TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

ERGEBNISSE
5.1.4 Pgp-Funktionalität in hCMEC/D3-Zellen: Transport-Assays
Der Transport-Assay, der mit Hilfe des Transwell-Systems durchgeführt wird,
dient der Erkennung von Substraten von Multidrug-Transportern. Zunächst wurden
die Transportversuche nach dem in der Arbeitsgruppe etablierten Protokoll
durchgeführt; d.h. die sensitivere Konzentrationsgleichgewichtsmethode (CETA)
wurde der bidirektionalen Methode vorgezogen. Um zu klären, ob die
Versuchsbedingungen oder auch die Kultivierung der Zellen einen Einfluss auf den
Nachweis eines Transports haben, wurden verschiedene Aspekte wie zum Beispiel
die Dichtigkeit der Zellmembranen untersucht bzw. verändert. Zu diesem Zweck
wurden TEER-Werte bestimmt und die Mannitol-Permeabilität der Zellmembranen
untersucht.
Ausgehend von der Hypothese, dass in einem dichten Zellmonolayer mit
aktivem Pgp ein asymmetrischer Transport (von basolateral nach apikal) eines Pgp-
Transports nachgewiesen und dieser durch einen Pgp-Inhibitor gehemmt werden
kann, wurden die bekannten Pgp-Substrate Digoxin, Verapamil und Rhodamin 123 in
den humanen Zellen getestet.
5.1.4.1 Untersuchungen der Integrität der Zellen
Das Ausmaß der Dichtigkeit des Zellmonolayers und der Tight junctions wird
zum einen durch den TEER-Wert, zum anderen durch die parazelluläre Permeabilität
polarer Substanzen wie Mannitol bestimmt. Die Widerstand der BHS in vivo zeigt
Werte bis zu 2000 Ω*cm 2 (LATERRA & GOLDSTEIN 2000). In In-vitro-
Untersuchungen mit humanen Hirnkapillarendothelien wurden in Abhängigkeit der
Präparation Werte zwischen 20 und 1400 Ω*cm 2 beschrieben (GRANT et al. 1998).
Des Weiteren wurden beispielsweise in Monolayern von Nierenepithelzellen (LLC-
Zellen), die regelmäßig für Transportstudien eingesetzt werden (POLLI et al. 2001;
GARBERG et al. 2005; BALTES et al. 2007a & 2007b; LUNA-TORTÓS et al. 2008,
2009 & 2010; KUTEYKIN-TEPLYAKOV et al. 2010; ZHANG et al. 2010), im 6Well-
Format i.d.R. TEER-Werte von durchschnittlich 800 Ω*cm 2 für LLC-Wildtypzellen
gemessen. Die Mannitol-Permeabilitäten lagen für diese Zellen in einem Bereich von
ca. 4-6 nm/s (LÖSCHER et al. 2011). Um einen Eindruck der Dichtigkeit der
hCMEC/D3-Zellen zu bekommen, wurden in einer Verlaufsuntersuchung über einen
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