollprobe K2 lag eine deutliche
Entzündungszellinfiltration vor, so dass diese und die folgende mit einem NSAID
behandelte Ischämie- (I2) und Reperfusionsprobe (R2) nur eingeschränkt mit den
unbehandelten Ischämie- (I1) und Reperfusionsproben (R1) verglichen werden
konnten. Somit kann die Wirkung der beiden NSAIDs auf die Entzündungsrektion nur
eingeschränkt beurteilt werden und auch ein Vergleich der beiden NSAIDs ist nur mit
Einschränkungen möglich. Deswegen sollte in weiteren Studien der in dieser Arbeit
gewählte Versuchsaufbau nicht erneut genutzt werden. Stattdessen sollte eine
Kontrollgruppe von Pferden eingesetzt werden, die NaCl anstatt eines NSAIDs
erhalten, so wie es in anderen Studien beschrieben ist und erfolgreich durchgeführt
wurde (LITTLE et al. 2005, 2007b; COOK et al. 2009a; MATYJASZEK et al. 2009;
MORTON et al. 2011).
5.3.3 Cyclooxygenase-1
5.3.3.1 Konstitutive Expression
Die COX-1 wurde konstitutiv exprimiert. Mit der deskriptiven Auswertung konnte
keine weitere Zunahme in den Ischämie- und Reperfusionsproben festgestellt
werden. Es sind keine weiteren Studien bekannt, welche die Expression der COX-1
in der Tunica muscularis und Tunica serosa am Pferdedarm untersucht haben. Die
Expression in der Tunica mucosa und Tela submucosa hingegen ist in mehreren
Studien beschrieben. So wurde eine konstitutive Expression der COX-1 sowohl mit
Hilfe der Immunhistochemie im Colon in den Zellen der Tela submucosa beobachtet
160

Diskussion
(MATYJASZEK et al. 2009; MORTON et al. 2009; GROSCHE et al. 2011) als auch
im Western Blot im Jejunum und Colon nachgewiesen (TOMLINSON et al. 2004;
COOK et al. 2009a; MATYJASZEK et al. 2009; MARSHALL et al. 2011). Eine
weitere Arbeit, welche die gesamte Jejunumwand mit Hilfe der PCR untersuchte,
beschreibt ebenfalls eine konstitutive Expression der COX-1 (HILTON et al. 2011).
Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die COX-1 im Pferdedarm konstitutiv
exprimiert wird. Diese Beobachtungen decken sich mit den Ergebnissen von Studien
bei anderen Spezies, die ebenfalls eine konstitutive COX-1-Expression beschreiben:
im gesamten Gastrointestinaltrakt der Ratte (HAWORTH et al. 2005) sowie der
Magenmucosa der Ratte (SCHMASSMANN et al. 1998), in glatten Muskelzellen des
Colons der Maus (PORCHER et al. 2004) und in humanen glatten Muskelzellen des
Darms (LONGO et al. 1998a).
5.3.3.2 Expression bei ischämischer Schädigung
Nach ischämischer Schädigung konnte in der vorliegenden Arbeit keine Zunahme
der COX-1 positiven Zellen in der Tunica muscularis und Tunica serosa festgestellt
werden. Dazu gibt es in der Literatur verschiedene Angaben. In zwei Studien wurde
ein signifikanter Anstieg der COX-1 in der Tunica mucosa des equinen Colons
(MATYJASZEK et al. 2009) sowie des Jejunums (TOMLINSON et al. 2004) in
ischämisch geschädigten Darmabschnitten festgestellt. Diese Beobachtungen stehen
im Gegensatz zu den Ergebnissen der aktuellen Studie und denen von anderen
Arbeiten, die in der Tunica mucosa des equinen Colons (GROSCHE et al. 2011) und
des Jejunums (COOK et al. 2009a; HILTON et al. 2011; MARSHALL et al. 2011)
keine Zunahme der COX-1-Expression festgestellt haben. Eine Einschränkung der
Vergleichbarkeit mit der vorliegenden Studie kann darin gesehen werden, dass die
genannten Studien ausschließlich die COX-1-Expression in der Tunica mucosa und
zum Teil in der Tela submucosa untersucht haben und die aktuelle Studie in der
Tunica muscularis und Tunica serosa. Aber auch in weiteren Ischämie-
Reperfusionsstudien an anderen Tierarten und Organen wurde die
COX-1-Expression durch Ischämie und Reperfusion nicht beeinflusst. So hat eine
90-minütige Ischämie keinen Einfluss auf die konstitutive COX-1-Expression an der
Niere der Ratte gezeigt (MATSUYAMA et al. 2004) und auch an den Gehirnarterien
161

Diskussion
des Schweins blieb die COX-1-Expression durch Ischämie unbeeinflusst (DOMOKI
et al. 1999).
5.3.3.3 Expression bei Schädigung durch Reperfusion
In der vorliegenden Studie wurde keine Zunahme der COX-1-Expression in den
Reperfusionsproben festgestellt. Dies stimmt überein mit drei weiteren Ischämie-
Reperfusionsstudien, die die Tunica mucosa am equinen Jejunum (Western Blot)
(TOMLINSON et al. 2004) bzw. Colon (Immunhistochemie) (GROSCHE et al. 2011)
bzw. der gesamten equinen Jejunumwand (real time PCR) (HILTON et al. 2011)
untersucht haben. Auch an der Niere der Ratte (MATSUYAMA et al. 2004) und den
Gehirnarterien des Schweins (DOMOKI et al. 1999) wurde nach Reperfusion des
Gewebes keine Zunahme der COX-1-Expression festgestellt. Es gibt allerdings zwei
Studien am equinen Jejunum bzw. Colon, die in der Immunhistochemie bzw. im
Western Blot einen signifikanten Anstieg der COX-1-Expression nach Reperfusion in
Tunica mucosa festgestellt haben (COOK et al. 2009a; MATYJASZEK et al. 2009). In
diesen beiden Arbeiten wurden die Proben nach 18-stündiger Reperfusion
entnommen, so dass der Anstieg der COX-1-Expression möglicherweise auf die
lange Reperfusionszeit zurückzuführen ist.
5.3.3.4 Einfluss der nichtsteroidalen Antiphlogistika auf die Expression
In der aktuellen Studie wurde kein Unterschied in der COX-1-Expression zwischen
den Behandlungsgruppen festgestellt. Dieses stimmt überein mit den Ergebnissen
von zwei weiteren Ischämie-Reperfusionsstudien am Pferdedarm, die verschiedene
selektive und nicht selektive NSAIDs eingesetzt haben und ebenfalls keinen Effekt
feststellen konnten (MATYJASZEK et al. 2009; MARSHALL et al. 2011). Im
Gegensatz dazu steht die Untersuchung von COOK et al. (2009a), die eine
signifikant stärkere COX-1-Expression bei Pferden, die ein Placebo (NaCl) erhielten,
im Vergleich mit Firocoxib behandelten Pferden feststellte, wohingegen der Vergleich
mit Flunixin-Meglumin keinen signifikanten Unterschied ergab. Die direkte
Vergleichbarkeit dieser Studien mit unseren Ergebnissen ist nur mit Einschränkung
möglich, da es sich in allen Studien um Proben handelte, die nach 18 Stunden
Reperfusion entnommen wurden und somit eine wesentlich längere Reperfusionszeit
hatten.
162

Diskussion
5.3.3.5 Expression in der Tunica muscularis
In der aktuellen Studie konnte eine konstitutive COX-1-Expression in der glatten
Muskulatur des equinen Jejunums nachgewiesen werden. In den glatten
Muskelzellen des Colons der Ratte sowie in glatten intestinalen Muskelzellen des
Menschen wurde ebenfalls eine COX-1-Expression festgestellt (LONGO et al. 1998a;
PORCHER et al. 2004). Beim Pferd ist bislang keine Studie bekannt, die dies
untersucht hat. Die Bedeutung der in der vorliegenden Arbeit deutlich stärkeren und
häufig auch ausschließlichen Expression der COX-1 in der Ringmuskelschicht (im
Vergleich zur Längsmuskelschicht), ist ein interessanter Befund und erfordert
weiteren Forschungsbedarf. Denkbar wäre, dass die beiden Muskelschichten
entsprechend der COX-Expression mit Prostaglandinen versorgt werden und dieses
einen Einfluss auf die Kontraktilität der glatten Muskelzellen und damit auf die
Darmmotilität hat. Hinweise darauf liefert eine in vitro Studie am equinen Colon. Bei
der Zugabe von exogenen Prostaglandinen wurden je nach Colonabschnitt und in
Abhängigkeit von Ring- und Längsmuskelschicht unterschiedliche Effekte auf die
Kontraktilität der glatten Muskulatur beobachtet (VAN HOOGMOED et al. 2000).
5.3.3.5.1 Expression innerhalb der Muskelzellen
In der aktuellen Studie wurde lichtmikroskopisch vor allem eine deutliche
perinukleäre COX-1-Expression sowie eine geringgradige, diffuse Färbung des
Zytoplasmas der Muskelzellen festgestellt. Diese Beobachtungen ähneln denen
anderer Studien, die unter anderem mit Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie
gearbeitet haben und denen damit eine detaillierte Beschreibung der
COX-1-Expression gelungen ist. Bei murinen 3T3 Zellen ist eine COX-1-Expression
im perinukleären Zytoplasma beschrieben (MORITA et al. 1995). Noch detailliertere
Untersuchungen am selben Zelltyp deuten daraufhin, dass es sich um luminale
Proteine des endoplasmatischen Retikulums handelt (OTTO u. SMITH 1994). In
humanen und porcinen cerebralen Endothelzellen sowie in HUVEC sind zwei
Hauptlokalisationen für die COX-1-Expression beobachtet worden. Zum einen eine
perinukleäre Expression inklusive Kernhülle und zum anderen eine Expression im
Zytoplasma, von granulärem und fibrillärem Charakter (PARFENOVA et al. 2001).
Die detaillierte Untersuchung des Kerns ergab eine COX-1-Lokalisation in der
163

Diskussion
Kernhülle sowie in der Nähe von Kernporen (PARFENOVA et al. 2001). Die
detaillierten Untersuchungen unterstützen unsere lichtmikroskopisch
vorgenommenen Beobachtungen an den glatten Muskelzellen des equinen
Jejunums. Ob die genaue zelluläre Lokalisation in den equinen glatten Muskelzellen
mit den Ergebnissen der anderen Studien übereinstimmt, kann nur mit weiteren
Untersuchungsverfahren überprüft werden.
5.3.3.6 Expression in Zellen (ausgenommen Muskelzellen) der Tunica
muscularis und Tunica serosa
Die COX-1 positiven Zellen vom Typ A zeigten eine homogene, die ganze Zelle
ausfüllende Färbung und hatten eine runde Form. Die Morphologie lässt vermuten,
dass es sich bei den Zellen um Lymphozyten handelt. Gegen Makrophagen spricht
die fehlende Differenzierung von Zellkern und Zytoplasma. Der Zelltyp B hatte eine
spindelförmige Form, teilweise mit zytoplasmatischen Fortsätzen. Die Färbung war
homogen, wobei die Fortsätze nur eine schwache bis keine Färbung aufwiesen. Die
Morphologie gibt Hinweise, dass es sich bei den Zellen eventuell um Fibroblasten
handeln könnte. Die Beobachtungen stimmen mit der Beschreibung einer Arbeit am
equinen Colon überein, welche die COX-1 positiven Zellen als Fibroblasten,
Lymphozyten und Makrophagen anspricht (MORTON et al. 2009). Weitere Studien
am equinen und murinen Colon beschreiben lediglich COX-1 positive Zellen in der
Tela submucosa, ohne weitere Differenzierung (REUTER et al. 1996; MATYJASZEK
et al. 2009; GROSCHE et al. 2011). Da die Zellen auch in Kontrollschnitten
vorhanden waren, ist es naheliegend, dass es sich um gewebsständige Zellen, wie
Fibrozyten und gewebsständige Immunzellen handelt. Eine genauere Bestimmung
der Zelltypen könnte in weitergehenden immunhistochemischen Untersuchungen
vorgenommen werden, zum Beispiel mit einer immunhistochemischen
Doppelfärbung.
5.3.3.7 Expression in den Endothelzellen
Es konnte eine konstitutive COX-1-Expression in den Endothelzellen festgestellt
werden, wobei nicht alle Gefäße eines Schnittes eine positive Reaktion aufwiesen. In
der Magenmucosa des Kaninchens und des Menschen wurde ebenfalls eine
konstitutive COX-1-Expression in den Endothel-, aber auch in den glatten
164

Diskussion
Muskelzellen der Tunica media venöser und arterieller Gefäße festgestellt
(ZIMMERMANN et al. 1998). Die glatten Gefäßmuskelzellen wurden in der
vorliegenden Arbeit nur selten beobachtet und wiesen keine positive
COX-1-Expression auf. Für die Endothelzellen im Gehirn des Schweins und des
Menschen ist ebenfalls eine konstitutive Expression beschrieben (PARFENOVA et
al. 1997, 2001). Ähnlich zu den Beobachtungen der aktuellen Studie beschreibt eine
Arbeit am equinen Colon nur im unteren Abschnitt der Tela submucosa COX-1
positive Endothelzellen, im oberen Abschnitt wurden keine positiven Reaktionen
beobachtet (MORTON et al. 2009). Worauf diese unterschiedliche Expression der
COX-1 in den Endothelzellen, die in unserer Studie häufig auch in
nebeneinanderliegenden Gefäßen beobachtet wurde beruht, ist fraglich. Möglich
wäre, dass es sich um verschiedene Gefäßtypen wie Venolen und Arteriolen oder
um Lymphgefäße handelt.
5.3.4 Cyclooxygenase-2
5.3.4.1 Konstitutive Expression
Es wurde nur vereinzelt in Endothelzellen eine konstitutive COX-2-Expression
festgestellt. In immunhistochemischen Studien am equinen Colon ist eine konstitutive
Expression für die Epithel- und Kryptenzellen der Tunica mucosa und die
Immunzellen der Tela submucosa beschrieben (MATYJASZEK et al. 2009;
MORTON et al. 2009; GROSCHE et al. 2011). Auch Untersuchungen auf
Proteinebene (Western Blot) zeigten eine geringe konstitutive COX-2-Expression in
der Tunica mucosa und Tela submucosa des equinen Darms (TOMLINSON et al.
2004; COOK et al. 2009a; MATYJASZEK et al. 2009; MARSHALL et al. 2011).
Dieses konnte in der aktuellen Studie in der Tunica muscularis und Tunica serosa
nicht beobachtet werden. Die unterschiedlichen Ergebnisse sind möglicherweise auf
die verschiedenen untersuchten Darmschichten und Darmabschnitte zurückzuführen.
Untersuchungen an anderen Tierarten kamen bezüglich der konstitutiven
COX-2-Expression zu unterschiedlichen Ergebnissen. In Enterozytenkulturen des
Ileums der Ratte wurde eine konstitutive COX-2-Expression beobachtet (LONGO et
al. 1998b). In der Tela submucosa sowie Tunica muscularis des Colons der Ratte
(REUTER et al. 1996) und im Colon von gesunden Schweinen (CHO u. CHAE 2004)
165

Diskussion
konnte keine COX-2-Expression festgestellt werden. Die Studien deuten darauf hin,
dass die COX-2-Expression zwischen den verschiedenen Schichten des Darms,
Darmabschnitten und Tierarten möglicherweise unterschiedlich ist.
5.3.4.2 Expression bei ischämischer Schädigung
Die COX-2-Expression war in der ersten Ischämieprobe weniger stark ausgeprägt als
in der zweiten. Bei beiden Ischämieproben konnte ein Anstieg der COX-2-Expression
im Vergleich zur Kontrollprobe festgestellt werden. Dies ist übereinstimmend mit
anderen Studien am equinen Jejunum (TOMLINSON et al. 2004; COOK et al. 2009a;
MARSHALL et al. 2011) und Colon (MATYJASZEK et al. 2009; MORTON et al.
2009; GROSCHE et al. 2011). Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine
ischämische Schädigung des equinen Darms zu einer Induktion der COX-2 führt.
Diese scheint nicht nur den direkt geschädigten Darm zu betreffen, sondern auch
benachbartes Gewebe. Dies wird durch die zweite und dritte Kontrollprobe der
vorliegenden Arbeit deutlich, in denen eine COX-2-Expression festgestellt wurde,
nachdem benachbarte Darmabschnitte durch Ischämie und Reperfusion geschädigt
wurden. Auch eine andere Studie am equinen Colon schließt nicht aus, dass die
COX-2-Expression, die in den ungeschädigten Darmabschnitten festgestellt wurde,
durch eine Ischämie in benachbarten Kolonabschnitten hervorgerufen wurde
(MATYJASZEK et al. 2009).
5.3.4.3 Expression bei Schädigung durch Reperfusion
In den Reperfusionsproben konnte eine Zunahme der COX-2-Expression im
Vergleich zur Kontrollprobe festgestellt werden. Diese Beobachtung stimmt überein
mit den Ergebnissen weiterer Ischämie-Reperfusionsstudien am equinen Dünn- und
Dickdarm (COOK et al. 2009a; MORTON et al. 2009; GROSCHE et al. 2011;
HILTON et al. 2011). Deutliche Unterschiede zur Ischämieprobe konnten in der
aktuellen Arbeit nicht festgestellt werden. Dies beschreibt auch eine weitere Studie
am equinen Jejunum, die nach 18-stündiger Reperfusion nicht einmal einen
deutlichen Unterschied zur Kontrollprobe festgestellt hat (TOMLINSON et al. 2004).
Wobei dieser Befund auch an der 18-stündigen Reperfusion liegen könnte, während
der die COX-2-Expression nach Induktion durch die Ischämie eventuell wieder
reduziert wurde. Die Ergebnisse werden unterstützt von einer weiteren Studie am
166

Diskussion
equinen Colon (GROSCHE et al. 2011), bei der nach einer Stunde Reperfusion
signifikant mehr COX-2 exprimiert wurde als nach zwei und vier Stunden. Auch an
der Niere der Ratte (MATSUYAMA et al. 2004) war die COX-2-Expression nach 1,5
bis 5 Stunden Reperfusion stärker als nach 5 bis 12 Stunden Reperfusion.
MATYJASZEK et al. (2009) stellten nach 18-stündiger Reperfusion am equinen
Colon hingegen eine weitere, signifikante Erhöhung der COX-2-Expression im
Vergleich zur Ischämieprobe fest. Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse mit unserer
Studie ist durch die unterschiedlichen Reperfusionszeiten nur eingeschränkt möglich.
Allerdings zeigen die Ergebnisse, dass die COX-2 am Pferdedarm ein induzierbares
Enzym ist. Diese Beobachtung wurde auch in Studien an anderen Tierarten
gemacht: Nach induzierter Kolitis bei der Ratte (REUTER et al. 1996) und beim
Schwein (CHO u. CHAE 2004) sowie bei Stimulierung von Enterozytenkulturen mit
LPS und IL-1β (LONGO et al. 1998b) kam es zu einem signifikanten Anstieg der
COX-2-Expression.
5.3.4.4 Einfluss der nichtsteroidalen Antiphlogistika auf die Expression
Wie bei der COX-1 konnte kein Unterschied in der COX-2-Expression zwischen den
Behandlungsgruppen festgestellt werden. Dieses stimmt überein mit den
Ergebnissen weiterer Ischämie-Reperfusionsstudien am Pferdedarm, die
verschiedene selektive und nicht selektive NSAIDs eingesetzt haben und ebenfalls
keinen Effekt feststellen konnten (TOMLINSON et al. 2004; COOK et al. 2009a;
MATYJASZEK et al. 2009; MARSHALL et al. 2011). Das zwischen den
Behandlungsgruppen keine Unterschiede festgestellt werden konnten, ist
möglicherweise auch auf die Untersuchungsmethoden zurückzuführen. Die
Immunhistochemie hat in der aktuellen Studie das Ziel einer genauen Lokalisation
der COX-Expression erfüllt, scheint aber nicht der richtige Ansatz zur Überprüfung
der Medikamentenwirkung auf die COX zu sein und auch für eine Aktivitätsaussage
der COX nicht die richtige Wahl zu sein. Diese Vermutung wird unterstützt von einer
Studie am equinen Jejunum, die im Western Blot keinen Unterschied, bei
Bestimmung der Prostanoidkonzentration aber deutliche Unterschiede zwischen
verschiedenen Behandlungsgruppen feststellen konnte (MARSHALL et al. 2011). Die
Prostanoidkonzentration wurden dabei in der Pufferlösung aus Ussingkammern, in
167

Diskussion
denen ungeschädigtes und ischämisch geschädigtes equines Jejunum eingespannt
wurde, bestimmt. Die Pufferlösung enthielt entweder keinen Zusatz (bei den zur
Kontrolle dienenden Proben) oder zusätzlich das selektive NSAID Robenacoxib bzw.
das nicht-selektive NSAID Flunixin-Meglumin (MARSHALL et al. 2011). Auch Studien
an Ratten (REUTER et al. 1996), an humanen glatten intestinalen Muskelzellen
(LONGO et al. 1998a) und Enterozytenkulturen (LONGO et al. 1998b) nutzten zur
Darstellung der COX-2-Expression die Immunhistochemie sowie Western Blot und
zur Überprüfung der Effektivität von COX-Hemmern die Bestimmung der
Prostanoidkonzentration. Dieses sollte in weiteren Studien beachtet und in die
Versuchsplanung mit einbezogen werden.
5.3.4.5 Expression in der Tunica muscularis
Im Gegensatz zur COX-1 wurde keine konstitutive COX-2-Expression (Ausnahme:
ein Pferd mit sehr geringer und schacher Expression in der zirkulären Muskelschicht)
in den glatten Muskelzellen des equinen Jejunums beobachtet. In der Literatur gibt
es zu einer konstitutiven COX-2-Expression kontroverse Angaben. So haben zwei
Studien am Colon der Ratte (REUTER et al. 1996) bzw. der Maus (PORCHER et al.
2004) ebenfalls keine COX-2 in den glatten Muskelzellen des gesunden Colons
festgestellt. Im Gegensatz dazu steht die Studie von ZIMMERMANN et al. (1998), die
COX-2 in den glatten Muskelzellen des Magens von gesunden Kaninchen und
Menschenen nachgewiesen hat. Auch in humanen intestinalen glatten Muskelzellen
wurde eine konstitutive COX-2-Expression festgestellt (LONGO et al. 1998a).
Denkbar wäre, dass die unterschiedlichen Ergebnisse zum einen auf die
verschiedenen untersuchten Abschnitte des Gastrointestinaltraktes und zum anderen
auf eine speziesspezifische COX-2-Expression zurückzuführen sind. Beim Pferd ist
keine weitere Studie bekannt, die die COX-2-Expression in der glatten intestinalen
Muskulatur untersucht hat. Nach Schädigung des equinen Jejunums durch Ischämie
und Reperfusion konnte eine COX-2-Expression in den glatten Muskelzellen
festgestellt werden. Auffällig war, dass dies vor allem in der Längsmuskelschicht und
dort in den Muskelzellen, die zur Tunica serosa orientiert waren, beobachtet wurde.
Auch bei der Ratte konnte nach induzierter Kolitis eine COX-2-Expression in den
glatten Muskelzellen der Längs- und Ringmuskelschicht festgestellt werden
168

Diskussion
(REUTER et al. 1996). Bei einem proinflammatorischen Stimulus mit LPS und IL-1β
konnte kein Anstieg in der Expression der COX-2-Proteine beobachtet werden
(LONGO et al. 1998a). Eine inhomogene Verteilung, wie sie in der vorliegenden
Arbeit beobachtet wurde, ist in keiner weiteren Studie beschrieben. Für Ursache und
Auswirkung der inhomogenen COX-2-Expression gilt dasselbe wie bereits für COX-1
diskutiert.
5.3.4.5.1 Expression innerhalb der Muskelzellen
In der lichtmikroskopischen Untersuchung wurde eine ausgeprägte perinukleäre,
teilweise auch nukleär erscheinende COX-2-Expression festgestellt. Das Zytoplasma
zeigte im Gegensatz zur COX-1 keine Färbung. Mit Fluoreszenz- und
Elektronenmikroskopie haben andere Studien die Lokalisation der COX-2 genauer
untersucht. In humanen und porcinen cerebralen Endothelzellen sowie in HUVEC ist
sowohl eine nukleäre als auch eine zytoplasmatische COX-2-Expression
beschrieben (PARFENOVA et al. 2001). In aktivierten 3T3-Zellen wurde in der
Kernhülle und ebenfalls im Zytoplasma eine positive COX-2-Expression festgestellt
(MORITA et al. 1995). Detailliertere Untersuchungen des Kerns ergaben eine
COX-2-Lokalisation in Kernhülle und Kernmembran sowie in der Nähe von
Kernporen mit einem gleichmäßigen Verteilungsmuster innerhalb des Kerns
(PARFENOVA et al. 2001). Noch detailliertere Untersuchungen mittels
Immunelektronenmikroskopie zeigten, dass die COX-2 zum ER lokalisiert war
(KAINULAINEN et al. 2002) bzw. dass es sich um luminale Proteine des ERs handelt
(OTTO u. SMITH 1994). Dass in der aktuellen Studie eine ausschließliche
Expression im Bereich der Kernhülle und keine positiven Reaktionen im Zytoplasma
festgestellt wurden, ist möglicherweise auf die lediglich lichtmikroskopische
Auswertung der Schnitte zurückzuführen. Darüber hinaus sind auch Unterschiede
zwischen den Spezies denkbar.
5.3.4.6 Expression in Zellen (ausgenommen Muskelzellen) der Tunica
muscularis und Tunica serosa
Die COX-2 positiven Zellen vom Typ A zeigten eine homogene, die ganze Zelle
ausfüllende Färbung und hatten eine runde Form, somit war die Morphologie
identisch mit den COX-1 positiven Zellen vom Typ A. Auch bei diesen Zellen gibt die
169

Diskussion
Morphologie Hinweise darauf, dass es sich bei den Zellen eventuell um Lymphozyten
handeln könnte. Der Zelltyp B hatte eine spindelförmige Form, teilweise mit
zytoplasmatischen Fortsätzen. Die Färbung war homogen, wobei die Fortsätze nur
eine schwache bis keine Färbung aufwiesen. Die Morphologie gibt Hinweise, dass es
sich bei den Zellen um Fibroblasten handeln könnte. Zusätzlich wurden Zellen vom
Typ C festgestellt. Diese wurden selten beobachtet, waren im Vergleich zum Typ A
größer und zeigten eine schwächere Anfärbung. In der Form waren sie rund mit
unregelmäßiger Oberfläche. Die Morphologie gibt Hinweise darauf, dass es sich um
Makrophagen handeln könnte. Die Vermutung, dass es sich beim Zelltyp A und C um
eingewanderte oder aktivierte gewebsständige Immunzellen handelt, wird von den
Ergebnissen verschiedener Studien unterstützt. So beschreiben Studien an Tunica
mucosa und Tela submucosa des equinen Colon ebenfalls COX-2 positive
Immunzellen (MATYJASZEK et al. 2009; MORTON et al. 2009; GROSCHE et al.
2011), die als eosinophile und neutrophile Granulozyten sowie Lymphozyten
(GROSCHE et al. 2011) und in einer weiteren Studie hauptsächlich als Lymphozyten
und teilweise Makrophagen angesprochen werden (MORTON et al. 2009). Auch
nach induzierter Kolitis an der Ratte wurde eine COX-2-Expression in infiltrierenden
Zellen der Tela submucosa nachgewiesen (REUTER et al. 1996). SCHMASSMANN
et al. (1998) beschreibt bei der Ratte im Bereich von Magengeschwüren COX-2
positive Monozyten und Makrophagen. Nach induzierter Kolitis beim Schwein ergab
der Vergleich mit der HE-Färbung Hinweise, dass es sich bei den meisten der COX-2
positiven Zellen um Makrophagen handelt (CHO u. CHAE 2004). In humanen
Dünndarmbiopsien wurden die COX-2 positiven Zellen in der Tunica mucosa näher
untersucht. So zeigte sich in immunoelektronischen Untersuchungen, dass die
Ultrastruktur der COX-2 positiven Zellen der von Lymphozyten ähnelte
(KAINULAINEN et al. 2002). Mit Hilfe von Doppelfärbungen gelang es zusätzlich den
Zelltyp näher zu bestimmen. Es handelte sich bei den COX-2 positiven Zellen um
CD3+ T-Zellen und CD68+ Makrophagen. Aufschlussreich ist, dass nicht alle CD3+
T-Zellen und CD68+ Makrophagen eine positive COX-2-Reaktion zeigten
(KAINULAINEN et al. 2002). Zwei weitere Studien beschreiben eine
COX-2-Expression in Fibroblasten der Magenmucosa von Kaninchen und Mensch
170

Diskussion
(ZIMMERMANN et al. 1998) sowie im Bereich von Magengeschwüren bei der Ratte
(SCHMASSMANN et al. 1998). Die Ergebnisse der Studien unterstützen die
Vermutung, dass es sich bei Zelltyp A und C um Lymphozyten sowie Makrophagen
und bei Zelltyp B um Fibroblasten handeln könnte.
5.3.4.7 Expression in den Endothelzellen
Es wurde eine konstitutive COX-2-Expression in den Endothelzellen festgestellt.
Dieser Befund stimmt mit verschiedenen Studien an anderen Tierarten und
Organsystemen überein. So ist eine konstitutive COX-2-Expression in den
Endothelzellen venöser und arterieller Gefäße in der Magenmucosa des Kaninchens
und des Menschen (ZIMMERMANN et al. 1998), im Gehirn von Schwein und
Mensch (PARFENOVA et al. 1997, 2001), in der Niere der Ratte (MATSUYAMA et
al. 2004) sowie in der Tela submucosa des equinen Colons (MORTON et al. 2009)
beschrieben. Im Gegensatz dazu beschreiben Studien am Gehirn von Schweinen
(DOMOKI et al. 1999), in der Magenmucosa von Ratten (SCHMASSMANN et al.
1998) sowie in der humanen Dünndarmmucosa (KAINULAINEN et al. 2002) keine
konstitutive COX-2-Expression in Endothelzellen. Wie es zu diesen gegensätzlichen
Ergebnissen kommt, ist fraglich. Eventuell reagieren Endothelzellen sehr empfindlich
auf „Stressoren“, so dass sie die COX-2 schon bei geringster Manipulation
exprimieren. Es ist denkbar, dass schon die Allgemeinanästhesie oder die
Gewebemanipulation bei der Probenentnahme in einigen Studien stärker war oder
länger gedauert hat und so zu einer COX-2-Expression in diesen Endothelzellen
geführt hat. Möglicherweise sind die Unterschiede auch auf die verschiedenen
Spezies und Organe zurückzuführen.
Nach Schädigung des equinen Jejunums durch Ischämie und Reperfusion konnte
keine vermehrte COX-2-Expression in den Endothelzellen festgestellt werden.
Andere Studien beschreiben bei der Ratte eine stärkere COX-2-Expression in den
Endothelzellen der Niere nach fünf Stunden Reperfusion (MATSUYAMA et al. 2004),
des Magens im Rahmen von Magengeschwüren (SCHMASSMANN et al. 1998)
sowie in der Colonwand nach induzierter Kolitis (REUTER et al. 1996). Beim
Schwein wurde eine relativ zeitnahe, selektive COX-2-Expression (nicht COX-1)
171

Diskussion
sowohl in den Endothelzellen als auch in den glatten Muskelzellen und der Adventitia
von Gehirnarterien nach Ischämie beobachtet (DOMOKI et al. 1999). Ein möglicher
Grund für die fehlende Feststellung eines COX-2-Anstiegs nach Schädigung könnte
sein, dass die gewählte deskriptive Auswertung einer Quantifikation der
COX-2-Expression in den Endothelzellen nicht gerecht wird. In Folgearbeiten könnte
deswegen die Anzahl an Blutgefäßen pro Schicht bestimmt und diese mit der Anzahl
an positiven Blutgefäßen pro Schicht in Relation gesetzt werden, um so eine
statistische Aussage treffen zu können. Eine andere Ursache könnte in den Speziesund
Organunterschieden liegen, die eine Vergleichbarkeit mit der vorliegenden Arbeit
einschränken.
5.4 Zusammenfassende Diskussion und Ausblick
Die Identifikation der Zellen, die in der Tunica muscularis und Tunica serosa des
equinen Jejunums die COX-1 und COX-2 produzieren, was beim Pferd bis jetzt nicht
beschrieben ist, konnte mit der Immunhistochemie erfolgreich durchgeführt werden.
Dadurch hat man jetzt eine Vorstellung davon, wo die COX-Isoformen im Bereich der
Tunica muscularis und Tunica serosa des equinen Jejunums exprimiert werden. Um
eine quantitative Aussage zu treffen sowie die Aktivität der Enzyme beurteilen zu
können, sollten in zukünftigen Studien andere molekularbiologische Methoden
berücksichtigt werden. Für die quantitative Bestimmung der COX-Isoformen in der
Tunica muscularis des equinen Darms ist die quantitative PCR und für die
semiquantitative Bestimmung der Western Blot besser geeignet. Diese beiden
Methoden sind an anderen Organsystemen sowie Darmschichten erfolgreich zur
Quantifizierung der COX eingesetzt worden: Western Blot (ZIMMERMANN et al.
1998; DOMOKI et al. 1999; PORCHER et al. 2004; TOMLINSON et al. 2004; LITTLE
et al. 2007b; COOK et al. 2009a; MATYJASZEK et al. 2009; MARSHALL et al.
2011), PCR (ZIMMERMANN et al. 1998; DOMOKI et al. 1999; HILTON et al. 2011).
Zur Aktivitätsbestimmung und Überprüfung des Einflusses der NSAIDs könnte eine
Quantifizierung von Prostaglandinen durchgeführt werden. Für die Tunica muscularis
des equinen Darms ist keine Studie bekannt, die dieses untersucht hat. Mehrere
Studien beschreiben dieses Vorgehen unter anderem für die Tunica mucosa des
equinen Jejunums mit einem ELISA-Kit (CAMPBELL u. BLIKSLAGER 2000;
172

Diskussion
TOMLINSON u. BLIKSLAGER 2005) bzw. für porcine und humane Endothelzellen
mit einem Radioimmunoassay (PARFENOVA et al. 2001).
Die deutliche Infiltration von neutrophilen Granulozyten nach Ischämie und
Reperfusion in die Tunica muscularis und Tunica serosa von nicht manipulierten
Jejunumabschnitten liefert Hinweise auf ein panenteritisches Geschehen. Außerdem
ist ein durch die Ischämie und Reperfusion induzierter systemischer Effekt denkbar,
der zum einen die Infiltration in dem nicht manipulierten Jejunum erklären könnte und
zum anderen auch in anderen Organen eine Entzündungsreaktion hervorgerufen
haben könnte. Dagegen scheinen die eosinophilen Granulozyten im Rahmen einer
Schädigung durch Ischämie und Reperfusion in den untersuchten Schichten Tunica
muscularis und Tunica serosa des equinen Jejunums eine untergeordnete Rolle zu
spielen. Die COX-1 wird im Stratum circulare der Tunica muscularis des equinen
Jejunums in verschieden starker Ausprägung konstitutiv exprimiert. Warum sich die
Expression vor allem auf die Ringmuskelschicht ausprägt und in der
Längsmuskelschicht nur sehr selten in schwacher Ausprägung beobachtet wurde, ist
fraglich und sollte weiter untersucht werden. Bei der COX-2 wurde in den
Muskelzellen eine wesentlich geringere Expression als bei der COX-1 festgestellt
und diese vor allem im Stratum longitudinale der Tunica muscularis. Zudem scheint
die COX-2 im equinen Jejunum ein induzierbares Enzym zu sein. Eine
Motilitätsstudie am equinen Colon beobachtete eine erhöhte Kontraktilität der
longitudinalen Muskelschicht, nicht aber der zirkulären Muskelschicht nach Gabe von
PGE 2 und PGF 2α und eine generelle Reduktion der Kontraktilität unabhängig von der
Muskelorientierung nach Gabe von selektiven und nichtselektiven NSAIDs (VAN
HOOGMOED et al. 2000). Ob dies auch für das equine Jejunum zutrifft und ob ein
Zusammenhang mit der COX-Expression festgestellt werden kann, muss in weiteren
Studien untersucht werden.
Das gewählte Modell war nicht geeignet die ursprüngliche Fragestellung, den Effekt
von selektiven und nicht selektiven NSAIDs auf die Entzündungsreaktion von durch
Ischämie und Reperfusion geschädigtem equinen Jejunum, ausreichend zu
beantworten. Daher sollte die klinische Relevanz der NSAIDs bei Schädigung des
173

Diskussion
equinen Jejunums durch Ischämie und Reperfusion in zukünftigen Studien mit einem
veränderten Versuchsaufbau beurteilt werden.
174

Zusammenfassung
6 Zusammenfassung
Stefanie Franz
Effekt selektiver und nicht selektiver nichtsteroidaler Antiphlogistika auf die
Entzündungsreaktion von durch Ischämie und Reperfusion geschädigtem
equinen Jejunum
Nach Schädigung des equinen Jejunums durch Ischämie und Reperfusion konnte bei
Behandlung der Pferde mit Flunixin-Meglumin eine Regenerationshemmung der
Darmbarriere festgestellt werden. Deswegen schlagen mehrere Studien für die
Koliktherapie des Pferdes einen Wechsel von Flunixin-Meglumin zu einem selektiven
NSAID vor. Die Wirkung von NSAIDs auf die Tunica muscularis des equinen
Jejunums wurde bisher nicht untersucht. Das Ziel unserer Studie war es daher den
Effekt von selektiven und nicht selektiven NSAIDs auf die Entzündungsreaktion der
Tunica muscularis des ischämisch geschädigten equinen Jejunum zu beurteilen.
Die Studie wurde an zwölf Warmblutpferden in Allgemeinanästhesie durchgeführt. Im
ersten Versuchsabschnitt wurde am mittleren Jejunum eine 90-minütige, partielle
Ischämie angelegt und anschließend eine 30-minütige Reperfusion eingeleitet. Die
Probenentnahme umfasste die gesamte Jejunumwand und erfolgte zu drei
Zeitpunkten: vor dem Anlegen der Ischämie, nach Ischämie sowie nach Ischämie
und Reperfusion. Daran schloss sich der zweite Versuchsabschnitt an, bei dem
dasselbe Schädigungsmodell an einem benachbarten Jejunumabschnitt durchgeführt
wurde. Der Unterschied bestand darin, dass den randomisierten Pferden nach
60 Minuten Ischämie entweder Flunixin-Meglumin (1,1 mg/kg KGW i.v.) oder
Firocoxib (0,09 mg/kg KGW i.v.) verabreicht wurde. Die Probenentnahme erfolgte in
gleicher Weise wie im ersten Versuchsabschnitt. Zusätzlich wurde nach Ende der
Reperfusion eine Probe von ungeschädigtem, benachbartem Jejunum entnommen.
Als Kontrollgruppe diente bei allen Pferden der erste Versuchsabschnitt. Mittels
Lunafärbung wurden die eosinophilen Granulozyten dargestellt. Mit Hilfe von
Immunhistochemie wurden die neutrophilen Granulozyten (Calprotectin-
175

Zusammenfassung
Immunhistochemie) sowie die COX-1 und COX-2 auf Proteinebene nachgewiesen.
Der Nachweis von COX-1 und COX-2 auf Proteinebene im Western Blot und auf
mRNA-Ebene in der RT-PCR diente als Bestätigung der Ergebnisse.
In der Auswertung konnte nach Ischämie und Reperfusion in den geschädigten
Jejunumproben eine Infiltration von neutrophilen Granulozyten in die Tunica
muscularis und Tunica serosa festgestellt werden. Auffällig war, dass auch die nicht
manipulierten Kontrollproben eine deutliche Infiltration mit neutrophilen Granulozyten
aufwiesen. Diese Befunde liefern Hinweise auf ein panenterisches
Entzündungsgeschehen, dessen Ausmaß und Stärke in zukünftigen Studien beurteilt
werden sollte. Die eosinophilen Granulozyten wurden sowohl in der Tunica
muscularis als auch der Tunica serosa nur vereinzelt beobachtet. Dies deutet auf
eine untergeordnete Rolle der eosinophilen Granulozyten im Rahmen der durch
Ischämie und Reperfusion ausgelösten Entzündungsreaktion hin. Die COX-1 wurde
im Stratum circulare der Tunica muscularis des equinen Jejunums in verschieden
starker Ausprägung konstitutiv exprimiert. Die COX-2 stellte sich als ein durch
Ischämie und Reperfusion induzierbares Enzym dar. Die Expression in der Tunica
muscularis war geringer als bei der COX-1 und wurde vor allem im Stratum
longitudinale der Tunica muscularis beobachtet. Darüber hinaus zeigten sich
Endothelzellen und Zellen, die Fibrozyten sowie Lymphozyten und Makrophagen
ähnelten, COX-1 und COX-2 positiv. Zwischen den Probandengruppen Flunixin-
Meglumin und Firocoxib konnten weder bei den neutrophilen und eosinophilen
Granulozyten noch bei den COX-1 und COX-2 produzierenden Zellen signifikante
Unterschiede festgestellt werden.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass es durch Ischämie und
Reperfusion zu einem von neutrophilen Granulozyten getragenen
Entzündungsgeschehen auch in benachbartem nicht manipuliertem Jejunum kommt,
welches durch die Gabe von NSAIDs nicht beeinflusst wird. Zudem konnte eine
unterschiedliche Expression der COX-1 und COX-2 in der Ring- und
Längsmuskelschicht der Tunica muscularis dargestellt werden, die bei der COX-1
konstitutiv und bei der COX-2 induzierbar war.
176

Summary
7 Summary
Stefanie Franz
Effects of selective and non-selective nonsteroidal anti-inflammatory drugs on
inflammation reactions in the ischemic-injured equine jejunum
After injuring the equine jejunum through ischemia and reperfusion a significant
regeneration inhibition of the intestine barrier was investigated during the equine
therapy with flunixin meglumin. That is why several studies propose for the colic
therapy a change from flunixin meglumin to a selective NSAID. The effect of NSAIDs
on the muscularis externa of the equine jejunum has not yet been investigated. The
aim of this study is to assess the effect of selective and non-selective nonsteroidal
anti-inflammatory drugs on inflammation reactions in the ischemic injured equine
jejunum.
This study was exercised on 12 crossbred horses in general anesthesia. In the first
test phase a 90 minutes long partial ischemia was applied on the middle part of the
jejunum followed by a 30 minutes reperfusion. The sampling point was carried out
three times: before the ischemia, after the ischemia, as well as after the ischemia and
the reperfusion. All samples contained the complete intestine wall. This was followed
by the second test phase in which a partial ischemia was applied again on an
uninjured jejunum part, followed by a 30 minutes reperfusion. This time the horses
received flunixin meglumin (1.1mg/kg IV) or firocoxib (0.09mg/kg IV) after
60 minutes. The sampling point was carried out in the same way as in the control
group. In addition a sample of uninjured jejunum was extracted after the reperfusion.
The first test sequence was used as a control group for all horses. The samples were
retained in formalin and Bouin’s solution and frozen in liquid nitrogen. The
eosinophils were displayed with the help of Luna’s stain. Immunohistochemistry set
the basis for detecting the neutrophils and the COX-1 and -2 on protein level. The
identification of COX-1 and COX-2 on protein level in a western blot analysis and on
mRNA level in the RT-PCR was used as a confirmation of the results.
177

Summary
In the analysis an infiltration of neutrophils was found in the muscularis externa and
serosa of the injured jejunum samples after ischemia and reperfusion. Even the nonmanipulated
control samples showed a significant infiltration with neutrophils. This
indicates a inflammatory response of the whole bowl which needs to be investigated
in a future study. The esinophils were found only rarely and isolated in the muscularis
externa and serosa. That indicates an inferior role of eosinophils for the inflammation
reaction caused by ischemia and reperfusion. The COX-1 was expressed constitutive
in several strong characteristics in the circulare muscle of the muscularis externa of
the equine jejunum. COX-2 presented itself as an inducible enzyme through ischemia
and reperfusion. The expression in the muscularis was less than COX-1 and was
found particularly in the longitudinal muscle of the muscularis externa. Moreover, the
endothelial cells and very likely fibrocytes, as well as lymphocytes and macrophages
were similar to COX-1 and COX-2 positive. There was no significant difference
between the different flunixin meglumin und firocoxib samples regarding neither
neutrophils and eosinophils nor COX-1 and COX-2 producing cells.
The study showed that ischemia and reperfusion induce neutrophile inflammation in
the muscularis externa of the jejunum, even in non-manipulated control samples on
which the NSAIDs did not have an influence. Moreover, the study revealed a different
expression of COX-1 and COX-2 in the circulare and longitudinal muscle of the
muscularis externa, which was constitutive for the COX-1 and inducible for the
COX-2.
178

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Anhang
9 Anhang
9.1 Versuch
9.1.1 Medikamente
Handelsname Wirkstoff Hersteller
Dobutamin-ratiopharm 250 Dobutamin Ratiopharm GmbH, Ulm
mg ®
Euthadorm ® Pentobarbital CP-Pharma Handelsgesellschaft
GmbH, Burgdorf
Equimax ®
Ivermectin
Praziquantel
Virbac Schweiz Ag, Glattbrugg,
Schweiz
Equest ® Moxidectin Fort Dodge Veterinär GmbH,
Würselen
Equioxx ® Firocoxib 20mg/ml Merial, Lyon, Frankreich
Flunidol ®
Flunixin-Meglumin
50mg/ml
CP-Pharma Handelsgesellschaft
mbH, Burgdorf
Tetraspan 10 % ® Hydroxyethylstärke B. Braun Melsungen AG,
Melsungen
Hibiscrub ®
Chlorhexidine-
Gluconate 4 %
Regent Medical, Manchester, UK
Isofluran CP ® Isofluran CP-Pharma Handelsgesellschaft
GmbH, Burgdorf
Narketan ® Ketamin Vétoquinol GmbH, Ravensburg
Midazolam ® Midazolam B. Braun Melsungen AG,
Melsungen
Release ®
Pentobarbital-Natrium
300mg/ml
WDT, Garbsen
Ringer-Laktat ® Ringer-Laktat B. Braun Melsungen AG,
Melsungen
Scandicain 2 % ® Mepivacainhydrochlorid AstraZeneca GmbH, Wedel
Xylazin 2 % ® Xylazin CP-Pharma Handelsgesellschaft
GmbH, Burgdorf
204

Anhang
9.1.2 Geräte
Blutanalysegerät
Sysmex KX-21, Sysmex Deutschland GmbH,
Norderstedt
Blutgasanalysegerät
Hand-Refraktometer
Inhalation- und Beatmungsgerät
Narkosemonitor
Perfusionsspritzenpumpen
ABL Flex, Radiometer GmbH, Willich, Deutschland
Euromex Microscopen B.V., Arnheim, Niederlande
modifizierter Bird Mark 7 Servo-Respirator, Eickemeyer
Medizintechnik für Tierärzte KG, Tuttlingen
Kardiokap 5, Datex-Ohmeda GmbH, Duisburg,
Deutschland
Braun
9.1.3 Verbrauchsmaterialien
Vygonüle
Scheidenband nach Bühner
Dafilon-1
Laboratories pharmaceutiques, Vygon, France
WDT, Garbsen
Dafilon-1, B. Braun Medical AG, Emmenbrücke,
Schweiz
9.2 Probenbearbeitung
9.2.1 Fixierlösung
Bouin‘sche Lösung
3 l gesättigte Pikrinsäure
1 l Formaldehydlösung 37%ig
vor Gebrauch 5 ml 100%ige Essigsäure pro 100 ml Lösung hinzufügen
Neutralgepuffertes Formalin nach Lillie
100 ml Formaldehydlösung
6,5 g NaH 2 PO 4 x H 2 O 2
4 g Na 2 HPO 4
ad 1000 ml Aqua dest
205

Anhang
9.2.2 Lösungen Hämatoxylin-Eosin-Färbung
Eosin (1%ige Lösung)
0,25 g Eosin G
ad 250 ml Aqua dest.
zum Gebrauch 3 Tropfen Eisessig hinzufügen
Hämalaun nach Delafield
Lösung A
4 g Hämatoxylin
ad 25 ml 100%igem Ethanol
Lösung B
40 g Ammoniumaluminiumsulfat
ad 400 ml Aqua dest
(gesättigte, wässrige Ammoniumalaunlösung)
Lösung A und B mischen, offen drei bis vier Tage im Licht reifen lassen und
anschließend filtrieren. Danach Zugabe von:
100 ml Glycerin
100 ml Methanol
Anschließend ein bis zwei Monate reifen lassen und vor Gebrauch erneut filtrieren.
9.2.3 Lösungen Luna-Färbung
Farblösung
Biebrich-Scharlachrot
0,8 g Biebrich-Scharlachrot
0,2 g Säurefuchsin
ad 100 ml Aqua dest.
2 ml Eisessig
Hämatoxylin-Stammlösung A
4,6 g Hämatoxylin
ad 460ml 98 % Ethanol
Hämatoxylin-Stammlösung B
5,5 g Eisen(III)chlorid, wasserfrei
ad 456 ml Aqua dest
4,6 ml konzentrierte Salzäure
206

Anhang
Gebrauchslösung
25 ml Biebrich-Scharlachrot
112,5 ml Hämatoxylinlösung A
112,5 ml Hämatoxylinlösung B
Die Gebrauchslösung muss täglich frisch angesetzt werden.
0,5%iges Lithium-Karbonat
5 g Lithium-Karbonat
ad 1000 ml Aqua dest
1 % Säurealkohol
32 ml rauchende Salzsäure (37%ig)
ad 1000 ml 100%igem Ethanol
9.2.4 Puffer und Lösungen Immunhistochemie
BSA-Lösung (1%ig)
50 ml PBS-Puffer
0,5 g BSA
BSA-Lösung (3%ig)
50 ml PBS-Puffer
1,5 g BSA
10 mM Citrat-Puffer (ph=6,0)
Stammlösung A: 0,1 M Zitronensäure
21 g C 6 H 8 O 7 x H 2 O 2 (Zitronensäure )
ad 1000 ml Aqua dest
Stammlösung B: 0,1 M Natriumcitrat
29,41 g C 6 H 5 O 7 Na 3 x H 2 O (Natriumcitrat)
ad 1000 ml Aqua dest
Gebrauchslösung
18 ml Stammlösung A
82 ml Stammlösung B
ad 1000 ml Auqa dest
ph-Wert von 6,0 einstellen
EDTA-Puffer
1,2 g mM Tris/HCl
0,372 g mM EDTA
207

Anhang
1000 ml Aqua dest
ph-Wert von 9,0 einstellen
Ethanolreihe
Ethanol (80 %)
800 ml Ethanol reinst (100 %)
200 ml Aqua dest
Ethanol (70 %)
700 ml Ethanol reinst (100 %)
300 ml Aqua dest
H 2 O 2 -Lösung
4 ml H 2 O 2 30%ig
ad 200 ml Ethanol (80 %)
1 M NaOH-Lösung
40 g NaOH-Pellets
ad 1000 ml Aqua dest
PBS-Puffer
7,8 g NaH 2 PO 4 (Natriumdihydrogenphosphat)
40 g NaCl (Natriumchlorid)
ad 5000 ml Aqua dest.
ph-Wert von 7,2 einstellen
9.2.5 Puffer und Lösungen PCR und Western Blot
Agararosegel 2%ig
0,8 g Agarose
40 ml TBE-Puffer
für ca. 140 min bei 180 Watt in die Mikrowelle (bis zum Aufkochen)
4 µl Gel Red
10 % Ammoniumperoxidsulfat
2 g Ammoniumperoxidsulfat
ad 20 ml Aqua dest
in 1 ml lichtundurchlässige Aliquots füllen
bei -20 °C aufbewahren
208

Anhang
Blotpuffer (Towbin-Puffer)
100 ml 10 % TG
200 ml Methanol
Ad 1000 ml Aqua dest
ph-Wert von 8,3 einstellen
0,3 M Guanidinhydrochlorid in 95 % Alkohol
2,87 g Guanidinhydrochlorid
in 95%igem Ethanol lösen
Lämmli-Puffer (4x)
240 mM Tris-HCl
8 % SDS
40 % Glycerol
0,04 % Bromphenolblau
5 % Betamercaptoethanol
Lower TRIS
90,86 g 1,5 m TRIS
2 g SDS
ad 500 ml Aqua dest
ph-Wert von 8,8 einstellen
5 % Magermilch in TBS-T
1,25 g Magermilchpulver
25 ml TBS-T
SDS-Laufpuffer
100 ml 10 % TG
10 ml 10 % SDS
ad 1000 ml Aqua dest
1 % SDS
0,5 g SDS
ad 50 ml Aqua dest
10 % SDS
5 g SDS
ad 50 ml Aqua dest
209

Anhang
SDS-Probenpuffer
2 g SDS
10 ml Glycerin
6,25 ml 1 m Tris, ph 6,8
600 µl Bromphenolblau (5 mg/ml)
ad 20 ml Aqua dest
in 1 ml Aliquots füllen, bei -20 °C aufbewahren
vor Gebrauch 100 µl β-Mercaptoethanol (10%ig) hinzufügen
SDS-Sammegel
5,4 ml Aqua dest.
1,34 ml ABA
1,0 ml Upper TRIS
0,08 ml APS
0,016 ml TEMED
SDS-Trenngel 10%ig
6,0 ml Aqua dest.
5,0 ml ABA
4,0 ml Lower TRIS
0,15 ml APS
0,01 ml TEMED
TBE-Puffer (10x)
108 g TRIS-Base
55 g Borsäure
7,4 g EDTA
ad 1000 ml Aqua dest.
TBE-Puffer (1x)
100 ml 10x TBE-Puffer
900 ml Aqua dest.
TBS-Puffer (10x)
60,55 g TRIS-Base
90 g NaCl
ad 1000 ml Aqua dest.
ph-Wert von 7,4 einstellen
TBS-Puffer (1x)
100 ml TBS-Puffer
900 ml Aqua dest.
210

Anhang
TBS-T-Puffer
100 ml TBS (10x)
2,5 ml Tween-20 (20%ige Lösung)
ad 1000 ml Aqua dest
TG (10x)
30,3 g Tris-Base
144 g Glycin
ad 1000 ml Aqua dest
Upper TRIS
39,4 g TRIS-HCl
2 g SDS
ad 500 ml Aqua dest
ph-Wert von 6,8 einstellen
9.2.6 Stoffe und Reagenzien
Acrylamid-Bisacrylamid
(Rotiophoroese ® Gel 30)
Agarose (Molecular Grade)
Aluminiumammoniumsulfat
Aqua dest
Ammoniumperoxidsulfat
β-Metocaptoethanol
Biebricher Scharlach
Bio-Rad DC TM Protein Assay
Reagent A
Bio-Rad DC TM Protein Assay
Reagent B
Bio-Rad DC TM Protein Assay
Reagent S
Borsäure
BSA
Chloroform stabilisiert in Ethanol
Citronensäure-Monohydrat
DAB
Depex
DNase I, RNase free (10 U/µl)
dNTP Mix (10 mM)
Carl Roth GmbH + CoKG, Karlsruhe
Bioline, Luckenwalde
AppliChem GmbH, Darmstadt
Carl Roth GmbH + CoKG, Karlsruhe
Carl Roth GmbH + CoKG, Karlsruhe
E. Merck Diagnostica, Darmstadt
Bio-Rad-Laboratories GmbH, München
Bio-Rad-Laboratories GmbH, München
Bio-Rad-Laboratories GmbH, München
Riedel-de Häen AG, Seelze Hannover
Sigma Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
E. Merck KGaA, Darmstadt
E. Merck KGaA, Darmstadt
DAKO, Hamburg
Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg
Roche, Mannheim
Applied Biosystems, Darmstadt
211

Anhang
EDTA-Dinatriumsalz Dihydrat
Eisen(III)chlorid, wasserfrei
Eisessig 100 %
Eosin G
Ethanol 99 %, vollständig vergällt
Envision Rabbit
Eukitt ®
Formalin
GelRed TM Nucleic Acid Gel Stain
(10.000X in H 2 O)
Gene Ruler 100 bp DNA Ladder
Glycin Pufferan
Glyzerin
GoTaq ® Flexi DNA Polymerase
(5 U/µl)
Green GoTaq ® Flexi Buffer 5x
Guanidine Hydrochloride
Hämatoxylin
Haematoxylin, puriss
Hydrogenperoxid, 30 %
IgG aus Kaninchenserum
IgG aus Mäuseserum
Isopropanol
Lithiumcarbonat
Magnesiumchlorid
Methanol
Milchpulver Blotting grade
Natrium-Citrat / Tri-Natriumcitrat-2-
hydrat
Natriumchlorid
Natriumdihydrogenphosphat-
Monohydrat
Natronlauge
Page Ruler TM Prestained Protein
DNA-Ladder
Paraformaldehyd
PCR Gold Buffer 10x
Proteinase K
Pikrinsäure
RNase away
RNase freies Wasser
Carl Roth GmbH + CoKG, Karlsruhe
Merck-Schuchardt, Hohenbrunn b. München
E. Merck KGaA, Darmstadt
E. Merck KGaA, Darmstadt
SAV-Liquid Production GmbH, Flintsbach
DAKO North America, Kalifornien, USA
O. Kindler GmbH, Freiburg
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Biotium, Hayward, Kalifornien, USA
Fermentas Life Science
Thermo Fisher Scientific GmbH, Dreieich
Carl Roth GmbH + CoKG, Karlsruhe
Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Promega, Mannheim
Promega, Mannheim
Merck KGaA, Darmstadt
Waldeck GmbH&Co Kg, Division Chroma, Münster
E. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
DAKO, Hamburg
DAKO, Hamburg
SAV-Liquid Production GmbH, Flintsbach
E. Merck Diagnostica, Darmstadt
Promega, Madison, USA
SAV-Liquid Production GmbH, Flintsbach
Carl Roth GmbH + CoKG, Karlsruhe
Riedel-de-Haen, RdH Laborchemikalien GmbH und Co.
KG, Seelze
Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
E. Merck KGaA, Darmstadt
E. Merck KGaA, Darmstadt
Fermentas Life Science
Thermo Fisher Scientific GmbH, Dreieich
E. Merck KGaA, Darmstadt
Applied Biosystems, Darmstadt
Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Roche Diagnostics GmbH
Roche Applied Science, Mannheim
Life Technologies, Darmstadt
212

Anhang
Salzsäure, konzentriert, 37 % Merck KGaA, Darmstadt
SDS Pellets (Natriumdodecylsulfat) Carl Roth GmbH + CoKG, Karlsruhe
Sekundärantikörper
Envision Rabbit, DAKO, Hamburg
Streptavidin Peroxidase
Super Sensitiv Label, BioGenex, San Ramon,
Kalifornien, USA
Super Signal ® West Dura Trial Kit
Säurefuchsin (Rubin S)
Temed
TRIS-hydrochlorid Pufferan ®
TRIS Pufferan ®
Trizol ® Reagent
Tween ®
Xylol
Ziegenserum
Thermo Fisher Scientific GmbH, Dreireich
E. Merck Diagnostica, Darmstadt
Carl Roth GmbH + CoKG, Karlsruhe
Carl Roth GmbH + CoKG, Karlsruhe
Carl Roth GmbH + CoKG, Karlsruhe
Life Technologies, Darmstadt
Carl Roth GmbH + CoKG, Karlsruhe
Riedel-de-Haen, RdH Laborchemikalien GmbH und Co.
KG, Seelze, Deutschland
eigene Gewinnung, 30 min bei 56 °C inaktiviert, danach
bei 21 °C eingefroren
9.2.7 Antikörper
Primärantikörper
Immunhistochemie
MAC 387 (Calprotectin)
COX-1
COX-2
Sekundärantikörper
Immunhistochemie
Envision Mouse
Envision Rabbit
Herkunft
DCS Diagnostik Systeme, Hamburg
Thermo Fisher Scientific GmbH, Dreireich
Thermo Fisher Scientific GmbH, Dreireich
DAKO, Hamburg
DAKO, Hamburg
Primärantikörpter Western Blot
COX-1
COX-2
β-Actin (C4): sc- 47778
Sekundärantikörper Western
Blot
donkey-anti-goat
goat-anti-mouse
Santa Cruz Biotechnology, Inc., Heidelberg
Santa Cruz Biotechnology, Inc., Heidelberg
Santa Cruz Biotechnology, Inc., Heidelberg
Santa Cruz Biotechnology, Inc., Heidelberg
Santa Cruz Biotechnology, Inc., Heidelberg
213

Anhang
9.2.8 Geräte
AusgießstationLeica EG 1150
Axioskop-Mikroskop
Dispergierer Ultra-Turrax TM T 10
basic
Einbettgerät TP 1050
Electrophoresis Power Supply
EV 243 (PCR)
EV 231 (WB)
Labor-ph-Meter 766 Calimatic ®
Gefrierschrank -20 °C
Gewebeinfiltrationsautomat Leica
ASP300S
Image Pro Express 6.3
Mikroskop Kamera DP-70 mit
Software DP-Soft
Kammer, PCR
Model 40-0708
0-150 V, 0-100 mA
Class II
SerienNr. 025018
Kammer, Western Blot
Model 45 - 1010
0-600 V, 0-200 mA
Class II
SerienNr. 024691
Kühlschrank
Magnetrührer RH basic 2
IKAMAG ® (S1 Labor)
Magnetrührer (Färbelabor)
Mikrowelle
Paraffin-Streckbad
PerfectBlue TM Horizontale
Migelsysteme
PerfectBlue TM Semi-Dry
Elektroblotter
PerfectBlue TM Twin
Elektrophoresesystem
Pipetten
Eppendorf Research Plus
0,1 - 2,5 µl
0,5 - 10 µl
2 - 20 µl
Leica Micorsystems GmbH, Wetzlar
Carl Zeiss Jena GmbH, Jena
IKA ® -Werke GmbH & CoKG, Staufen
Leica Microsystems GmbH, Wetzlar
peqlab Biotechnology GmbH
Knick GmbH & CoKG
Liebheer
Leica
Media Cybernetics, Bethesda, Maryland, USA
Olympus Europa GmbH, Hamburg
Peqlab Biotechnology GmbH, Erlangen
Peqlab Biotechnology GmbH, Erlangen
AEG
IKA ® -Werke GmbH & CoKG, Staufen
Heidolph
Bosch
GFL Gesellschaft für Labortechnik GmbH, Burgwedel
Peqlab Biotechnology GmbH, Erlangen
Peqlab Biotechnology GmbH, Erlangen
Peqlab Biotechnology GmbH, Erlangen
Eppendorf AG, Hamburg
214

Anhang
10 - 100 µl
20 - 200 µl
100 -1000 µl
Proteinvermessung Mithras LB 940 Berthold Technologies, Bad Wildbad
Schlittenmikrotom
Jung AG, Heidelberg
Schüttler VXR basic Vibrax ® IKA ® -Werke GmbH & CoKG, Staufen
Spektralphotometer
Smart Spec Plus Spectralphotometer, Bio-Rad
Laboratories GmbH, München
Thermo-Inkubationsmischer Thriller Peqlab Biotechnology GmbH, Erlangen
Thermocycler primus 25
Peqlab Biotechnology GmbH, Erlangen
Vision
Thermocycler peqstar
Peqlab Biotechnology GmbH, Erlangen
Vortexer Reax top
Heidolph Instruments, Schwabach
Waage (Färbelabor)
Ohaus Corporation, New Jersy, USA
Waage (IHC-Labor)
Waage (S1-Labor)
Waage Sartorius TE 412 (S-1 Sartorius
Labor)
Wärmeschrank
Heraeus
Wasserbad
Memmert GmbH & CoKG, Schwabach
Zentrifuge Perfect Spin Mini Peqlab Biotechnology GmbH, Erlangen
Zentrifuge Fresco 21
Thermo Scientific, Langenselbold
9.2.9 Verbrauchsmaterialien
Aufbewahrungsboxen für
Paraffinblöcke
Deckgläschen, 24 x 50 mm
Einbettungskapseln Jet AktivFlo TM
Feeling Kosmetiktücher
Handschuhe Nobaglove Nitril ®
puderfrei
Objektträger Histobond ®
(silanbeschichtet)
Parafilm
Pipettenspitzen
Medite Medizinprodukte, Burgdorf
Knittel Glasbearbeitungs GmbH, Braunschweig
Leica Biosystems GmbH, Illinois, USA
Netto Markendiscount, Maxdorf-Haidhof
NOBA Verbandmaterial Danz GmbH, Wetter
Marienfeld GmbH und Co. KG, Laud-Königshofen
Bemis Company, Inc., Neenah, WI, USA
Eppendorf AG, Hamburg
Brand GmbH + CoKG, Wertheim
Protran BA 85 Nitrocellulose Whatman GmbH, Dasse
Tube, RNAse frei, 1,5 ml
Eppendorf AG, Hamburg
Zentrifugenröhrchen, pyogen-, TPP, Switzerland
RNA/DANN-, RNase, DNase frei
15 ml, 50 ml
96 Well ELISA Microplates Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
215

Anhang
9.3 Tabellarische Auswertungen Calprotectin
9.3.1 Probe K1
Neutrophile Granulozyten
Probe K1 ‐ ungeschädigtes Jejunum 1
FOV = Field Of View
Pferd FOV Tunica muscularis Tunica serosa
ZM IM LM
Zellzahl Mw Zellen/mm² Zellzahl Mw Fläche (µm²) Mw Zellen/mm² Zellzahl Mw Zellen/mm² Zellzahl Mw Fläche (µm2) Mw Zellen/mm²
FOV 1 0 10 55484 10 63 221515
1 FOV 2 0 0 0 0 3,33333333 34251 48591 68,5993387 6 6 34,2857143 150 118,333333 314010 284322,333 416,1942959
FOV 3 0 0 56039 2 142 317442
FOV 1 0 1 47191 0 0 152204
2 FOV 2 0 0 0 0 0,33333333 90238 71258 4,67783734 0 0 0 0 0 147832 156973 0
FOV 3 0 0 76345 0 0 170883
FOV 1 0 0 73801 0 19 269465
3 FOV 2 1 0,33333333 0,95238095 0 0 62982 66659 0 0 0 0 16 12,6666667 251829 227958,333 55,56571011
FOV 3 0 0 63194 0 3 162581
FOV 1 0 0 49928 0 0 149907
4 FOV 2 0 0 0 0 0 56375 49348 0 0 0 0 0 0 175829 162669,333 0
FOV 3 0 0 41741 0 0 162272
FOV 1 4 0 42862 0 1 277238
5 FOV 2 0 1,33333333 3,80952381 0 0 49742 38251,6667 0 0 0 0 0 0,33333333 297297 242305,667 1,375672876
FOV 3 0 0 22151 0 0 152382
FOV 1 0 0 32449 0 0 294445
6 FOV 2 0 0 0 0 0 47049 37704,3333 0 0 0 0 0 0 116522 201007 0
FOV 3 0 0 33615 0 0 192054
FOV 1 0 0 48895 0 1 177191
7 FOV 2 0 0 0 0 0 152461 79056,6667 0 0 0 0 0 0,33333333 150508 188733,667 1,766157248
FOV 3 0 0 35814 0 0 238502
FOV 1 0 0 36682 0 0 269227
8 FOV 2 0 0 0 0 0 44067 42875,3333 0 0 0 0 0 0 217415 227023 0
FOV 3 0 0 47877 0 0 194427
FOV 1 0 0 94039 0 0 195638
9 FOV 2 0 0 0 0 0 46312 56922 0 0 0 0 0 0 227486 227308,667 0
FOV 3 0 0 30415 0 0 258802
FOV 1 0 0 90538 0 6 349768
10 FOV 2 0 0,33333333 0,95238095 0 0 60751 62362,6667 0 1 0,33333333 1,9047619 5 4,33333333 319303 321579,667 13,47514716
FOV 3 1 0 35799 0 2 295668
FOV 1 0 1 49008 0 0 156717
11 FOV 2 0 1,66666667 4,76190476 0 0,33333333 46135 46052,3333 7,23814211 0 0 0 0 0 233029 208193 0
FOV 3 5 0 43014 0 0 234833
FOV 1 1 1 41006 0 0 39363
12 FOV 2 1 2,33333333 6,66666667 1 0,66666667 46622 55457 12,0213258 1 0,33333333 1,9047619 1 1 102782 91882,3333 10,88348504
FOV 3 5 0 78743 0 2 133502
216

Anhang
9.3.2 Probe I1
Neutrophile Granulozyten
Probe I1 ‐ Jejunum nach 90‐minütiger Ischämie
Pferd FOV Tunica muscularis Tunica serosa
Ringmuskulatur intermuskuläre Schicht Längsmuskulatur
Zellzahl Mw Zellen/mm² Zellzahl Mw Fläche (µm²) Mw Zellen/mm² Zellzahl Mw Zellen/mm² Zellzahl Mw Fläche (µm²) Mw Zellen/mm²
FOV 1 1 12 76023 11 88 394551
1 FOV 2 6 3,66666667 10,4761905 8 9,33333333 37460 51746,33333 180,3670469 13 8 45,7142857 185 142,6666667 474182 418671,333 340,760533
FOV 3 4 8 41756 0 155 387281
FOV 1 1 0 42244 0 4 295491
2 FOV 2 5 2,66666667 7,61904762 1 0,33333333 43565 39027,66667 8,540949583 0 0 0 2 2,333333333 472991 317603,333 7,34669032
FOV 3 2 0 31274 0 1 184328
FOV 1
3 FOV 2 Probe fehlt
FOV 3
FOV 1 0 0 51376 0 3 137251
4 FOV 2 0 0 0 0 0 59193 53428,33333 0 0 0 0 1 1,666666667 131234 103469,667 16,1077804
FOV 3 0 0 49716 0 1 41924
FOV 1 0 0 52083 0 0 216484
5 FOV 2 0 0 0 0 0 53381 41201,66667 0 0 0 0 0 0 281382 245243 0
FOV 3 0 0 18141 0 0 237863
FOV 1 3 0 46318 2 25 218075
6 FOV 2 3 3,33333333 9,52380952 7 3 50129 41274,33333 72,68439628 0 1 5,71428571 24 23 273674 232217,333 99,0451474
FOV 3 4 2 27376 1 20 204903
FOV 1 0 0 45998 0 5 218753
7 FOV 2 2 0,66666667 1,9047619 0 0 28907 33697,33333 0 0 0 0 0 2 174089 191640 10,4362346
FOV 3 0 0 26187 0 1 182078
FOV 1 0 0 30044 0 41 283078
8 FOV 2 0 0 0 0 0 45853 45920,66667 0 0 0 0 30 29,66666667 314054 309145,667 95,9633916
FOV 3 0 0 61865 0 18 330305
FOV 1 0 0 80308 2 5 267983
9 FOV 2 3 1,33333333 3,80952381 0 0,66666667 55127 57446,66667 11,60496693 3 1,66666667 9,52380952 10 6 254855 245634 24,4265859
FOV 3 1 2 36905 0 3 214064
FOV 1 0 4 108076 5 20 345974
10 FOV 2 0 0,66666667 1,9047619 2 7 47156 90824,66667 77,0715738 7 6,33333333 36,1904762 112 70,66666667 582409 409565 172,540785
FOV 3 2 15 117242 7 80 300312
FOV 1 0 0 35510 0 1 211342
11 FOV 2 0 0 0 0 0,33333333 43253 42537,66667 7,836192237 0 0 0 0 1 259404 206489 4,84287299
FOV 3 0 1 48850 0 2 148721
FOV 1 4 0 42864 3 4 322074
12 FOV 2 3 3,66666667 10,4761905 1 0,33333333 35083 41635 8,006084624 0 1 5,71428571 4 3 205890 288492,667 10,3988778
FOV 3 4 0 46958 0 1 337514
217

Anhang
9.3.3 Probe R1
Neutrophile Granulozyten
Probe R1 ‐ Jejunum nach 90‐minütiger Ischämie und 30‐minütiger Reperfusion
Pferd FOV Tunica muscularis Tunica serosa
Ringmuskulatur intermuskuläre Schicht Längmuskulatur
Zellzahl Mw Zellen/mm² Zellzahl Mw Fläche (µm²) Mw Zellen/mm² Zellzahl Mw Zellen/mm² Zellzahl Mw Fläche (µm²) Mw Zellen/mm²
FOV 1 3 2 49944 9 147 315.616
1 FOV 2 5 3,33333333 9,52380952 4 2,66666667 22303 34313,33333 77,71517389 10 11,6666667 66,6666667 269 235,6666667 509269 435854,667 540,700111
FOV 3 2 2 30693 16 291 482679
FOV 1 0 0 31637 0 54 108358
2 FOV 2 0 0,33333333 0,95238095 1 0,66666667 47986 41927,33333 15,90052631 1 0,33333333 1,9047619 196 131,3333333 496583 380261,333 345,376513
FOV 3 1 1 46159 0 144 535843
FOV 1 6 2 74161 2 197 394577
3 FOV 2 3 3,33333333 9,52380952 10 5 97197 79446 62,93583063 2 2,33333333 13,3333333 149 204 319030 404079 504,851774
FOV 3 1 3 66980 3 266 498630
FOV 1 0 0 52189 0 41 211563
4 FOV 2 0 0 0 3 1,66666667 34469 28901,02667 57,66807823 0 0 0 81 60,33333333 319233 299938 201,152683
FOV 3 0 2 45,08 0 59 369018
FOV 1 0 0 32458 0 12 153520
5 FOV 2 0 0 0 0 1 39886 33910,33333 29,48953613 13 8,66666667 49,5238095 4 23,33333333 166639 178878,667 130,442236
FOV 3 0 3 29387 13 54 216477
FOV 1 9 7 43027 1 127 855579
6 FOV 2 10 10,3333333 29,5238095 7 5 36551 44291,33333 112,8889023 0 1,66666667 9,52380952 114 131,3333333 755214 785487 167,199882
FOV 3 12 1 53296 4 153 745668
FOV 1 5 4 145236 2 6 492348
7 FOV 2 1 2,66666667 7,61904762 1 3 36622 71771 41,79961266 0 1,66666667 9,52380952 4 7 424900 471906,333 14,8334521
FOV 3 2 4 33455 3 11 498471
FOV 1 5 0 65304 3 58 372794
8 FOV 2 3 3,66666667 10,4761905 0 0,33333333 45287 56017 5,950574528 0 1 5,71428571 24 39,66666667 199873 252331,667 157,20051
FOV 3 3 1 57460 0 37 184328
FOV 1 2 2 46115 2 148 475921
9 FOV 2 4 5,33333333 15,2380952 1 2,33333333 53659 48756 47,85735773 2 2 11,4285714 178 177,3333333 522644 458669,667 386,625378
FOV 3 10 4 46494 2 206 377444
FOV 1 0 0 21264 4 41 189330
10 FOV 2 0 1,66666667 4,76190476 4 3 42369 29204 102,725654 30 11,3333333 64,7619048 38 39,33333333 199203 183960,667 213,813823
FOV 3 5 5 23979 0 39 163349
FOV 1 1 3 51567 1 88 190036
11 FOV 2 2 1,66666667 4,76190476 5 3,66666667 44659 47925 76,50843332 1 1 5,71428571 34 48,66666667 225600 208969,333 232,889036
FOV 3 2 3 47549 1 24 211272
FOV 1 2 0 64703 0 77 290921
12 FOV 2 2 1,66666667 4,76190476 3 1 79773 73522 13,60137102 9 4,66666667 26,6666667 210 271 364333 366784 738,854476
FOV 3 1 0 76090 5 526 445098
218

Anhang
9.3.4 Probe K2
Neutrophile Granulozyten
Probe K2 ‐ ungeschädigtes Jejunum 2
Pferd FOV Tunica muscularis Tunica serosa
Ringmuskulatur intermuskuläre Schicht Längsmuskulatur
Zellzahl Mw Zellen/mm² Zellzahl Mw Fläche (µm²) Mw Zellen/mm² Zellzahl Mw Zellen/mm² Zellzahl Mw Fläche (µm²) Mw Zellen/mm²
FOV 1 2 1 33843 20 42 237536
1 FOV 2 0 0,66666667 1,9047619 4 1,66666667 39701 31745,33333 52,50115503 9 13,3333333 76,1904762 23 28 186490 195423,667 143,27845
FOV 3 0 0 21692 11 19 162245
FOV 1 0 0 35072 0 197 296489
2 FOV 2 1 0,33333333 0,95238095 1 0,33333333 40609 47266 7,052285646 0 0 0 56 133,6666667 292104 281967 474,050746
FOV 3 0 0 66117 0 148 257308
FOV 1 0 1 48514 3 144 282549
3 FOV 2 1 0,66666667 1,9047619 8 5,66666667 54955 67635,66667 83,78222535 5 10,6666667 60,952381 178 153 319030 332925,333 459,562505
FOV 3 1 8 99438 24 137 397197
FOV 1 0 2 49211 1 91 352829
4 FOV 2 0 0 0 1 1 42065 46932,66667 21,30712084 0 0,33333333 1,9047619 196 135,6666667 350385 334304,667 405,817448
FOV 3 0 0 49522 0 120 299700
FOV 1 0 1 32660 0 78 358511
5 FOV 2 1 0,33333333 0,95238095 1 1 61245 43747 22,85871031 0 1,66666667 9,52380952 17 50,33333333 288010 326220,333 154,292447
FOV 3 0 1 37336 5 56 332140
FOV 1 2 4 45647 5 133 526553
6 FOV 2 0 0,66666667 1,9047619 1 4,33333333 33401 73244 59,16298036 8 4,66666667 26,6666667 174 179,3333333 619048 560143 320,156341
FOV 3 0 8 140684 1 231 534828
FOV 1 4 9 64024 47 222 276426
7 FOV 2 5 4,66666667 13,3333333 28 16,6666667 63195 56095,66667 297,1114822 32 31 177,142857 141 149,3333333 231290 248935 599,88886
FOV 3 5 13 41068 14 85 239089
FOV 1 0 0 49451 1 150 347642
8 FOV 2 1 0,66666667 1,9047619 1 0,66666667 26277 46422,33333 14,36090388 0 1 5,71428571 121 125,3333333 263439 290933,333 430,797434
FOV 3 1 1 63539 2 105 261719
FOV 1 4 15 103099 15 207 296674
9 FOV 2 3 9 25,7142857 9 11,3333333 37425 66483 170,4696439 1 6 34,2857143 298 224 346883 300173,667 746,23468
FOV 3 20 10 58925 2 167 256964
FOV 1 11 22 57390 62 140 142368
10 FOV 2 0 4 11,4285714 4 10 42180 41727 239,6529825 10 31,6666667 180,952381 120 131,3333333 142377 154975,667 847,444868
FOV 3 1 4 25611 23 134 180182
FOV 1 0 0 43165 0 176 374223
11 FOV 2 0 0 0 0 0 36232 36954,66667 0 3 1 5,71428571 28 104,6666667 149109 274511,667 381,283127
FOV 3 0 0 31467 0 110 300203
FOV 1 0 0 38239 9 169 283819
12 FOV 2 1 0,33333333 0,95238095 1 0,33333333 35704 35870,66667 9,292643943 2 4,33333333 24,7619048 115 110 250620 230208 477,828746
FOV 3 0 0 33669 2 46 156185
219

Anhang
9.3.5 Probe I2
Neutrophile Granulozyten
Flunixin‐Meglumin
Probe I2 ‐ Jejunum nach 90‐minütiger Ischämie + NSAID Firocoxib
Pferd FOV Tunica muscularis Tunica serosa
Ringmuskulatur intermuskuläre Schicht Längsmuskulatur
Zellzahl Mw Zellen/mm² Zellzahl Mw Fläche (µm2) Mw Zellen/mm² Zellzahl Mw Zellen/mm² Zellzahl Mw Fläche (µm2) Mw Zellen/mm²
FOV 1 0 8 47518 8 242 459.511
1 FOV 2 1 1 2,85714286 11 9 40424 40753,66667 220,8390247 19 12 68,5714286 163 216,3333333 389892 454320,333 476,169164
FOV 3 2 8 34319 9 244 513558
FOV 1 1 1 66618 0 76 335872
2 FOV 2 0 0,33333333 0,95238095 2 1,33333333 37072 44688,33333 29,83627345 2 0,66666667 3,80952381 73 81 315660 306534,333 264,244462
FOV 3 0 1 30375 0 94 268071
FOV 1 0 8 86645 2 152 416501
3 FOV 2 0 0 0 0 3,33333333 51871 66693 49,9802578 0 0,66666667 3,80952381 302 223,6666667 812719 607752 368,022922
FOV 3 0 2 61563 0 217 594036
FOV 1 0 7 44456 1 164 183393
4 FOV 2 0 0 0 1 5,33333333 20124 40274,33333 132,4251177 5 4 22,8571429 141 165 361254 286901,333 575,110607
FOV 3 0 8 56243 6 190 316057
FOV 1 0 0 40946 0 98 430546
5 FOV 2 0 0 0 11 8,66666667 25664 41901 206,8367501 4 1,33333333 7,61904762 121 137,6666667 582399 476511,333 288,905336
FOV 3 0 15 59093 0 194 416589
FOV 1 16 6 39957 12 180 581226
6 FOV 2 18 11,6666667 33,3333333 6 5,33333333 22268 35822 148,8842983 27 28,6666667 163,809524 99 139 515587 532452,333 261,056232
FOV 3 1 4 45241 47 138 500544
FOV 1 10 14 106938 17 84 798215
7 FOV 2 8 11 31,4285714 8 16 46309 74926,66667 213,5421301 8 10 57,1428571 78 81,33333333 821621 831337,667 97,8342936
FOV 3 15 26 71533 5 82 874177
FOV 1 0 0 36772 1 287 527312
8 FOV 2 0 0,33333333 0,95238095 4 1,66666667 137304 61544,33333 27,08074938 0 0,33333333 1,9047619 223 246 510575 703041 349,908469
FOV 3 1 1 10557 0 228 1071236
FOV 1 34 14 84590 25 124 563625
9 FOV 2 3 15 42,8571429 0 10,3333333 48938 57107,66667 180,9447652 7 13 74,2857143 221 140 613517 531990,667 263,162512
FOV 3 8 17 37795 7 75 418830
FOV 1 2 0 70759 1 133 445386
10 FOV 2 0 1 2,85714286 0 1,33333333 104499 82637 16,13482258 1 1,66666667 9,52380952 35 57 345639 343483,333 165,946916
FOV 3 1 4 72653 3 3 239425
FOV 1 2 3 103964 2 210 532287
11 FOV 2 0 1,33333333 3,80952381 0 1,33333333 36268 62777,33333 21,23908842 5 2,33333333 13,3333333 79 119 226702 333542,667 356,775945
FOV 3 2 1 48100 0 68 241639
FOV 1 4 0 32272 0 126 241630
12 FOV 2 1 1,66666667 4,76190476 0 0 40097 51735,33333 0 0 0 0 188 160,3333333 295280 269968,333 593,896815
FOV 3 0 0 82837 0 167 272995
220

Anhang
9.3.6 Probe R2
Neutrophile Granulozyten
Flunixin‐Meglumin
Probe R2 ‐ Jejunum nach 90‐minütiger Ischämie und 30‐minütiger Reperfusion + NSAID Firocoxib
Pferd FOV Tunica muscularis Tunica serosa
Ringmuskulatur intermuskuläre Schicht Längsmuskulatur
Zellzahl Mw Zellen/mm² Zellzahl Mw Fläche (µm2) Mw Zellen/mm² Zellzahl Mw Zellen/mm² Zellzahl Mw Fläche (µm2) Mw Zellen/mm²
FOV 1 31 28 54637 28 145 335.554
1 FOV 2 19 21 60 2 11,3333333 71321 53969,66667 209,9945031 54 29 165,714286 30 73,66666667 143056 214953,667 342,709514
FOV 3 13 4 35951 5 46 166251
FOV 1 1 3 40963 0 142 371021
2 FOV 2 4 1,66666667 4,76190476 1 1,66666667 34531 35775,33333 46,5870339 1 0,33333333 1,9047619 158 146 473759 445374,333 327,814131
FOV 3 0 1 31832 0 138 491343
FOV 1 0 2 62101 0 217 459749
3 FOV 2 1 0,33333333 0,95238095 2 2,66666667 59278 61548,33333 43,32638306 0 0 0 184 232,3333333 469409 471079,667 493,193296
FOV 3 0 4 63266 0 296 484081
FOV 1 0 6 43371 0 170 387431
4 FOV 2 1 1 2,85714286 4 4,66666667 96676 71673,33333 65,1102223 0 0 0 131 129 266342 315725,667 408,582556
FOV 3 2 4 74973 0 86 293404
FOV 1 25 24 39357 24 76 621845
5 FOV 2 0 17,6666667 50,4761905 2 11 36287 40339,33333 272,6867078 7 23,6666667 135,238095 57 86,33333333 490778 518568,667 166,483899
FOV 3 28 7 45374 40 126 443083
FOV 1 19 26 41359 41 130 320565
6 FOV 2 21 23,6666667 67,6190476 22 28 50791 54005 518,470512 30 28,3333333 161,904762 489 272 461752 445159,333 611,017179
FOV 3 31 36 69865 14 197 553161
FOV 1 12 32 113819 10 85 700330
7 FOV 2 9 10 28,5714286 18 18,3333333 88198 95329,66667 192,315089 9 8,33333333 47,6190476 47 44 518163 609246,5 72,2203574
FOV 3 9 5 83972 6 0
FOV 1 0 8 49370 60 144 363919
8 FOV 2 5 1,66666667 4,76190476 0 2,66666667 31511 40759 65,42522306 0 25 142,857143 81 130,6666667 237510 295865 441,642866
FOV 3 0 0 41396 15 167 286166
FOV 1 12 33 41192 18 97 665225
9 FOV 2 10 8,33333333 23,8095238 8 13,6666667 39816 40863,33333 334,4481605 5 9,66666667 55,2380952 22 183,6666667 834520 844742,333 217,423301
FOV 3 3 0 41582 6 432 1034482
FOV 1 12 9 125306 6 171 755268
10 FOV 2 3 9 25,7142857 2 5,33333333 38193 68383,33333 77,99171338 4 7 40 58 119 711764 740431,333 160,717132
FOV 3 12 5 41651 11 128 754262
FOV 1 7 8 79746 1 93 625568
11 FOV 2 5 9,33333333 26,6666667 6 8,66666667 59922 56994,66667 152,0610116 1 1 5,71428571 83 103,6666667 971304 709064 146,202129
FOV 3 16 12 31316 1 135 530320
FOV 1 9 9 54161 3 157 216381
12 FOV 2 20 11 31,4285714 22 17 28593 40544,66667 419,2906589 31 17,6666667 100,952381 174 168,6666667 283882 246398 684,529366
FOV 3 4 20 38880 19 175 238931
221

Anhang
9.3.7 Probe K3
Neutrophile Granulozyten
Flunixin‐Meglumin
Probe K3 ‐ ungeschädigtes Jejunum + NSAID Firocoxib
Pferd FOV Tunica muscularis Tunica serosa
Ringmuskulatur intermuskuläre Schicht Längsmuskulatur
Zellzahl Mw Zellen/mm² Zellzahl Mw Fläche (µm²) Mw Zellen/mm² Zellzahl Mw Zellen/mm² Zellzahl Mw Fläche (µm²) Mw Zellen/mm²
FOV 1 16 9 36198 49 122 290.207
1 FOV 2 17 19 54,2857143 28 17,6666667 28505 30866,33333 572,3603927 55 49 280 100 104,6666667 279170 275561,667 379,830286
FOV 3 24 16 27896 43 92 257308
FOV 1 0 0 65967 0 131 252738
2 FOV 2 0 0 0 10 4,33333333 10163 56949,33333 76,09102828 1 0,33333333 1,9047619 120 121,6666667 236195 250720,333 485,268447
FOV 3 0 3 94718 0 114 263228
FOV 1 0 0 68139 1 102 291018
3 FOV 2 0 0 0 1 0,66666667 50102 65778 10,13510089 0 0,33333333 1,9047619 143 152,3333333 335166 343979,667 442,855634
FOV 3 0 1 79093 0 212 405755
FOV 1 2 0 35222 0 165 315739
4 FOV 2 1 2,66666667 7,61904762 5 9,33333333 39886 51659,33333 180,6708049 7 4,33333333 24,7619048 185 154,6666667 203976 225808,667 684,945662
FOV 3 5 23 79870 6 114 157711
FOV 1 0 3 33710 16 52 190486
5 FOV 2 0 0,33333333 0,95238095 12 7 54761 43435,66667 161,157881 11 17 97,1428571 128 104,3333333 322541 265768,333 392,572479
FOV 3 1 6 41836 24 133 284278
FOV 1 28 23 33781 41 434 433458
6 FOV 2 48 43 122,857143 21 23,6666667 35325 40603,66667 582,8701841 46 45,3333333 259,047619 342 357,3333333 365913 366686,333 974,493186
FOV 3 53 27 52705 49 296 300688
FOV 1 6 0 69980 27 136 390854
7 FOV 2 0 7 20 46 27 13807 71059 379,9659438 11 18,6666667 106,666667 222 178,6666667 423647 365524,333 488,795548
FOV 3 15 35 129390 18 178 282072
FOV 1 0 1 56984 4 240 416810
8 FOV 2 8 3,66666667 10,4761905 0 6,66666667 28788 82907,33333 80,41106135 9 4,66666667 26,6666667 186 195,3333333 354179 379996,667 514,039597
FOV 3 3 19 162950 1 160 369001
FOV 1 5 0 38284 1 108 380171
9 FOV 2 1 2 5,71428571 2 0,66666667 32051 34249,66667 19,46490963 3 3,66666667 20,952381 346 176,6666667 342347 330982,333 533,764642
FOV 3 0 0 32414 7 76 270429
FOV 1 1 24 70800 40 172 336004
10 FOV 2 17 8,66666667 24,7619048 19 28 47403 58566,33333 478,0903705 34 30,6666667 175,238095 114 151,6666667 369256 385663,333 393,261826
FOV 3 8 41 57496 18 169 451730
FOV 1 7 5 33922 1 255 306061
11 FOV 2 0 3 8,57142857 0 3,66666667 41494 38475,33333 95,2991527 2 2,33333333 13,3333333 102 141 167751 197871 712,585472
FOV 3 2 6 40010 4 66 119801
FOV 1 10 0 31299 15 28 174950
12 FOV 2 9 7,66666667 21,9047619 6 7,66666667 28161 28210 271,7712395 7 11,3333333 64,7619048 60 32,33333333 198991 142359,667 227,124256
FOV 3 4 17 25170 12 9 53138
222

Anhang
9.4 Tabellarische Auswertung Luna
9.4.1 Probe K1
Eosinopile Granulozyten
Probe K1 ‐ ungeschädigtes Jejunum 1
FOV = Field Of View
Pferd FOV Tunica muscularis Tunica serosa
Ringmuskulatur intermuskuläre Schicht Längsmuskulatur
Zellzahl Mw Zellzahl/mm² Zellzahl Mw Zellzahl Mw Zellzahl/mm² Zellzahl Mw Fläche (µm²) Mw Zellzahl/mm²
FOV 1 0 0 0 0
1 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0
2 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0
3 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0
4 FOV 2 0 0,33333333 0,952380952 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 1 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0 193945
5 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,333333333 191095 201138 1,657236988
FOV 3 0 0 0 1 218374
FOV 1 0 0 0 0
6 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0
7 FOV 2 0 0,33333333 0,952380952 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 1 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0
8 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0
9 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 / / / /
FOV 1 0 0 0 0
10 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0
11 FOV 2 2 1,33333333 3,80952381 0 0 3 1 5,714285714 0 0 0
FOV 3 2 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0
12 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
223

Anhang
9.4.2 Probe I1
Eosinopile Granulozyten
Probe I1 ‐ Jejunum nach 90‐minütiger Ischämie
Pferd FOV Tunica muscularis Tunica serosa
Ringmuskulatur intermuskuläre Schicht Längsmuskulatur
Zellzahl Mw Zellzahl/mm² Zellzahl Mw Zellzahl Mw Zellzahl/mm² Zellzahl Mw Fläche (µm²) Mw Zellzahl/mm²
FOV 1 0 0 0 1 135548
1 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 129805 173011,667 5,779957036
FOV 3 0 0 0 1 253682
FOV 1 0 0 0 1 291680
2 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,333333333 234679 248329,667 1,342301698
FOV 3 0 0 0 0 218630
FOV 1
3 FOV 2 0
FOV 3
FOV 1 0 0 0 0 0
4 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0 0
5 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0 0
FOV 1 2 0 0 0 458541
6 FOV 2 1 1 2,857142857 0 0 0 0 0 1 0,333333333 383161 452894 0,736007395
FOV 3 0 0 0 0 516980
FOV 1 1 0 1 0 336949
7 FOV 2 0 0,33333333 0,952380952 0 0 1 0,66666667 3,80952381 1 0,333333333 245159 231214 1,441665874
FOV 3 0 0 0 0 111534
FOV 1 0 0 0 0 0
8 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0 0
9 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0 0
10 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0 0
FOV 1 1 0 0 0 0
11 FOV 2 1 0,66666667 1,904761905 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0 0
FOV 1 0 0 1 0 0
12 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0,33333333 1,904761905 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0 0
224

Anhang
9.4.3 Probe R1
Eosinopile Granulozyten
Probe R1 ‐ Jejunum nach 90‐minütiger Ischämie und 30‐minütiger Reperfusion
Pferd FOV Tunica muscularis Tunica serosa
Ringmuskulatur intermuskuläre Schicht Längsmuskulatur
Zellzahl Mw Zellzahl/mm² Zellzahl Mw Fläche (µm²) Mw Zellzahl/mm² Zellzahl Mw Zellzahl/mm² Zellzahl Mw Fläche (µm²) Mw Zellzahl/mm²
FOV 1 0 0 0 0
1 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0 314266
2 FOV 2 1 0,66666667 1,904761905 0 0 0 0 0 0 2 0,666666667 416201 337351,6667 1,976177184
FOV 3 1 0 0 0 281588
FOV 1 0 0 0 1 344121
3 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1,333333333 421053 400432 3,329737217
FOV 3 0 0 0 2 436122
FOV 1 0 0 0 0
4 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0
5 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0 504965
6 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,333333333 448448 477168 0,698565984
FOV 3 0 0 0 1 478091
FOV 1 0 1 34558 0 0
7 FOV 2 0 0 0 0 0,33333333 29767 32637,3333 10,21325272 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 33587 0 0
FOV 1 0 0 0 0
8 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 1 0 1 0
9 FOV 2 0 0,33333333 0,952380952 0 0 0 0 0,33333333 1,904761905 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0
10 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0
11 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0,33333333 1,904761905 0 0 0
FOV 3 0 0 1 0
FOV 1 0 0 0 0
12 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 / / / /
225

Anhang
9.4.4 Probe K2
Eosinopile Granulozyten
Probe K2 ‐ ungeschädigtes Jejunum 2
Pferd FOV Tunica muscularis Tunica serosa
Ringmuskulatur intermuskuläre Schicht Längsmuskulatur
Zellzahl Mw Zellzahl/mm² Zellzahl Mw Zellzahl Mw Zellzahl/mm² Zellzahl Mw Fläche (µm²) Mw Zellzahl/mm²
FOV 1 0 0 0 0 309284
1 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,333333333 288672 315434,3333 1,056743982
FOV 3 0 0 0 1 348347
FOV 1 0 0 0 0
2 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0 352785
3 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0,666666667 302699 298694 2,231938595
FOV 3 0 0 0 0 240598
FOV 1 0 0 0 0
4 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0
5 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0
6 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 / / / /
FOV 1 0 0 0 1 186384
7 FOV 2 0 0,33333333 0,952380952 0 0 0 0 0 2 1 184469 231934,3333 4,311565199
FOV 3 1 0 0 0 324950
FOV 1 0 0 0 0
8 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0,33333333 1,904761905 0 0 0
FOV 3 0 0 1 0
FOV 1 0 0 0 0
9 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0
10 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 1 269642
11 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,333333333 287675 290292,3333 1,148267781
FOV 3 0 0 0 0 313560
FOV 1 0 0 0 0
12 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
226

Anhang
9.4.5 Probe I2
Eosinopile Granulozyten
Flunixin‐Meglumin
Probe I2 ‐ Jejunum nach 90‐minütiger Ischämie + NSAID Firocoxib
Pferd FOV Tunica muscularis Tunica serosa
Ringmuskulatur intermuskuläre Schicht Längsmuskulatur
Zellzahl Mw Zellzahl/mm² Zellzahl Mw Zellzahl Mw Zellzahl/mm² Zellzahl Mw Fläche (µm²) Mw Zellzahl/mm²
FOV 1 0 0 0 0
1 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0
2 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0 225882
3 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 3 1,333333333 375706 337254,3333 3,953495038
FOV 3 0 0 0 1 410175
FOV 1 0 0 0 0
4 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 / / / /
FOV 1 0 0 0 0
5 FOV 2 0 0,33333333 0,952380952 0 0 0 0,33333333 1,904761905 0 0 0
FOV 3 1 0 1 0
FOV 1 0 0 0 0
6 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0 441249
7 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0,666666667 389980 456108,3333 1,461641057
FOV 3 0 0 0 1 537096
FOV 1 0 0 0 1 349318
8 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 253426 301372 3,318158289
FOV 3 / / / / /
FOV 1 0 0 0 0 757562
9 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,333333333 579206 550418 0,60560035
FOV 3 0 0 0 1 314486
FOV 1 0 0 0 0
10 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0
11 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0
12 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
227

Anhang
9.4.6 Probe R2
Eosinopile Granulozyten
Flunixin‐Meglumin
Probe R2 ‐ Jejunum nach 90‐minütiger Ischämie und 30‐minütiger Repferfusion + NSAID Firocoxib
Pferd FOV Tunica muscularis Tunica serosa
Ringmuskulatur intermuskuläre Schicht Längsmuskulatur
Zellzahl Mw Zellzahl/mm² Zellzahl Mw Zellzahl Mw Zellzahl/mm² Zellzahl Mw Fläche (µm²) Mw Zellzahl/mm²
FOV 1 0 0 1 1 408896
1 FOV 2 0 0 0 0 0 0 1 5,714285714 0 0,333333333 394048 389125 0,856622765
FOV 3 0 0 2 0 364431
FOV 1 0 0 0 0
2 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 2 752912
3 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,666666667 702376 744568,6667 0,895372981
FOV 3 0 0 0 0 778418
FOV 1 0 0 0 0
4 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 1 698503
5 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,5 725518 712010,5 0,702236835
FOV 3 / / / / /
FOV 1 0 0 0 0
6 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 2 1 516663
7 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0,66666667 3,80952381 0 0,333333333 430582 493342,3333 0,675663349
FOV 3 0 0 0 0 532782
FOV 1 0 0 0 0
8 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0
9 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0
10 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0
11 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0
12 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
228

Anhang
9.4.7 Probe K3
Eosinopile Granulozyten
Flunixin‐Meglumin
Probe K3 ‐ ungeschädigtes Jejunum + NSAID Firocoxib
Pferd FOV Tunica muscularis Tunica serosa
Ringmuskulatur intermuskuläre Schicht Längsmuskulatur
Zellzahl Mw Zellzahl/mm² Zellzahl Mw Fläche (µm²) Mw Zellzahl/mm² Zellzahl Mw Zellzahl/mm² Zellzahl Mw Fläche (µm²) Mw Zellzahl/mm²
FOV 1 0 0 0 0 561569
1 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,333333333 308937 415239,3333 0,8027499
FOV 3 0 0 0 1 375212
FOV 1 0 0 0 0
2 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0
3 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0
4 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0
5 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0
6 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
FOV 1 0 0 0 0 379420
7 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0,333333333 307808 336193 0,991493973
FOV 3 0 0 0 0 321351
FOV 1 0 0 69213 0 0 376818
8 FOV 2 1 0,33333333 0,952380952 1 0,33333333 92619 71674,33333 4,650665278 0 0 0 1 0,333333333 354320 369207 0,902835898
FOV 3 0 0 53191 0 0 376483
FOV 1 0 0 0 0 422739
9 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,333333333 288646 325635,3333 1,023639941
FOV 3 0 0 0 1 265521
FOV 1 0 0 0 0 108869
10 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0,666666667 115142 110622 6,02652878
FOV 3 0 0 0 0 107855
FOV 1 0 0 0 2 328770
11 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,666666667 321351 314431 2,120231996
FOV 3 0 0 0 0 293172
FOV 1 0 0 0 0
12 FOV 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FOV 3 0 0 0 0
229

Danksagung
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich den Menschen Danken ohne die diese Arbeit nicht zu
Stande gekommen wäre.
Mein erster Dank gilt Herrn Prof. Dr. Karsten Feige und Frau Dr. Anna Rötting, für die
Überlassung des interessanten Dissertationsthemas und für die gute
wissenschaftliche Betreuung.
Ein herzliches Dankeschön geht an die Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Ralph Brehm des
Anatomischen Institutes. Vielen Dank Prof. Dr. Brehm, dass Sie immer ein offenes
Ohr hatten und immer Zeit gefunden haben um konstruktive Lösungen für jegliche
Fragestellung der Doktorarbeit zu finden! Vielen Dank auch für die sehr genaue und
zügige Korrektur dieser Arbeit! Ein weiteres großes Dankeschön geht an Marion
Gähle für die Einweihung in die Rätsel der Immunhistochemie, für die Herstellung der
wunderbaren Schnitte und für die vielen netten Gespräche sowie schönen Stunden
im Labor! Auch Doris Walter möchte ich sehr dafür danken, dass sie einfach
nebenbei so viele kleine Dinge für mich erledigt hat! Ein großer Dank geht an Nadine
Schnepel, die mich mit einer Engelsgeduld in die Molekularbiologie eingearbeitet
sowie im Weiteren unterstützt hat bei jeder Frage und zu jeder Zeit eine Antwort
wusste! Auch Jonny Gerber gebührt ein großer Dank für die Unterstützung und die
immer nette Hilfe bei jeglichen Fragen und Problemen bei der Durchführung der
molekularbiologischen Methoden! Meinen Mitdoktoranden in der Anatomie Hanna,
Joanna, Jonny und Krissi möchte ich für die herzliche Aufnahme, die tolle Zeit und
die vielen lustigen Momente danken! Zusammenfassend kann ich sagen: Vielen
Dank an die ganze Arbeitsgruppe, für die immer konstruktive Hilfe, die großartige
Unterstützung und die vielen netten Stunden bei euch!
Dr. Klaus Hopster möchte ich danken für die Durchführung der Allgemeinanästhesien
bei den Pferden.
Ein Dank an Dr. K. Rohn für die Unterstützung bei dem statistischen Teil dieser
Arbeit.
230

Danksagung
Ein goßes Dankeschön geht an die Mitdoktoranden in der Pferdeklinik! Vielen Dank
für die gemeinsame tolle Zeit und die vielen schönen und lustigen Momente!
Ein besonderer Dank geht an Anna, Bella, Johanna, Kati und Franzi die die
Doktorarbeitsphase zu einer wunderbaren Zeit in Hannover gemacht haben! Vielen
Dank für die vielen entspannenden, lustigen und unvergesslichen Abende die immer
ein optimaler Ausgleich zum Dissertationsstress waren!
Mein größter Dank gilt meiner Familie! Ohne Euch hätte ich diese Arbeit nicht
geschrieben. Ihr habt mich auf meinem Weg immer bedingungslos unterstützt und
zuversichtliche Worte gefunden. Vielen Dank für dieses schöne Zuhause, wo man
jeden Tag merkt, welche Dinge im Leben wirklich wichtig sind!
Christian, Danke das du an meiner Seite bist! Vielen Dank für die fortwährende
Unterstützung und die scheinbar nicht endende Geduld und Zuversicht während
dieser Zeit!
231